專利名稱：一種制備種系嵌合動物的方法
專利說明一種制備種系嵌合動物的方法 本發明涉及一種制備嵌合動物的方法，其中的生殖細胞通過使用遺傳上不能形成生殖細胞和全能細胞的早期胚胎(通常的，一個胚泡)而形成，本發明還涉及一種通過該方法獲得的嵌合動物個體，其中生殖細胞衍生自全能細胞。此處所用的全能細胞是能夠分化為生殖細胞的多能細胞。此外，本發明涉及獲自嵌合動物的一種雜合動物和一種純合動物。隨著發育工程技術的發展，胚胎干細胞(ES細胞)返還入胚胎引起個體發生的技術(Evans MJ & Kaufman MK，Nature 292，154-156(1981))和ES細胞中同源重組技術(Zijlstra M等人，Nature342，435-438(1989)；Thompson S等人，Cell 56，313-321(1989))已經被建立起來。這些技術通過使用小鼠而得以第一次結合，從而建立起制備改變基因的小鼠技術，如敲除(knockout)小鼠。如此全部的技術使通過哺乳動物進行突變體的制備以及之后進行基因功能研究成為可能，這本來只能通過使用酵母或果蠅完成。在后基因組時代，其作為基因功能分析所必須的重要技術，吸引著人們的注意。
關于有效地制備基因被改變了的動物，如敲除小鼠，主要有三點。第一點涉及優良的ES細胞的構建。第二點涉及ES細胞中有效的基因改變。第三點涉及基因被改變的ES細胞形成嵌合小鼠并且在所獲得的嵌合小鼠ES細胞中實施的基因改變被傳遞給生殖細胞從而得以傳給下一代。
在迄今被發展的技術中，第一點，構建優良ES細胞，主要取決于小鼠品系。除了構建概率低外，當重復傳代培養時，被成功構建的ES細胞會丟失它們的被轉移到種系的能力，所以，而建立起來的ES細胞通常在沒有被盡可能多的重復傳代培養下使用。當使用近親交配小鼠的ES細胞時，這種傾向尤其重要。
關于第二點，同源重組技術和相關技術被不斷得到改進，并且在實際應用階段，這些技術在不斷地被加以利用。
第三點涉及很多問題。尤其是，很多研究者都有痛苦的經歷，如獲知嵌合小鼠能夠被制備，但是它們并不顯示種系傳遞。在敲除小鼠制備中，第三點代表了一種主要障礙。因此，目前使用的實際方法涉及獲得和使用被證實轉移到種系且以盡可能少的量傳代培養的ES細胞。
同時，ES細胞被認為在所有構成孕體的細胞譜系中具有獲得正常發育的能力，但是與個體發生過程中被注射ES細胞的胚胎(通常，一個胚泡)相比，其作用于體腔外(exocelomic)的細胞譜系如胎盤的細胞譜系的能力較低(Beddington R S & Robertson E J，Development 105，733-737(1989)；Nagy A等人，Development 110，815-821(1990))。因此，一項旨在獲得所有組織包括生殖組織在內衍生自ES細胞的小鼠的技術涉及將ES細胞同發育和分化方向主要偏向體腔外(exocelomic)胎盤的胚胎結合，從而引導ES細胞朝著胚胎的方向發育和分化。在這種情況下，小鼠ES細胞和小鼠四倍體胚胎的結合被認為是最適當的結合。明確地講，單個四倍體胚胎很少在胚胎移植后獨自發育，幾乎沒有胚胎達到第二個三月期(Kaufman MH& Webb S，Development 110，1121-1132(1990))。有報道認為，在嵌合體產生自四倍體胚胎和正常胚胎(二倍體)情況下，四倍體細胞幾乎從不對胚胎自身有所貢獻。