使用電抗和電容型傳感平臺對微生物生長敏感的系統的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種使用電抗和電容型傳感平臺對微生物生長敏感的系統。所述系統包括信號處理電路，該信號處理電路通過兩個或更多個電極連接到耗材或容器，所述電極完全刺入所述容器并與液體內容物接觸。所述電路被配置以檢測樣品的總阻抗的組分，尤其是“異相”或虛擬電抗組分，該組分以頻率依賴的方式對微生物生長具有靈敏響應。基于監測樣品這些述參數的變化，所述系統檢測液體基質中帶電分子的組成以及微生物的數量二者的變化。這使得檢出時間(TTD)減少5-70％。所述系統和方法檢測多種容器形狀、體積和基質(或介質)形式中的微生物。所述電極完全浸入液體樣品的連續主體之中。電極之間的距離可以被調整或調節以滿足容器的需要。電壓輸入也能夠被調整以允許容器內的內容物的恰當檢測。
【專利說明】
使用電抗和電容型傳感平臺對微生物生長敏感的系統
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2014年10月14日申請的美國臨時申請號62/063,602的權利，該申請的 公開內容在此以引用方式被并入本文。
技術領域
[0003] 本實用新型涉及臨床樣品的微生物檢測領域。本實用新型尤其涉及實現對于生物 樣品中細菌存在與否的更快速的檢測。
【背景技術】
[0004] 檢測復制微生物(細菌、真菌、病毒）的能力在很多臨床微生物應用中是一項基本 的要求。在這方面，已經開發了很多用于檢測微生物生長的直接和/或間接方法。
[0005] 例如，間接檢測方法可以評估副產物、分子、復合物或化學反應物對微生物生長/ 復制的影響。即，微生物的生長/復制是否導致副產物、分子、復合物或化學反應物共同和累 積式的增加、減少或顯著的變化。例如，可以通過熒光變化或通過彈性傳感器的比色變化觀 察生長中的微生物群的代謝需求的變化。雖然這類檢測的機制已經眾所周知，但當微生物 濃度達到每瓶約IO 9集落形成單位(CFU)時即超過檢測閾值。這導致許多臨床相關的血液病 原體的檢出時間（TTD)通常在8到24小時的范圍內。在一些情況下，某些微生物的檢測可能 需要超過72小時。
[0006] 此外，用以檢測溶液中活體微生物的電子檢測系統已經被開發。通常，這類平臺利 用阻抗測量作為微生物生長的間接指示符。2013年2月14日提交的并且名稱為"基于阻抗的 細菌檢測系統（Impendence-Based Bacterial Detection System)" 的W02013/123189中描 述了一種這樣的系統，其一般地與本申請相關并且在此通過引用被并入。
[0007] 當微生物進行生長時，通過排出或攝入帶電荷的產物(如離子、磷酸鹽、硫酸鹽、硝 酸鹽)或者產生帶電荷的代謝中間產物(如乳酸)使樣品中的總離子組成發生改變。微生物 的生長影響介質的總電導率(或電阻率）。電導（或電阻）的這種變化通過溶液中隨時間變 化的總電阻抗變化來證明。通過向溶液中浸漬多個電極并測量電壓(如AC或DC)和/或電流 響應來測量阻抗。這些系統通常使用數據模型以使得原始阻抗數據適應理論框架從而提取 與微生物生長相關的信息。
[0008] 例如，一些眾所周知的系統使用充滿特化液體培養基（speciaI ized broth)的 IOml反應室。工業微生物樣品被接種在該反應室中并孵育高達24小時。向管內供應固定頻 率（IOkHz)的輸入波形并監測阻抗。由于響應于微生物隨著時間生長介質的離子組成變化， 介質電導的小變化開始累積。當電導率已增加到特定的閾值之上時，微生物生長的樣品測 試陽性的信號被返回。但是，這類系統有一些主要的技術限制，使得它們的應用的范圍主要 被限制在工業微生物應用。
