生物成像方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于分析體外樣本的方法和計算機程序產品。
[0002] 發明背景
[0003] 在很多環境中實施體外分析，以便識別生物樣本如微生物、細胞和組織培養、細胞 或亞細胞提取物、以及純化的分子。使不同物質的樣本與它們通常的生物背景隔離且提供 可以使它們在其中生長的環境。通常以皮式培養皿的形式提供這種環境，為了使樣本生長 將皮式培養皿放置到培養箱中。皮式培養皿通常包括促進樣本生長的微生物學培養基。理 想情況下，適當培養基上的培育引起許多樣本集落（colony)的生長。通常實施隨后的集落 分析，以識別微生物和評估它們對抗菌劑的敏感性或抗性。
[0004] 例如，樣本分析的重要部分是識別集落中的特定的微生物或細菌的能力。另外，還 可以基于樣本中的微生物的生長和與應用于樣本的任何藥物的相互作用分析利用適當的 藥物對細菌的處理。
[0005] 通過有資格的科學家對皮式培養皿的視覺分析實施許多初步分析。初步的視覺分 析十分有效，但是由于不同的微生物的形狀、顏色、大小和形態的巨大多樣性，易于出現可 能難以解釋的人為誤差和不一致性。然而，目測仍然是目前快速地識別微生物的最好的方 法之一。另外，因為許多生長是"隨機的"，所以模擬微生物生長和找到適合于所說明的上述 多樣性的自動化系統，并非易事。
[0006] 已知的培養箱可以包括窗口，可以通過該窗口觀察樣本，但是通常，將皮式培養皿 取出培養箱，實施視覺上的分析。初步的視覺分析涉及將皮式培養皿拿到光源前面識別集 落。然后，可以根據需要在具體的已識別的集落上實施更詳細的化學和顯微鏡分析方法。
[0007] 在現有技術中已有生物掃描器，也就是，用于掃描或計數細菌菌落的設備。例如， US 2004/0101951和US 2010/0232660都公開了用于掃描生物生長平皿的生物掃描器，它 們具有不同的結構但是同樣都具有生成平皿的圖像和執行這些圖像的分析，以便檢測生 物生長的能力。然而，兩者都利用提供正面照射或背面照射的單一光源。實際上，在US 2004/0101951和US 2010/0232660中都指出了，"某些生物生長平皿可能僅需要正面照射 或背面照射，但是不是需要兩種照射"。這樣的照射是基本的且不能提供足夠好的品質的圖 像以獲得以有效的方式實施初步分析。
[0008] 存在某些現有技術系統，在所述系統中通過不同的顏色或波長的光照射皮式培養 皿中的樣本，以便形成樣本的圖像。通過適當定向的照相機捕捉該圖像。
[0009] FR2926820公開用于檢測生物樣本中的至少一種具體的微生物的方法，所述方法 包括，使培養基經受至少兩種輻射的步驟，每一種輻射呈現特定的波長，以及其他步驟。優 選地，使用兩種照射系統，每一種照射系統發出特定波長的輻射。更具體地，FR2926820的 圖1顯示明顯的頂部照射和紫外線背光照射的組合。然后，將來自兩種不同的照射的后來 的組合圖像用于檢測具體微生物的存在。
[0010] 同樣地，已發表的日本專利申請，JP2010104301，描述用于檢測微生物的方法，該 方法包括顯像步驟，以便獲取微生物在其上進行生長的培養基的圖像和集落檢測步驟，所 述方法也利用頂部照射和背光照射的組合。
[0011] 一旦獲得了生物樣本的圖像，處理技術就可以用于增強圖像。然而，存在許多與增 強生物樣本的圖像相關的問題。這些問題可能涉及下列方面：
[0012] -正在觀察的集落的大小；
[0013]--個集落與另一個集落的接近程度；
[0014]-集落的顏色混合；
[0015] _皮式培養皿的性質；
[0016]-培養基的性質；
[0017] _其他。
[0018] 本發明的第一個問題涉及集落的鄰近集落的確定，以便提供關于集落的檢選過程 的指導。看來，需要確定集落周圍的一個或多個隔離區。
[0019] 另一個問題涉及照射偽影的存在，如鏡面反射，其起因于定向照射源的使用。看 來，存在解決位于生物樣本的圖像中的集落上的照射偽影的問題的另外的需求。
[0020] 考慮位于皮式培養皿的外圍的集落，另外的問題涉及集落的數目的確定。看來，存 在改進生物樣本的圖像中的集落的計數方法的需要。
[0021] 本發明的目標
[0022] 本發明的目標是克服所提及的上述問題中的至少一些問題。

【發明內容】

[0023] 本發明提供如在隨附權利要求中陳述的方法和計算機程序產品。
[0024] 根據本發明的第一方面，提供了用于定義細胞培養皿內感興趣的對象周圍的隔離 區的方法，方法包括下列步驟：
[0025]-利用多個照射源中的一個或多個獲得細胞培養皿的一個或多個圖像，每一個照 射源能夠從不同的方向照射器皿；
[0026]-選擇圖像或圖像的組合，用于進一步處理；
[0027]-應用圓形對象檢測變換，以識別細胞培養皿中的一個或多個是大體上圓形的對 象的感興趣的對象并確定感興趣的對象的中心，其中感興趣的圓形對象代表細胞培養皿中 隔離的集落；
[0028]-應用二值化步驟獲得感興趣的對象和其他對象的二值化圖像，其中二值化圖像 的中心對應于感興趣的對象的中心；
[0029] _重復地形成半徑不斷增加的同心圓，其中同心圓以二值化圖像的中心為中心；