但是，它在很大程度上有助于體腔外(exocelomic)膜組織(Tarkowski A K，J.Embryol.Exp.Morph.41，47-64(1977))。因此，一個被建議的方法涉及將小鼠ES細胞和小鼠四倍體胚胎結合，從而使他們彼此補充以產生聯合嵌合體。這種情況下，據報導可以產生極性嵌合體，其中胎兒衍生自ES細胞。但是，大部分體腔外(exocelomic)組織衍生自四倍體細胞(Nagy A等人，Development 110，815-821(1990))。然而，通過該技術從近親交配小鼠的ES細胞成功獲得嵌合個體的例子極其少見。甚至在成功獲得那些嵌合個體的情況下，由于發育失調比如呼吸紊亂或畸形，嵌合小鼠也不能夠長時間存活(Eggan K等人，PNAS 98，6209-6214(2001))。因此，使用這種方法作為產生種系嵌合體的實用方法是困難的。
因此，迫切渴望發展能夠產生基因被改變的嵌合個體，并有效地產生下一代個體的技術，并且在如此獲得的嵌合個體中，來自ES細胞的基因改變能夠被轉移到生殖系。考慮到上述情況，我們集中研究了種系嵌合體的制備方法。具體地講，要完成的目標或者說本發明的目的在于使用全能細胞，例如基因改變的ES細胞，有效地制備基因被改變的動物，例如敲除小鼠，尤其是，構建一種有效制備種系嵌合小鼠的方法。明確地說，在基因被改變的小鼠的制備中，例如敲除小鼠，研究人員遇到的一個問題是使用基因被改變的ES細胞能夠產生嵌合小鼠，而基因被改變的ES細胞不能夠被遺傳到所獲得的嵌合小鼠的生殖系，以至于基因改變不能夠被轉移到下一代。因此，人們渴望得到在其后代中能夠獲得基因改變的嵌合小鼠，并且這一問題必須得到解決。本發明解決了那些被改變的基因無法遺傳至下一代的問題。
因此，我們構思出使用不能形成生殖細胞和全能細胞的早期胚胎來制備一種衍生自全能細胞的種系嵌合動物的方法。從而，我們完成了本發明。用于此處的全能細胞的例子包括能夠分化為生殖細胞的多能細胞，明確地，干細胞，例如ES細胞和EG細胞，原始生殖細胞，內細胞團，以及重建胚胎，例如核移值胚胎。
本發明的目的是提供一種通過將全能細胞例如ES細胞導入不能形成生殖細胞的早期胚胎從而制備衍生自全能細胞的種系嵌合動物的方法，以及提供一種動物，其中對ES細胞或類似細胞實施的基因改變被遺傳至下一代。
因此，我們研究了一種使用全能細胞例如ES細胞(胚胎干細胞)有效制備種系嵌合小鼠的方法以完成上面所述目的的方法。
本發明中的種系嵌合體意味著嵌合動物的生殖細胞衍生自被導入的全能細胞。一般的，使用ES細胞制備的種系嵌合小鼠是否就是種系嵌合小鼠在下列步驟之前還不能確定在產生ES細胞的品系和具有不同毛色的品系之間產生嵌合小鼠；通過將得到的嵌合小鼠與產生ES細胞的品系雜交，或者與具有不同毛色的小鼠種系雜交，獲得幼崽以確定產生ES細胞的品系的毛色。尤其是在雄性動物的情況下，即使生殖細胞形成自ES細胞，當ES細胞對生殖細胞的貢獻率低的時候，要獲得具有ES細胞基因的幼崽是困難的。此外，當衍生自ES細胞的精子細胞數量低或精子活力低時，不能完成受精，則不能獲得幼崽。此外，當基因改變是對線粒體實施的，由于線粒體衍生自卵母細胞，雌性ES細胞一定被用于產生雌性種系嵌合小鼠。
如果能夠獲得在睪丸或者卵巢內僅僅具有衍生自ES細胞的生殖細胞的嵌合小鼠，幼崽肯定能夠具有衍生自ES細胞的染色體，所以種系嵌合小鼠就能夠被有效地產生。即使當雄性嵌合小鼠被獲得，而獲得的嵌合小鼠的精子細胞數量低，或者精子活力低，通過例如胞質內精子注射(ICSI)的技術，幼崽也能夠容易的被獲得。