[0009] 在這方面，電學檢測系統由于其依賴微生物生長形成和積累副產物而造成生長介 質的電導或電阻變化而產生技術限制。隨之而來的是，對于高離子強度的介質，只有在微生 物濃度達到非常高的水平時，由微生物復制產生的任何信號才能被有效標記(mask)。此外， 監測高度復雜的介質（如血液）中微生物生長和檢測的許多應用不能使用標準的基于阻抗 的檢測技術。
[0010]利用阻抗檢測系統針對具有這類問題的已提出的一種解決方案是使用總阻抗的 子集以增加對于測量--其指示微生物生長--的敏感性。Sengupta等人在"A micro- scale multi-frequency reactance measurement technique to detect bacterial growth at low bio-particle concentrations(在低生物粒子濃度下檢測細菌生長的微 尺度多頻電抗測量技術）（Lab Chip，第6卷，第682-692頁，2006)"（以下稱為"Sengupta"）中 使用1〇〇此容積的微流體腔作為監測響應的腔，該響應能夠指示細菌的存在。Sengupta等人 指出通過提供長的（厘米級別)且非常細(小于250微米）的含有樣品的管道狀腔，并且在其 兩端處定位非常小的電極能夠改善與簡單的電介質電導率測量有關的感測響應。通過使用 非常高的頻率(從IOOKHz到IOOMHz )，液體樣品的電容貢獻被測量。根據Sengupta，液體樣品 的電容對于放置在腔中的樣品里的細菌的存在和/或生長引起的變化是敏感的。
[0011]然而，Sengupta指出利用針對使用電介質電導率測量來測試樣品中細菌存在的微 流體環境的方法，最顯著的挑戰是溫度的波動。此外，Sengupta對每個分析時間點獲取并測 量了新的樣品。即，Sengupta在繼續測量前需要填充新的微流體腔(或者用新鮮的樣品替 換微流體腔內的液體樣品）。由于每一份在先的樣品部分被丟棄，所以每小時需要消耗約 100-200yL樣品，因此這一方法被認為是破壞性的。隨著時間消耗掉的樣品的體積將是一個 非常嚴峻的挑戰，尤其是對于生長緩慢或代謝緩慢的微生物的樣品。此外，隨時間獲取樣品 必須關注固有的生物危害廢物處理及滅菌。
[0012] Sengupta中所描述的技術另一缺點在于需要在微升的體積級別進行實驗。這限制 了這一技術在沒有合適的準備或獲取子樣本步驟的情況下感測臨床上相關的樣品的使用。 此外，這一技術利用來自寬頻率范圍（幾百至幾千kHz)的原始光譜數據來通過計算擬合溶 液的"電容"的電路模型。因此，圍繞該數據的處理存在數學上的復雜性，這可能導致每個耗 材的后處理時間長達一分鐘。
[0013]最后，Sengupta并沒有克服所述的阻抗技術對于高離子介質（如血液）固有的不相 容性。相反，Sengputa通過減少檢測腔的總體積限制了總離子數量從而規避了該問題。因 此，即使體積上僅有輕微的超量也會導致檢測敏感性的大幅損失。
[0014]因此，需要對使用電介質測量以檢測液體中微生物存在與否的方法進行改進。 【實用新型內容】
[0015] 本申請描述基于阻抗的方法和系統，其使用總阻抗的子組分，即虛擬（電抗)組分， 以測定介質中的總離子組成。在這方面，電抗子組分對于由于微生物生長（間接檢測）造成 的介質的離子組分變化以及微生物的帶電的細胞量(直接檢測)二者都具有極高的靈敏度。 這為處理微生物的寬且多樣的光譜提供了廣闊的檢測方法。
