豬3號染色體上與窩產仔數相關的snp位點及其引物的制作方法
【技術領域】
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[0001]本發明涉及與豬產仔數性狀相關的SNP位點，具體涉及豬3號染色體上一個與窩產仔數相關的SNP位點及其引物，屬生物技術領域。
【背景技術】
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[0002]豬的產仔數性狀是豬繁殖性狀的主要組成部分，提高豬產仔數對提高養豬業的總體經濟效益意義重大。我國的太湖豬以高產而聞名，窩產仔數比大多數其它中國地方豬種以及國外豬種的窩產仔數多4-5頭(《中國豬品種志》張仲葛主編，上海科技出版社，1986)。太湖豬中與高產仔數相關的多態位點，能夠作為遺傳標記用于提高母豬的產仔數。
[0003]全基因組重測序方法已廣泛應用于各個物種的相關研究，它能夠快速全面地篩選出與性狀、功能相關的基因或突變位點，彌補了 QTL定位以及候選基因方法費時費力、單一等不足。
[0004]在國內外尚未見本發明中SNP位點與豬窩產仔數相關的公開文獻報道。

【發明內容】

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[0005]本發明的目的是提供豬3號染色體上一個與窩產仔數相關的SNP位點及其引物。
[0006]本發明選擇了二花臉豬(太湖豬的一種)，藏豬，巴馬香豬，萊蕪豬，及滇南小耳豬5個中國地方豬種以及野豬進行了全基因組重測序。6個豬種的重測序個體數分別為11個，11個，9個，10個，10個和10個。重測序數據跟參考基因組(NCBI Build Sscrofa 10.2)進行比對，利用SAMTools軟件進行SNPs位點的提取。發明人比較了二花臉豬與其它5個豬種，在3號染色體上發現一個SNP位點(基因組版本NCBI Build Sscrofa 10.2的Chr3:59537592)與豬的產仔數相關。該位點的等位基因為T和C，有C/C、T/C和T/T三種基因型。
[0007]篩選到該位點后，發明人在白色杜洛克X二花臉豬雜交資源群內代母豬個體中對其進行驗證和相關性分析，結果發現該位點與豬產仔數有顯著相關性。
[0008]本發明的有益效果在于:全基因組重測序方法能夠快速、批量地篩選與性狀相關的SNP位點或基因，基因組版本NCBI Build Sscrofa 10.2的Chr3:59537592這個SNP位點能夠作為遺傳標記用于豬的遺傳育種提高母豬的產仔數。
【附圖說明】
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[0009]圖1為白色杜洛克X二花臉豬F2代母豬資源群中Chr3:59537592位點3種基因型的產仔數比較(圖中兩種基因型產仔數比較時，*表示0.01 ^ P ^ 0.05;林表示P<0.01)。
具體實施方案:
[0010](I) SNP位點的群體分布特征
[0011]本發明選擇二花臉豬(太湖豬的一種)，藏豬，巴馬香豬，萊蕪豬，及滇南小耳豬5個中國地方豬種以及野豬進行了全基因組重測序。6個豬種的重測序個體數分別為11個，11個，9個，10個，10個和10個。重測序數據跟參考基因組(NCBI Build Sscrofa 10.2)進行比對，利用SAMTools軟件進行SNPs位點的提取。發明人比較了二花臉豬與其它5個豬種，在3號染色體上發現一個SNP位點(基因組版本NCBI Build Sscrofa 10.2的Chr3:59537592)與豬的產仔數相關。從重測序的分析結果來看，其它4個中國地方豬種和野豬中該位點等位基因C的頻率平均為84.2%，而在二花臉豬中等位基因T的頻率為100%。
[0012](2)SNP位點的鑒定