在雌性嵌合小鼠的情況下，幼崽能夠通過自然交配、人工授精，體外受精，或者胞質內精子注射獲得。
本發明在上述研究基礎上完成，并且涉及制備種系嵌合動物的方法。此外，本發明涉及通過這一方法獲得的嵌合動物以及從該嵌合動物獲得的基因被改變的動物。明確的說，本發明包括一種使用遺傳上不能形成生殖細胞和全能細胞的早期胚胎(通常的，一個胚泡)制備嵌合動物的方法，其中生殖細胞衍生自全能細胞，以及包括一種通過該方法獲得的種系嵌合動物。在本發明中，通過使用遺傳因子來產生遺傳上不能形成生殖細胞的早期胚胎，從而使種間F1代雜種缺少生殖細胞。在這些細胞中(也就是，雌性生殖細胞或雄性生殖細胞)，其生殖細胞缺陷發育的不同取決于動物種類。例如，在小鼠中，雄性生殖細胞將是缺陷的。明確的說，通過C57BL/6實驗小鼠和與C57BL/6異源的Mus spretus彼此雜交或體外受精獲得的雜合體胚胎會導致雄性不育(Matsuda Y等人，PNAS 88，4850-4854(1991))。此外，c-kit突變小鼠的胚胎，例如，通過Wv/+老鼠和W/+老鼠(Wv/W或W/Wv)彼此雜交或者體外受精獲得的胚胎不能形成雄性和雌性生殖細胞(不育的/不育性)。因此，通過這些遺傳因子的使用，能夠產生缺少雌性或雄性生殖細胞的小鼠(Kussell ES，AdvGenet 20，357-459(1979))。尤其是，當使用Wv/W或W/Wv胚胎時，雌性種系嵌合體能夠通過雌性ES細胞產生。此外，它們能夠作為核移植胚胎或轉基因胚胎而得以產生。
由于所有通過本發明產生的嵌合動物生殖細胞衍生自ES細胞，對雄性嵌合動物進行雜交、人工授精、體外受精，或胞質內精子注射，所以能夠獲得具有ES細胞的一對染色體中的一條的雄性和雌性雜合體。通過將如此獲得的雄性或雌性雜合體雜交，能夠容易地獲得純合體。
此外，具有ES細胞的一對染色體中的一條的雄性和雌性雜合體能夠通過使用雌性嵌合動物進行雜交、人工授精，體外受精或胞質內精子注射而獲得，其中雌性嵌合動物產生自受到雌性基因改變影響的ES細胞。本發明提供下面描述的方法和通過那種方法產生的嵌合動物。
(1)一種制備種系嵌合動物的方法，其中生殖細胞衍生自全能細胞，在該方法中使用不能形成生殖細胞和全能細胞的早期胚胎。
(2)上述(1)中的制備方法，其中不能形成生殖細胞的早期胚胎是胚胎、核移植胚胎或通過種間雜交獲得的轉基因胚胎。
(3)上述(1)或(2)的制備方法，其中全能細胞是胚胎干細胞(ES細胞)或胚胎生殖細胞(EG細胞)。
(4)上述(1)或(2)的制備方法，其中全能細胞是核移植胚胎或胚胎干細胞(ES細胞)或衍生自核移植胚胎的胚胎生殖細胞(EG細胞)。
(5)上述(1)到(4)任一制備方法，其中動物是小鼠。
(6)上述(5)的制備方法，其中不能形成生殖細胞的早期胚胎是通過實驗小鼠(Mus musculus domesticus)和與之是同屬異種關系的Mus spretus小鼠相互雜交或體外受精獲得的。
(7)上述(1)到(5)任一制備方法，其中不能形成生殖細胞的早期胚胎是通過c-kit突變產生的胚胎。
(8)一種嵌合動物，能夠通過上述(1)到(7)任一制備方法制備，其中生殖細胞衍生自被導入的全能細胞。
(9)一種雄性嵌合動物，其能夠通過上述(1)到(7)任一制備方法制備，并且其中生殖細胞衍生自被導入的全能細胞。