[0016] 當前申請還描述調節方法，以允許跨度從微升級別到毫升級別范圍的液體體積內 的電抗檢測。在這方面，在一個實施例中，系統的頻率敏感度可以通過調節平行于鎖定放大 檢測器的電容輸入階段的電阻的物理值而從IkHz改變到幾百kHz。這導致了針對離子組成 (操作頻率在l-20kHz之間）和微生物生物量(操作頻率大大高于20kHz)的變化的增加的靈 敏度。
[0017] 根據可替代的實施方式，當前申請描述了通過使用橋式電阻-電容調節電路調節 目標樣品的頻率靈敏度的方法。通過調節橋式電阻-電容調節電路的值，在高頻光譜(遠大 于20kHz)下檢測變得對于離子組分變化和帶電微生物量變化二者均很敏感。因此，橋式電 阻-電容調節電路可以提供更快的檢出時間(TTD)。
[0018] 更進一步地，調節消耗性試驗內的頻率響應允許在相對大的樣品體積（如大于 IOmL)中檢測微生物生長。這消除了現有技術對于恒定地子樣品的需求。由于不再需要每一 次采樣后進行復雜的數學計算，因此通過利用處理原始電抗數據實現附加的益處。將降低 的計算復雜性結合至更窄的頻率范圍的利用允許更快的掃描時間（由秒到分鐘級別變為毫 秒到秒級）。
[0019] 當前申請還描述對于微生物生長具有增加的靈敏度的系統。所述系統包括信號處 理電路，該信號處理電路通過完全穿過測試室并與液體內容物接觸的兩個或更多電極連接 到測試室（即消耗性的）。所述電路被配置用來檢測總阻抗的一組分，尤其是"異相"或虛擬 電抗組分，所述組分以頻率依賴方式對微生物生長具有敏感響應。阻抗中的電抗組分對本 領域技術人員而言是公知的，并且在本文中不詳細描述。在這方面，該系統可以基于監測樣 品中該參數的變化來檢測液體基質中帶電分子的組成以及微生物的數量二者的變化。這使 檢出時間（TTD)減少5%-70%。
[0020] 由本文所述的系統和方法實現的另一優勢是能夠在多種消耗性形狀、體積或者基 質(或介質)形式下檢測微生物。在這方面，電極應應當完全浸漬在連續的液體樣品主體中。 電極間的距離可以被調整或者調節以滿足耗材的需要。更進一步地，輸入電壓也能被調節 以便允許在耗材內對內容物進行適宜的檢測。
[0021] 在這方面，當前系統能夠感測由于微生物細胞壁的高度帶電的特性而將另外被認 為是"臟(dirty)"的樣品中微生物的存在與否以及其在液體基質的離子組分中的各自變 化。即，當前系統可以監測有血液污染的抗微生物敏感性測試情況中微生物的生長以及其 他將以其它方式破壞光學檢測策略的樣品的組分。
[0022] 在一個實施例中，該技術可涉及一種對微生物生長敏感的系統。該系統可以包括 信號處理電路，所述信號處理電路連接到適于接收生物樣品的容器。該系統可以包括兩個 或更多個電極，所述兩個或更多個電極刺入所述容器并且與所述生物樣品接觸，其中所述 電路被配置以測量所述樣品的總阻抗并檢測所述總阻抗的電抗組分。
[0023] 在該技術的一些版本中，該系統可以進一步包括調節元件。在一些情況下，該調節 元件可以是與鎖定放大器的電容級并聯的一個或更多個可變電阻。優選地，在另一些版本 中，調節元件可以是橋式電阻電容調節電路。
[0024] 在該技術的一些版本中，該系統的電路在高頻操作模式和低頻操作模式之間可轉 換，其中高頻在40kHz到80kHz的范圍內，而低頻在IkHz到IOkHz的范圍內。優選地，所述系統 可以進一步包括調節元件。在一些情況下，該調節元件可以是橋式電阻-電容調節電路。