[0030]-識別冠狀物（corona)，其中通過具有連續的半徑值的兩個圓圈劃定冠狀物的界 限；
[0031]-對于每一個冠狀物：
[0032]_確定位于冠狀物中的任何其他對象的存在和位置，從而確定其他對象的存在和 位置；
[0033]-確定定義感興趣的對象周圍沒有其他對象的角扇區（angularsector)的空隙 角（clearanceangle)，從而定義感興趣的對象周圍的隔離區。
[0034]優選地，方法還包括提供對象的檢選模式（picking profile)，其中檢選模式包括 與每一個冠狀物和相應的空隙角相關的值。
[0035] 優選地，方法還包括利用檢選模式聯合用于檢選過程的查找表確定用于與查找表 的具體的標準相關的集落的檢選過程的可用性。
[0036] 提供了計算機程序產品，其包括用于引起可編程的數據處理裝置執行根據本發明 的第一目標的方法的圖像處理步驟，或服務上面提出的數據處理裝置的指令。計算機程序 產品可以包括存儲在機器可讀的存儲介質內的所述指令。
[0037] 根據本發明的第二個方面，提供了用于形成生物樣本的改進的圖像的方法，其中 圖像包括像素，每一個像素具有第一像素值，方法包括下列步驟：
[0038]-利用數目為N的照射源照射生物樣本；
[0039] _獲取每一個不同的照射源下的生物樣本的圖像，以獲得N幅圖像；
[0040] -利用已獲得的N幅圖像確定N個像素值；
[0041]-基于N個像素值確定校正的像素值；
[0042]-對于每一個像素，利用校正的像素值代替第一像素值，以便獲得生物樣本的改進 的圖像。
[0043] 優選地，方法還包括被均勻地布置在生物樣本周圍的照射源，照射源對于生物樣 本具有相同的入射角。
[0044] 優選地，N幅圖像包括與相應的顏色通道相關的N幅彩色圖像或N幅黑白圖像。
[0045] 優選地，校正值是N個像素值的中間值并且計算每一個顏色通道的中間值。
[0046] 提供了計算機程序產品，包括用于引起可編程的數據處理裝置執行根據本發明的 第二目標的方法的圖像處理步驟，或用于服務上面提到的數據處理裝置的指令。計算機程 序產品可以包括存儲在機器可讀的存儲介質內的所述指令。
[0047] 根據本發明的第三方面，提供了用于確定細胞培養皿的圖像中的對象的數目的方 法，其中包括由對象和對象的組組成的元素，方法包括下列步驟：
[0048] _利用照射源的已確定的視圖（view)獲取細胞培養皿和各個元素的圖像；
[0049]-應用二值化步驟獲得圖像的二值化版本，其中二值化圖像包括內部二值化圖像 和外部二值化圖像，其中內部二值化圖像對應于細胞培養皿的內部部分，而外部二值化圖 像對應于細胞培養皿的外部部分；
[0050]-確定每一個元素在二值化圖像中的位置，以便確定組分是位于內部二值化圖像 中還是位于外部二值化圖像中；
[0051]-如果組分位于內部二值化圖像中，則利用相應的第一像素值代替表示內部二值 化圖像中的組分的圖像的像素的像素值，以便獲得第一合成圖像；
[0052]-如果組分位于外部二值化圖像中，則利用相應的第二像素值代替表示外部二值 化圖像中的組分的圖像的像素的像素值，以便獲得第二合成圖像；
[0053] _結合第一合成圖像和第二合成圖像，以便獲得其中合成圖像的像素值取決于像 素與對象邊緣的接近程度的合成圖像；
[0054] _將分割算法應用于合成圖像，以便獲得包括具有可分辨的邊緣的對象的圖像。
[0055] 優選地，二值化步驟包括內部二值化步驟和外部二值化步驟。
[0056] 優選地，外部二值化步驟包括應用形態關閉功能獲得生成圖像，其中確定的視圖 是背光視圖。
[0057] 優選地，將生成圖像從第一顏色空間變換到第二顏色空間，即，如感覺更加均勻的 L、a、b顏色空間。
[0058] 優選地，通過利用元素的像素值確定元素的第一像素值，其中確定的視圖是底部 環形視圖。
[0059] 優選地，通過計算外部二值化圖像的相應像距中的元素的像素值和生成圖像中的 元素的像素值的平均值確定元素的第二像素值。
[0060] 優選地，分割算法是分水嶺算法。
[0061] 提供了計算機程序產品，其包括用于引起可編程的數據處理裝置執行根據本發明 的第三目標的方法的圖像處理步驟，或用于服務上面提到的數據處理裝置的指令。計算機 程序產品可以包括存儲在機器可讀的存儲介質內的所述指令。
【附圖說明】
[0062] 現在，通過實例，對附圖進行參考，其中：
[0063]圖1是根據本發明的一個方面的生物分析系統；
[0064]圖2a、2b和2c是根據本發明的一個方面的、圖1的系統的成像系統的示意圖；[0065]圖3是根據本發明的一個方面的、圖2的系統的簡化圖，顯示應用于樣本的不同類 型的照射；
[0066] 圖4a是根據本發明的一個方面的背光照射源的示意圖；
[0067] 圖4b是與垂直照射相關的漫射器的示意性的前視圖和后視圖表示。
[0068] 圖4c是與環形照射相關的漫射器的示意性的前視圖和后視圖表示；
[0069]圖5是根據本發明的一個方面的樣本抽拉框和相關的近似水平的照射源的示意 圖；
[0070] 圖6是根據本發明的一個方面的環形照射源的示意圖；
[0071] 圖7是根據本發明的一個方面顯示用于不同應用的不同的照射類型的表格；
[0072] 圖8是根據本發明的一個方面顯示用于與不同的圖像處理技術相關的不同的培 養基的不同的