(10)一種雌性嵌合動物，其能夠通過上述(1)到(7)任一制備方法制備，并且其中生殖細胞衍生自被導入的全能細胞。
(11)上述(8)-(10)任一種嵌合動物，其中動物是小鼠。
(12)一種制備雜合動物的方法，其中一個染色體對中的一條染色體衍生自全能細胞，包括將所希望的雌性動物品系與雄性嵌合動物雜交，其中該雄性嵌合動物的生殖細胞衍生自被導入的全能細胞，或者通過體外受精或胞質內精子注射，用從雄性嵌合動物獲得的精子細胞使所希望品系的卵母細胞受精，以獲得胚胎；以及將如此獲得的胚胎移植入受體動物從而導致個體的發生。
(13)一種制備雜合動物的方法，其中一個染色體對中的一條染色體衍生自全能細胞，包括將所希望的雄性動物品系與雌性嵌合動物雜交，其中該雌性嵌合動物的生殖細胞衍生自被導入的全能細胞，或者通過體外受精或胞質內精子注射，用所希望品系的精于細胞使獲自雌性嵌合動物的卵母細胞受精，以獲得胚胎；以及將如此獲得的胚胎移植入受體動物從而導致個體的發生。
(14)一種制備純合動物的方法，其中純合動物通過進行雜交、人工授精、體外受精，或胞質內精子注射，使用從上述(9)和(10)獲得的雄性和雌性嵌合動物而制備。
(15)上述(12)-(14)任一種制備方法，其中動物是小鼠。
(16)一種雜合動物，通過上述(12)-(14)任一種制備方法制備，其中染色體對中的一條染色體衍生自全能細胞。
(17)一種純合動物，通過上述(12)-(14)任一種制備方法制備，以及通過雄性雜合動物與雌性雜合動物雜交而獲得，該雜合動物中染色體對中的一條染色體衍生自全能細胞。
(18)上述(16)或(17)的動物，其中動物是小鼠。本發明的嵌合動物通過向遺傳上不能形成生殖細胞的早期胚胎注射全能細胞，比如ES細胞，而得以制備。所有獲得的嵌合動物的生殖細胞衍生自被注入的全能細胞，比如使用ES細胞時的ES細胞。在下面的例子中，ES細胞被作為全能細胞的例子加以闡述。但是，用于此處的全能細胞并不限于ES細胞。所有獲得的嵌合動物的精子細胞或卵母細胞衍生自ES細胞。此外，衍生自ES細胞的染色體總是會傳遞給幼仔，并且染色體對中的一條是來自ES細胞基因的雜合子。
不能形成生殖細胞的早期胚胎，如胚胎，能夠利用由于遺傳因子導致的生殖細胞低常增生而得到。為此，建議兩類方法。具體的，由于種間F1代雜種雄性小鼠顯示不育，來自種間雜交的胚胎通過用實驗小鼠(Mus musculus domesticus)和與之是同屬異種關系的小鼠自然交配而獲得。同時，優選的是從具有出色增殖能力的雌性實驗小鼠中獲得卵母細胞。具體地講，優選的是通過用雌性實驗小鼠(Mus musculus domesticus)和與它是同屬異種關系的雄性小鼠自然交配而獲得種間雜交的胚胎。尤其是，更多的胚胎能夠通過對3-4周大的年輕實驗雌性小鼠經受激素處理以誘導超數排卵，然后通過雜交而獲得。
此外，其通過在從超數排卵誘導的年輕雌性實驗小鼠中收集來的卵母細胞和異種小鼠的精子細胞之間進行體外受精可以有效地獲得大量種間雜種胚胎。C57BL/6小鼠等能夠用作實驗小鼠。
同時，Mus spretus，Mus caroli，Mus pahari，等能夠被用作用于進行雜交的異種小鼠。由于收集到相對大量的體外受精方面的信息，特別優選Mus spretus。特別優選C57BL/6雌性小鼠與Musspretus雄性小鼠的結合，因為種間雜交胚胎能夠從該結合中穩定的獲得。