[0025] 在一些版本中，該系統可以進一步包括與所述橋式電阻串聯或與所述橋式電阻并 聯的開關。優選地，在一些情況下，當所述開關打開時，所述系統可以以低頻模式運行，而當 所述開關關閉時，所述系統可以以高頻模式運行。
【附圖說明】
[0026] 圖1圖示說明裝置的示例，其用于測量液體樣品的電介質電容以確定其中是否存 在微生物；
[0027] 圖2圖示說明裝置的另一種實施方式，其用于測量液體樣品的電介質電容以確定 其中是否存在微生物，由此信號發生器的測量頻率被自動調節并保持在零交點頻率。
[0028] 圖3圖示說明裝置的示例，其用于測量液體樣品的電抗以確定其中是否存在微生 物；
[0029]圖4A和圖4B圖示說明用以測量液體樣品的電抗的裝置的框圖；
[0030]圖5圖示說明線形圖，該線形圖示出在不同頻率下檢測大腸桿菌(E.coli)的時間；
[0031]圖6展示實驗結果，該結果表明使用更高的頻率可以改善檢出時間；
[0032I圖7圖示說明線形圖，該線形圖示出在高頻率下洛菲不動桿菌(A. Iwoffii)的檢出 時間；
[0033]圖8圖示說明說明線形圖，該線形圖示出在高頻率下藤黃微球菌(M. Iuteus)的檢 出時間。
【具體實施方式】
[0034] 根據本文描述的示例，使用阻抗子組分測量確定微生物生長存在與否。電極的配 置方式和頻率可以按照本文描述進行配置，以確保即使是測試環境中離子電荷的微小變化 也是可檢測的，以確定微生物生長的存在與否。
[0035] 阻抗是當施加電壓時電路對于電流呈現的電對抗作用的度量。當在交流(AC，f>0) 電路中操作時，阻抗由電阻和電抗組成。相反，在直流(DC，f = 0)電路中，阻抗僅有電阻組 成。因此，阻抗可以以下式表示：
[0036] Z = Zo+j*Zr(f)
[0037] 其中Z =阻抗，Zo =電阻，j = I -I，Zr =電抗，且f =頻率。因此，阻抗是包含兩個子 組分--電阻和電抗--的物質的電學特征。
[0038] 電阻是電流通過電導體(如金屬線、鹽水溶液等）時的對抗作用。電阻是標量值并 且與頻率不相關。因此，電阻與給定樣品中所包含的靜態(非演化)帶電物質（即離子、質子、 氨基酸、肽、小分子等）的總數量呈現逆相關的關系。帶電物質的增加導致更低的電阻，而相 反地，帶電物質的減少導致更高的電阻。在微生物復制(通常稱作微生物生長)期間，帶電顆 粒的總數量將以微生物依賴的方式不斷變化。例如，隨著新細胞分裂，離子從介質中獲得并 且被參入子細胞中。因此，細胞分裂導致帶電物質的數量減少。與此同時，微生物在介質中 對營養物質進行代謝并且產生帶電產物，該帶電產物導致帶電物質的數量的增加。
[0039] 另一方面，電抗是電路元件對于電流或電壓變化產生的對抗作用，這是由于元件 的電感或電容。電抗與電阻類似，不同之處在于電抗對于操作頻率是敏感的。因此，電抗與 給定樣品內所包含的電容性組分的總數量呈現逆相關的關系。在這方面，生物樣品內的電 容通過兩種方式顯現。第一，帶電物質(通常是分子，非微生物細胞等）由于感測電壓(或電 勢）的施加而聚集在電極界面的部位處。這是由于當電壓(如，正或負)被施加到電極時具有 相反極性的帶電分子被吸引到電極以試圖中和表面電極上的電荷。具有相反電荷的另一層 分子在那些分子上產生"涂層效應(coating effect)"，導致在電極界面處幾乎沒有凈電荷 存在。這種涂層效應導致具有中和的電荷的電雙層或雙層電容器(如電介質雙層電容器）， 就像絕緣體。因此，這絕緣體狀的涂層導致電容效應(即絕緣體側壁與導電介質和電極金屬 相連），這被稱作界面電容。