[0013]在引物設計網站設計SNAPSHOT引物，包括一對PCR擴增引物(Chr3-1_PCRU: 5 ’ -TTGGTC CTC AGT CAT GTG G-3，；Chr3_卜PCRL:5，-AAC CTC TTC CCT TGA CCT GA-3’)和延伸引物(Chr3-1-SNPU:5’-TGA CTA GTA GGC AGG CAA GAA CAT TCA GAG-3’)。該位點與其它11個位點共24條(12對)引物各取Ιμ?混合為新的多重PCR弓丨物池。首先進行12重PCR反應，反應體系所用試劑為:多重 PCR 引物池(6.25μΜ each)8yl、dNTP(10mM each)8yl、10 X PCRBuffer II 116μ1、MgCl2(25mM Stock)234yl、Fast Start Taq(5U/yl)24μ1和ddH20 460μ1，將以上試劑混合液8.5μ1和1.5μ1 DNA(50ng/yl)混合成IΟμ?體系進行12重PCR擴增反應。擴增反應條件為:94°C 4min；94°C 30s,55°C 30s,72°C Imin，共40個循環。下一步進行PCR反應純化，所需試劑為:Exo I(10U/yl)60yKSAP(lU/yl)130yK10XSAP Buffer 35μ1 和ddH20 125μ1，在每個樣品的PCR產物中加入3.5μ1上述純化混合液離心后按以下程序進行反應:37°C 40min，96°C I Omin。然后進行單堿基延伸反應，所需試劑為:SNAPSHOTMultiplex ready react1n Mix 100μ1、延伸引物池(6.25μΜ each，12條延伸引物各取Ιμ?混合)8μ1、5 X Sequencing Buffer 200μ1 和ddH20 300μ1，將以上試劑混合液6μ1 和4μ1 的純化產物混合成10μ1體系進行延伸反應。延伸反應條件為:96°C 10s,50°C 5s，60°C 30s，共25個循環。接著進行延伸反應產物的純化，所需試劑為:SAP(lU/yl )120μ1、10 X SAP Buffer70μ1和ddH20 140μ1，在每個樣品的延伸反應產物中加入上述3.3μ1純化混合液離心后按以下程序進行反應:37 °C 40min，75°C 20min，4°C保存備用。每個樣品取5_4μ1上述純化后的SNAPSHOT反應產物和5-6μ1的高純甲酰胺(H1-Di Formamide)混合成10μ1體系離心后上樣于ABI3730XL測序儀進行基因分型，使用GeneMarker軟件分析分型結果。
[0014](注:以上4個步驟的反應試劑混合液用量均為100個樣品所需試劑量，從單堿基延伸反應開始，需要避光進行。)
[0015](3)白色杜洛克X 二花臉豬繁殖性能雜交資源群構建
[0016]后續的驗證實驗所用資源群個體樣品及其性狀數據由江西農業大學動物生物技術國家重點實驗室培育基地提供。
[0017]1998年12月，在江西農業大學科研豬場將從江蘇省3個二花臉豬保種場購買的二花臉母豬進行場間血緣的交叉配種。2001年I月根據親本產仔性能，從3頭公豬和11頭母豬的純繁后代中選擇了 17頭二花臉母豬作為資源群體的祖代母本。把Sygen PIC公司惠贈的2頭優質白色杜洛克公豬作為資源家系的祖代父本。將這2頭白色杜洛克和17頭二花臉豬雜交產生的^代個體進行配種，避免全同胞交配，且每頭公豬通常與同一頭母豬配種，以獲得大樣本的內半同胞家系。2003年I月、3月和6月，項目組分別將第I批和第2批&母豬送往江西省宜春市畜牧良種場(59頭)、江西省國營紅星種豬場(52頭)和江西上猶縣四元雜交豬場(118頭)用于母豬繁殖性狀的測定。
[0018](4)SNP位點在雜交資源群F2R母豬群體的基因分型
[0019]按照上述步驟(2)所述的方法，以192個白色杜洛克X二花臉豬雜交資源群F2代母豬個體DNA為模板檢測該SNP位點的基因型。192fF2代資源群個體中有176個個體成功分型，3種基因型C/C，T/C和T/T的個體數分別是60，84和32。
[0020](5) SNP位點對產仔數性狀的調控效應