此外，作為第二種方法，c-kit突變小鼠(Wv/W或W/Wv)的胚胎，例如，利用發生生殖細胞的低常增生這一事實，通過Wv/+和W/+小鼠彼此雜交或體外受精能夠制備此種胚胎。尤其是當使用Wv/W或W/Wv胚胎時，雌性種系嵌合體能夠通過使用雌性ES細胞而產生。
所有如此獲得的胚胎都是遺傳上不能形成生殖細胞的胚胎。結果是，在通過ES細胞注射胚胎而獲得的嵌合小鼠生殖細胞中，所有形成的精子細胞或卵母細胞均衍生自ES細胞。
如此獲得的雄性嵌合小鼠的精子細胞(生殖細胞)衍生自ES細胞，并且通過實驗雌性小鼠與嵌合小鼠雜交獲得的幼崽是具有ES細胞的一對染色體中的一條染色體的雜合動物。如此獲得的嵌合小鼠是衍生自ES細胞的種系嵌合小鼠。此外，當獲得的嵌合小鼠精子細胞的數量低或者精子活力低時，受精不能通過自然交配完成。但是，即使是這種情況，也能夠通過收集精子細胞并使用例如胞質內精子注射(ICSI)的技術獲得幼崽。另一方面，當使用Wv/W胚胎時，雌性種系嵌合動物能夠通過使用雌性ES細胞而獲得。當產生的基因被改變的動物，其中發生的是線粒體或類似的基因改變時，使用這種胚胎是有利的。
如上所述，根據本發明能夠有效地制備種系嵌合動物。應用本發明，可以預測基因被改變的小鼠，比如敲除小鼠，能夠從幾乎從未成功過的近親交配小鼠衍生出的ES細胞中產生。此外，基因被改變的小鼠也可以從ES細胞獲得，而從該ES細胞中還從未獲得過種系嵌合動物。除了ES細胞，如果細胞是全能細胞，應用于本發明也是可能的。
盡管在上述說明中使用的是小鼠；但是，該操作能夠應用于所有哺乳動物。例如，就家養動物而言，有效的種系嵌合動物是通過制核移植備體細胞或基因被改變的體細胞的克隆胚胎，然后應用本發明的方法制備的。此外，本發明的方法也能夠應用于實驗動物比如鳥、爬行動物、兩棲動物和魚類。在那些例子中，非整倍染色體的胚胎能夠被用作不育胚胎。本發明的方法也能夠用于野生動物。
此外，雄性和雌性雜合動物，能夠從本發明獲得的嵌合動物的下一代幼崽中獲得，其中，雜合動物的一對染色體中的一條染色體來自ES細胞，且嵌合動物中的所有生殖細胞衍生自ES細胞。此外，純合動物(純合型基因被改變的動物)能夠通過雄性雜合動物與如此獲得的雌性雜合動物雜交而產生。本發明將通過所涉及的實施例作進一步的具體描述。但是，這些例子僅僅用于提供一些例證，本發明并不限于這些例子。
實施例1制備用于嵌合體制備的胚胎(1)不能形成雄性生殖細胞的胚胎的獲得給具有Mus spretus型線粒體的3.5周大的C57BL/6雌性小鼠(B6-mtSPEC57BL/6小鼠，其中通過回交，胞質線粒體被野生型衍生的近親交配Mus spretus小鼠的線粒體所替代)的腹腔施用每只小鼠5IU/0.05ml/的受孕母馬的血清促性腺激素(PMSG)。48小時后，給每只小鼠施用5IU/0.05ml的人絨毛膜促性腺激素(hCG)，以便進行超數排卵誘導處理。接下來，受到超數排卵誘導處理的雌性小鼠與性成熟(6周大或更大)的雄性野生型衍生的近親交配Musspretus小鼠自然交配，通過允許他們生活在一起而實現。在確定交配后第3.5天，取出雌性小鼠的子宮。用M2培養液(94.7mM NaCl，4.78mM KCl，1.71mM CaCl2，1.19mM KH2PO4，1.19mM MgSO4，4.00mMNaHCO3，21.0mM HEPES，23.3mM乳酸鈉，0.33mM丙酮酸鈉，1g/L葡萄糖，4g/L BSA，100IU/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素)灌注該子宮，從而收集胚胎。用同樣的培養液洗滌該胚胎，從而制備同屬異種的胚胎(胚泡期胚胎)。