[0040] 當該系統在低頻（小于15kHz)下運行時界面電容(Ci)最大。對于檢測微生物生 長，當由于微生物細胞量以及相關代謝物增加導致介質中離子組分變化時，界面電容隨之 變化。因此，界面電容是微生物生長的間接指示符。
[0041] 對電抗產生影響的另一個生物學因素是細胞的電容。在這方面，人類和非人類細 胞具有帶電的外層細胞膜，隨之是絕緣的膜核，且最后是高離子的內部細胞組分(如離子）。 這與之前討論的界面電容相似，并且被稱為細胞電容或膜電容(Cm)。
[0042] 與阻抗相反，電導率是與細菌代謝副產物（如氣體，如CO2)存在與否相關的測量。 在這方面，之前討論的電容組分（以及那些隨時間的變化的組分)更加直接地反應樣品容器 中微生物(如細菌)的存在與否。
[0043]本文所述的系統和方法檢測通過使用外部頻率調節電路而改變的電抗顯示的界 面電容(Ci)和/或細胞電容(Cm)。這導致了對于微生物生物量的增加以及由微生物相關的 代謝活動而誘發的樣品環境的變化二者均具有高度的檢測敏感性。該外部頻率調節電路與 從微升到超過毫升的體積范圍的多種介質體積是相容的。更進一步地，外部頻率調節電路 允許持續監測而不需要對于正在使用的樣品進行周期性的二次采樣以及更新。
[0044] 圖1是示出用于基于組分的電容阻抗的測量而檢測微生物生長的裝置的詳細圖 示。鎖定放大器被示為具有輸出級210和輸入級235。輸出級210包括內部信號發生器，所述 內部信號發生器可以用于向電介質阻抗測量腔220(未示出）的一個電極211發送正弦的RF 信號。所述腔的第二電極212與所述鎖定放大器的信號輸入級235相連。雖然鎖定放大器在 圖中被示出并且在本文的示例中進行了描述，但是本領域的一個普通技術人員將認識到其 他測量設備，如LCR儀或者網絡分析器，可以代替鎖定放大器而被使用。
[0045] 根據該實施方式，在所述腔220(未示出）內的樣品液體直接接觸兩個電極并且可 以通過虛框225中所示的電路圖進行描述。在這方面，Ci代表金屬電極和液體之間的界面電 容;Ri代表金屬電極和液體之間的界面電阻;Rb是液體的本體電阻;Rm是微生物的膜電阻； 并且Cm是膜電容。
[0046] 假定鎖定放大器的輸出級210的內部信號發生器具有50 Ω的通常內部電阻，并且 鎖定放大器的輸入級235具有15pF的通常電容(Cp)以及10ΜΩ的通常輸入電阻(Rp)。
[0047] 圖1中示出的檢測微生物生長的裝置包括源匹配電阻Rs(215)和測量負載電阻Rv (216)。根據圖1，源匹配電阻215和測量負載電阻216可以根據給定的電介質測量腔和液體 被選定，使得測量信號的異相組分的頻譜示出零交叉特征，該零交叉特征（i)依賴于Cm的 值，并且(ii)在合宜低頻率處被設定。在特定的實施例中，頻率被設定在約IOOkHz的值或該 值以下。這允許使用標準的鎖定放大器。例如，當Rs = 500 Ω且Rv = 500 Ω時，在液體樣品介 質是常規的血液培養生長介質的情況下，產生在約30kHz至約IOOkHz的范圍內的零交叉頻 率。這種血液培養生長介質的一個示例是購自馬里蘭州斯帕克斯的Becton Dickinson Diagnositics的Standard Aerobic/F介質。
[0048] 根據圖1，鎖定放大器的輸出級210的異相信號振幅與異相阻抗值成反比。換言之， 在測量時異相阻抗值(如電抗值)在異相信號振幅的零交叉頻率處處于其最大值。值的注意 的是，改變阻抗檢測腔的尺寸（由于改變樣品體積、樣品的高/寬比或二者），或用另一液體 樣品替換生長介質將很可能改變選定的Rs和Rm值。如圖所示，鎖定放大器輸入級235提供參 考電勢。如所圖示的參考是浮動接地。本領域普通技術人員將意識到，存在輸入級能夠以多 種不同方式提供參考電勢，而圖1的參考僅是示例性說明的并且不是限制的方式。