[0021]在F2代資源群個體中，帶有C/C基因型個體的平均產仔數為10.5507，標準差為
0.7672 ；帶有T/C基因型個體的平均產仔數為11.595，標準差為0.7568 ；帶有T/T基因型個體的平均產仔數為10.9155，標準差為0.8394。
[0022]本發明采用一般線性模型(GLM)分析了SNP位點對豬總產仔數、產活仔數的影響。全部統計分析采用SAS軟件進行。模型如下:
[0023]Yijkim=u+Ai+Gj+Bk+Pi+eijkim
[0024]其中Yijkim為豬總產仔數或產活仔數，u為群體均值，Ai為第i個個體的加性效應，Gj為第j個SNP位點基因型的固定效應，Bk為批次效應(k= 1,2,3,4), Pi為隨機效應(I = I，2，3)0
[0025]分析結果發現Chr3:59537592這個SNP位點跟產仔數有顯著相關性。帶有T/C基因型的F2代母豬的產仔數比帶有C/C基因型的母豬平均多1.04(P = 0.0181)，從圖1看出，帶有C/C基因型的母豬產仔數最低。T為提高豬產仔數的有益等位基因并且T/C雜合豬產仔數最尚O
[0026]從SNP位點與產仔數相關性分析看出，Chr3:59537592這個SNP位點能夠作為分子標記應用于分子標記輔助選擇(MAS)來提高母豬的產仔數。
【主權項】
1.豬3號染色體上一個與產仔數相關的SNP位點在白色杜洛克X 二花臉豬雜交資源群F2代母豬產仔數分子標記輔助選擇中的應用，其特征在于:所述SNP位點的等位基因為T和C，有C/C、T/C和T/T三種基因型，帶有C/C基因型的母豬產仔數最低，T為提高豬產仔數的有益等位基因并且T/C雜合豬產仔數最高。2.—種檢測權利要求1中所述SNP位點的引物在白色杜洛克X 二花臉豬雜交資源群F2R母豬產仔數分子標記輔助選擇中的應用，其特征在于:所述引物的核苷酸序列如下所示:Chr3-1-PCRU:5'-TTG GTC CTC AGT CAT GTG G_3’；Chr3-1-PCRL:5'-AAC CTC TTC CCT TGA CCT GA_3’； Chr3-1-SNPU:5’-TGA CTA GTA GGC AGG CAA GAA CAT TCA GAG-3’，所述SNP位點帶有C/C基因型的母豬產仔數最低，T為提高豬產仔數的有益等位基因并且T/C雜合豬產仔數最高。
【專利摘要】本發明涉及與豬產仔數性狀相關的SNP位點，具體涉及豬3號染色體上一個與窩產仔數相關的SNP位點及其引物，屬生物技術領域。該SNP位點為基因組版本NCBI？Build？Sscrofa？10.2的Chr3:59537592；該位點的等位基因為T和C，有C/C、T/C和T/T三種基因型，擴增該位點的引物及延伸引物為：Chr3-1-PCRU：5’-TTG？GTC？CTC？AGT？CAT？GTG？G-3’；Chr3-1-PCRL：5’-AAC？CTC？TTC？CCT？TGA？CCT？GA-3’；Chr3-1-SNPU：5’-TGA？CTA？GTA？GGC？AGG？CAA？GAA？CAT？TCA？GAG-3’。帶有T/C基因型的豬產仔數高于C/C基因型,T為提高豬產仔數的有益等位基因并且T/C雜合豬產仔數最高。本發明的有益效果在于：全基因組重測序方法能夠快速、批量地篩選與性狀相關的SNP位點或基因，基因組版本NCBI？Build？Sscrofa？10.2的Chr3:59537592這個SNP位點能夠作為遺傳標記用于豬的遺傳育種提高母豬的產仔數。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105603065
【申請號】CN201610003243
【發明人】張亞平, 黃路生, 謝海兵, 任軍, 艾華水, 徐丹
【申請人】中國科學院昆明動物研究所, 江西農業大學
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月4日