同時，當同屬異種的胚胎通過體外受精制備時，根據上述方法(施用hCG后16小時)進行超數排卵誘導處理的C57BL/6雌性小鼠被實施脊椎錯位無痛致死術。從小鼠中取出輸卵管，然后與用礦物油覆蓋的mTYH培養液(199.37mM NaCl，4.78mM KCl，1.71mM CaCl2，1.19mMKH2CO3，1.19mM MgSO4，25.07mM NaHCO3，1.00mM丙酮酸鈉，4g/L BSA，100IU/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素)的礦物油滴部分接觸。接下來，用兩個27G注射針在立體顯微鏡下將輸卵管搗碎，然后包含有卵母細胞的堆積細胞組被導入mTYH培養液滴中。此外，細胞組應被小心地導入，以防止輸卵管進入培養液從而防止造成血液和組織污染。通過給每個雄性Mus spretus小鼠實施脊椎錯位無痛致死術，取出附睪尾，用Kimwipe擦去附在附睪尾上的血液，當用手指撐住管道時，用23G注射針做一個切口，然后，用注射針從管道中敲碎精子塊，從而準備出要預培養的精子細胞。然后精子細胞被導入0.3ml的用礦物油覆蓋的mTYH培養液(液體)或mTYH培養基(199.37mM NaCl，4.78mM KCl，1.71mM CaCl2，1.19mM KH2PO4，1.19mMMgSO4，25.07mM NaHCO3，1.00mM丙酮酸鈉，1g/L葡萄糖，4g/L BSA，100IU/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素)，接著在CO2培養箱中培養2-8個小時。如此預培養的精子細胞以1至5×105精子細胞/ml的精子終濃度向含有預先準備的卵母細胞的受精培養液(mTYH培養液)中受精。經過受精作用的卵母細胞被培養在CO2培養箱中培養8-10個小時。接下來，用補加了0.1mL的EDTA的M16培養液(94.59mMNaCl，4.78mM KCl，1.71mM CaCl2，1.19mM KH2PO4，1.19mM MgSO4，25.07mM NaHCO3，23.28mM乳酸鈉，0.33mM丙酮酸鈉，1g/L葡萄糖，4g/L BSA，100IU/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素)洗滌卵母細胞進行發育。然后，轉入同樣的培養液中。在立體顯微鏡下確定受精卵之后，卵被培養在CO2培養箱中96個小時，從而制備出胚泡期胚胎。
(2)不能形成雄性和雌性生殖細胞的胚胎的獲得使用具有參與生殖細胞形成的c-kit突變的雄性或雌性W品系雜合小鼠實施雜交或體外受精，然后根據(1)中所描述方法制備Wv/W或W/Wv雜合體的胚胎，從而制備出胚泡期胚胎。