[0049] 圖2圖示說明用于通過使用測量頻率的自動調節來測量液體樣品的電介質電容和 電抗以測定測試環境的離子電荷變化的裝置的可替代實施方式。在這方面，相敏感信號檢 測器330的異相信號輸出端332與電子積分器340的輸入端335相連。積分器340的輸出端345 與壓控振蕩器310的頻率控制輸入端305相連，所述壓控振蕩器310與圖1中所示的裝置中的 信號發生器作用相同。此外，Ci代表金屬電極和液體之間的界面電容;Ri代表金屬電極和液 體之間的界面電阻;Rb是液體的本體電阻;且Cm是本體電容。此外，本體電容(Cb)可以用于 檢測微生物生長，該本體電容如WO 2013/123189中所述，該申請已經通過引入被并入。
[0050] 在此實施例中，壓控振蕩器（"VC0"）310產生正弦電信號，并且該正弦電信號電偶 合到與樣品接觸的電極311。而且，與樣品接觸的第二電極312電連接到相敏感信號檢測器 330。如前所述，相敏感信號檢測器的異相輸出信號與積分器340偶合。由于積分器340的輸 出端與VCO 310的頻率控制輸入端耦合，所以只有當被相敏感信號檢測器測量到的異相信 號振幅為零時，VCO 310的頻率才被調整。久而久之，在零異相信號振幅處被調節的頻率的 增加表明樣品內微生物生長。
[0051] 在操作中，積分器340輸出電壓影響壓控振蕩器的頻率。例如，如果起初頻率低于 60kHz，那么異相信號振幅是正的。這導致積分器輸出端345處為正輸出電壓，并且相應地導 致壓控振蕩器310的頻率增加。頻率將持續增加直到達到零交叉頻率(此處異相信號振幅為 零）。此時，當異相振幅變為零時，不會再有進一步的積分發生。因此，壓控振蕩器的頻率停 留在零交叉頻率處，根據此實施例該零交叉頻率為60.723kHz。如果起始頻率過高，則實際 的零交叉頻率將從該過高的頻率自動接近。通過記錄隨時間的零交叉頻率可以檢測細菌的 存在并且檢測由微生物生長導致的頻率增加。
[0052]圖2中所示的裝置的優勢在于能夠以極高的精度測定零交叉頻率。由于"零點信 號"在相敏感信號檢測器的輸出端發生，所以信號發生器振幅或者相敏感信號檢測器的內 部增益的任何漂移都將不會影響代表系統輸出信息的自動調節的零交叉頻率。
[0053]轉至圖3,其示出利用橋式電阻器(Rp)-電容器調節電路405測量阻抗的系統400的 實施方式。圖3的系統包括具有內部信號發生器的鎖定放大器的輸出級410,一系列可變的 可調節元件415 (即可變電位計），包含液體樣品的耗材420，橋式電阻-電容調節電路(如串 聯連接的第二可變電位計405以及開關425)，以及鎖定放大器的輸入級435。在所示的實施 例中，當開關開啟時，系統在低頻率下運行，而當開關關閉時，系統在較高頻率下運行。 [0054]如上所述，具有內部信號發生器的鎖定放大器具有50 Ω的通常內部電阻。此外，鎖 定放大器的輸入級435具有15pF的通常電容（Cis)和IOM Ω的通常輸入電阻（Ris)。在這方 面，鎖定放大器可以產生施加至液體樣品的電壓和頻率。進一步地，本領域的普通技術人員 將意識到，在不脫離本文描述的示例的范圍的情況下，諸如LCR儀或者網絡分析器的測量設 備可以被使用。
[0055] 可變橋式可調節元件(Rs)(如可變電位計)405的功能如之前描述的源匹配電阻器 一樣。因此，可變橋式可調節元件(Rs)405可以針對給定的耗材420(如檢測腔)和液體樣品 被調節到一電阻(〇-1〇,〇〇〇Ω)，由此，測量信號的異相組分的頻譜顯示出零交叉特征，該零 交叉特征（i)依賴于Cm的值，并且（ii)被設置在低于IOOkHz的合宜低頻率處。這允許使用標 準的鎖定放大器。