實施例2嵌合小鼠的制備根據標準方法，近親交配C57BL/6衍生的ES細胞(Mus musculusdomesticus型線粒體DNA)被注射入胚泡期胚胎中(Mus spretus型線粒體DNA)，該胚泡期胚胎通過將具有如實施例1所描述的野生型衍生的近親交配Mus spretus精子細胞與具有Mus spretus型線粒體DNA的近親交配雌性C57BL/6小鼠(B6-mtSPE)的卵母細胞進行體外受精而制備。使用了48個胚泡期胚胎。一個胚胎中注入5個ES細胞，從而獲得48個被注射的胚胎。在3個6周大白子受體雌性CD-1小鼠與8周大的結扎輸精管的雄性小鼠雜交之后的第二天，將16個受到注射的胚胎移植到該受體雌性CD-1小鼠的子宮中，由此獲得3個嵌合幼崽。
實施例3嵌合小鼠種系譜系實施例2獲得的雄性嵌合小鼠生長到它們性成熟。根據皮毛的顏色(低度鑲嵌性、中度低度鑲嵌性、黑色)，篩選出三種類型的小鼠，然后從附睪尾收集精子細胞。通過對如此獲得的精子線粒體DNA進行PCR分析來確定生殖細胞譜系。當精子細胞衍生自ES細胞，Musmusculus domesticus型線粒體DNA能被檢測到；而當衍生自受精卵，Mus spretus型線粒體能被檢測到。嵌套式PCR方法分析的結果(Kaneda H等人，PNAS 92，4542-4546(1995))顯示，所有獲自這些小鼠的精子細胞衍生自ES細胞。此外，在通過C57BL/6小鼠(B6-mtSPE)的卵母細胞和Mus spretus精子細胞體外受精得到的種間F1代雄性小鼠雜種中，沒有精子細胞可以被確認，并且沒有幼崽可以通過與C57BL/6小鼠雜交而獲得。因此，可以肯定種間F1代雄性小鼠雜種不能夠形成生殖細胞。根據本發明獲得的嵌合動物所產生的生殖細胞衍生自被注射的ES細胞。因此，通過嵌合動物與所希望的品系雜交，或者通過獲自嵌合動物的精子細胞與所希望品系的卵母細胞體外受精，然后移植所獲得的受精卵至受體動物以獲得幼崽的方法來得到雄性和雌性雜合動物，其中一對染色體中的一條染色體衍生自ES細胞。純合動物能夠通過將如此獲得的雌性雜合動物與雄性雜合動物雜交而產生。一般的，能夠使用預先通過同源重組或類似方法產生的所希望的基因改變的ES細胞，作為這里所使用的ES細胞。因此，基因被改變的雜合動物能夠很容易獲得。此外，當使用c-kit突變小鼠胚胎時，比如通過用Wv/+小鼠和W/+小鼠彼此雜交或者體外受精而獲得的Wv/W或W/Wv胚胎被使用時，是不可能既形成雄性又形成雌性生殖細胞的。因此，不管ES細胞是雄性還是雌性，被注射的ES細胞貢獻于所有獲得的嵌合小鼠的生殖細胞，因此，種系嵌合動物能夠用雌性或雄性ES細胞制備(這里使用的ES細胞不限于雄性ES細胞)。
此外，根據本發明制備的所有嵌合動物生殖細胞衍生自ES細胞。因此，具有ES細胞一對染色體中的一條染色體的雄性和雌性雜合體能夠通過與雄性嵌合動物雜交或者用同樣的個體體外受精而產生。如此獲得的雄性和雌性雜合體能夠彼此雜交從而能夠輕易的獲得純合體，所以它們對于基因功能分析非常有用。此外，具有ES細胞一對染色體中的一條染色體的雄性和雌性雜合體能夠通過應用由改變基因的雌性ES細胞所產生的雌性嵌合動物雜交或者進行人工授精而獲得。純合體能夠很容易地通過將如此獲得的雌性雜合體與雄性雜合體進行類似的雜交而獲得。此外，認為純合體能夠也通過雌性嵌合動物與雄性嵌合動物雜交而獲得。通過上述方法獲得的基因被改變的動物在基因功能分析方面非常有用。
如上所描述，方便地實施這些操作已經成為可能，從而使有效地生產種系嵌合動物成為可能，而這種生產常規上是低效的。
權利要求
1.一種制備種系嵌合動物的方法，其中生殖細胞衍生自全能細胞，該方法使用不能形成生殖細胞和全能細胞的早期胚胎。
2.權利要求1的制備方法，其中不能形成生殖細胞的早期胚胎是胚胎、核移植胚胎或通過種間雜交獲得的轉基因胚胎。