[0056] 耗材420很大程度上依據設計需要選擇。在此描述的實施例中，耗材是在側面具 有兩條間隔約IOmm到約40mm縫隙的塑料瓶或相似的塑料耗材(未示出）。每一縫隙中放置一 金屬電極(如用金電鍍的黃銅圓柱件），并且環氧樹脂(如膠水)涂布在塑料/金屬界面外側 周圍以將電極固定到位。重要的是，環氧樹脂僅在外表面發現且不滲入含有樣品的瓶的內 部區域。即，環氧化合物不接觸樣品。
[0057] 本領域普通技術人員將意識到，該耗材可以是多種幾何形狀的，并具有將樣品無 菌轉移進出所述耗材的適配接口。在這方面，可以基于病人樣本的類型、待測試樣品的體積 等因素使用不同的耗材。
[0058]金屬化電極411、412可以使用任何標準的（如低成本的）金屬(如銅、黃銅、鋼等）制 造，該金屬電極具有帶有施加到其上的抗腐蝕金屬(如鉑、金、銀）的共形涂層（即厚度從亞 納米到微米）。這種抗腐蝕金屬的共形涂層對于高鹽生長/介質基體(如血液、尿液、痰液)的 相容性是必須的。共形涂層技術的示例包括電鍍、濺射和蒸發處理。這些處理方式對于本領 域技術人員是熟知的并且在本文中不再詳細描述。本領域普通技術人員將從常規的共形涂 層技術中選擇以形成本文所述的電極。
[0059] 電極配置可以適用于在耗材（即測試設備）中使用的幾乎任何尺寸、形狀以及材 料。電極(2個或更多個)可以被配置為任何已經被提供了合適尺寸特性來接收電極的耗材 形式。在可替代的實施例中，該耗材可以通過在電極周圍吹塑耗材而形成。在另一些示例 中，電極可以通過耗材的蓋子而延伸進入耗材內。這種設計不再需要直接將電極塑模或粘 合在耗材的材料中。在上述實施例中，電極可以被配置以形成外界和耗材的內容物（即液 體)之間的導電路徑。
[0060] 耗材的示例包括傳統的小瓶、管式配置、微流體盒等。對于本領域技術人員而言合 適的耗材是熟知的，并且在本文中不再詳細描述。
[0061] 用于電極的合適金屬的示例包括但不限于，銀、金、鋅、鐵、鎳、鋁等。更進一步地， 對于電極可以使用不同的金屬涂層。此外，電極間距、導線配置和電極尺寸很大程度上根據 設計需要選擇。電極設計與多種因素相關，該因數如介質、耗材、樣品等。本領域普通技術人 員將意識到，基于本文描述的示例可以使用多種配置。
[0062] 在那些其中電極被放置在耗材內的實施例中的操作中，電極必須被浸入樣品液體 內，使得在電極之間存在導電路徑。換言之，覆蓋一個電極的同一液體主體也必須覆蓋另 一個。更進一步地，瓶子內存在的非生物性對象(如環氧樹脂、樹脂)必須不覆蓋電極達到可 以妨礙電極之間的導電路徑的程度，從而造成高度可變性和不可靠的數據。
[0063] 該系統被配置為接收所述耗材(如圖3中示意性示出的），使得其將被電整合入系 統400。根據一些實施例，可以在耗材中形成非對稱特性，使得使用者能夠僅在一個預定的 取向上將耗材插入設備中。這將保證耗材"模塊"與系統中其他組分之間的合適的相互連 接。
[0064]轉至圖4A和圖4B，示出了用于測量多種耗材中的阻抗的系統400的不同實施方式。 圖4A和圖4B的系統包括鎖定放大器的輸出級410、多路器440、可變系列電阻器415、具有第 一電極411和第二電極412的耗材420、攪拌器450、支架470、可變橋式電阻405、第二多路器 460、鎖定放大器的輸入級435和計算機500。在圖4A中，開關425與可變橋式電阻405串聯。開 關425和橋式電阻405的這種關系也在圖3中被圖示說明。圖4B是可替代的配置，其中開關 425與可變橋式電阻405并聯。