3.權利要求1或2的制備方法，其中全能細胞是胚胎干細胞(ES細胞)或胚胎生殖細胞(EG細胞)。
4.權利要求1或2的制備方法，其中全能細胞是核移植胚胎或胚胎干細胞(ES細胞)或衍生自核移植胚胎的胚胎生殖細胞(EG細胞)。
5.權利要求1到4中任一項的制備方法，其中所述動物是小鼠。
6.權利要求5的制備方法，其中所述不能形成生殖細胞的早期胚胎是通過實驗小鼠(Mus musculus domesticus)和與之是同屬異種關系的Mus spretus小鼠相互雜交或體外受精獲得的胚胎。
7.權利要求1到5中任一項的制備方法，其中所述不能形成生殖細胞的早期胚胎是通過c-kit突變產生的胚胎。
8.一種嵌合動物，其能夠通過上述權利要求1到7中任一項的制備方法制備，其中生殖細胞衍生自被導入的全能細胞。
9.一種雄性嵌合動物，其能夠通過上述權利要求1到7中任一項的制備方法制備，其中生殖細胞衍生自被導入的全能細胞。
10.一種雌性嵌合動物，其能夠通過上述權利要求1到7中任一項的制備方法制備，并且其中生殖細胞衍生自被導入的全能細胞。
11.權利要求8到10中任一項的嵌合動物，其中所述動物是小鼠。
12.一種制備雜合動物的方法，其中染色體對中的一條衍生自全能細胞，其包括將所希望的雌性動物品系與雄性嵌合動物雜交，其中所述雄性嵌合動物的生殖細胞衍生自被導入的全能細胞，或者通過體外受精或胞質內精子注射，用從雄性嵌合動物獲得的精子細胞使所希望品系的卵母細胞受精，以獲得胚胎；以及將如此獲得的胚胎移植入受體動物從而導致個體的發生。
13.一種制備雜合動物的方法，其中染色體對中的一條衍生自全能細胞，其包括將所希望的雄性動物品系與雌性嵌合動物雜交，其中該雌性嵌合動物的生殖細胞衍生自被導入的全能細胞，或者通過體外受精或胞質內精子注射，用所希望品系的精子細胞使獲自雌性嵌合動物的卵母細胞受精，以獲得胚胎；以及將如此獲得的胚胎移植入受體動物從而導致個體的發生。
14.一種制備純合動物的方法，其中所述純合動物通過權利要求9和10獲得的雄性和雌性嵌合動物進行雜交、人工授精、體外受精，或胞質內精子注射而獲得。
15.權利要求12到14中任一項的制備方法，其中所述動物是小鼠。
16.一種雜合動物，其通過權利要求12到14中任一項的方法制備，其中染色體對中的一條衍生自全能細胞。
17.一種純合動物，其通過權利要求12到14中任一項的方法制備，以及通過雄性雜合動物與雌性雜合動物雜交而獲得，該雜合動物中染色體對中的一條衍生自全能細胞。
18.權利要求16或17的動物，其中所述動物是小鼠。
全文摘要
本發明提供一種有效制備種系嵌合動物的方法，以及提供一種方便地制備雜合動物和純合動物的方法。具體地，其生殖細胞衍生自被導入的ES細胞的嵌合動物通過向由于遺傳因子而不能形成生殖細胞的早期胚胎(胚泡期胚胎)注射胚胎干細胞(ES細胞)而產生。純合體通過從所得到的嵌合動物而來的雌性雜合體與雄性雜合體雜交而獲得。如此獲得的嵌合動物對于進行基因功能分析或類似分析極其有用。
文檔編號A01K67/027GK1649489SQ0380944
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月27日 優先權日2002年2月27日
發明者長尾恭光, 今井裕, 堀居拓郎, 戶塚義和 申請人:長尾恭光, 今井裕, 堀居拓郎, 戶塚義和