[0065]根據該實施例，耗材420可以被存放在基于支架的模塊化平臺470中。每一個支架 470可以包括能夠處理多至20個耗材的多路器元件。相應地，每一個支架有至少一個專用的 數字信號處理(DSP)鎖定放大器模塊，該模塊將負責信號獲取。因此，本實用新型設想耗材 陣列和將準許從陣列中的每個耗材獲取信號的開關。
[0066]多路器電路440和460可以允許計算機（如500)、信號檢測板或設備來掃描多個耗 材或者單一耗材的子組分。在那些實施例中，其中一個耗材具有多個腔，多個腔中的每個腔 中均具有樣品，多路器進行動作以"切換"檢測設備/電路連接（1+輸入和1+輸出）至單個耗 材或耗材的子組分。多路器電路將允許相對少的硬件組分來監測多個耗材。根據多路程度 以及耗材配置，多路器電路可以具有多種操作變化。
[0067] 在操作中，耗材的測量可以連續地進行。即，陣列中的每個耗材每次被掃描一個。 每一耗材的掃描時間可以為大約幾十秒。因此，每一個支架(如果完全使用)會花費約2-3分 鐘進行掃描。計算裝置500可以每10-15分鐘重復掃描活動。當陣列未被掃描時，可以通過使 用攪拌器450對耗材進行攪拌以對液體進行充分混合并通氣。攪拌可以通過豎直移位、環形 震蕩或者通過在耗材內使用攪拌棒來執行。攪拌機構(如果需要)可以具有多種設置，包括 使樣品混合最大化的水平震蕩機構。本領域普通技術人員將意識到，根據本文描述的示例， 可以使用不同的攪拌器的示例，并且因此不更詳細地討論。
[0068] 可變橋式電阻405(如橋式電阻-電容調節電路)可以是外部調節電路，該外部調節 電路將耗材420與檢測設備（即鎖定放大器的輸入級435)物理連接。可變橋式電阻405可以 包括一系列并聯的可變電阻（數字電位計），其允許頻率靈敏度的"實時的頻率調節和計 算"。在這方面，來自耗材的信號的頻率可以在約IkHz到約200MHz之間進行調節。調節參數 (即選定的頻率范圍以及峰與峰的電壓)可以通過耗材的總體積、電極的金屬化性質（如金、 銀或鉑）、包含的液體類型等進行測定。通過在低頻和高頻二者處調節耗材信號，該系統能 夠獨立地在低頻下檢測代謝副產物并在較高頻率下檢測微生物生物量。
[0069] 根據一些實施方式，如圖4A中所不，開關425可以與一系列可變橋式電阻405用電 線串聯。在可替代示例中，如圖4B所示，開關425可以與可變橋式電阻405用電線并聯。當開 關打開時，系統可以在低頻（即1到20kHz)下運行。如上所指示的，這將能夠檢測耗材中組成 的變化。當開關關閉時，系統可以通過向信號發生器提供反饋而在較高頻率（即遠大于 20kHz)下運行。如之前所討論的，通過在較高頻率下運行，系統對于液體中離子組分的變化 和生物量自身的變化二者均是敏感的。由于具有在高頻和低頻二者下調節頻率以測試的能 力，該系統對于較少體積的樣品可以具備更快的檢出時間(TTD)。
[0070] 鎖定放大器的輸入級435是能夠從相當大的噪聲環境內提取具有已知頻率的信號 的專用裝置。更進一步地，鎖定放大器可以將特別關注的信號解壓成基本的子組分。例如， 總阻抗的組分，尤其是"異相"電抗組分可以根據下式使用：
[0071] Z =電阻+j*電抗
[0072] 總阻抗|z| =入（電阻2+電抗2)。
[0073] 在另一示例中，電容組分（即界面電容和細胞電容)對總的電抗子組分有貢獻。因 此，使用信號的子組分可以1)允許連續幾天(如5天的方案）以特定間隔（如約10分鐘)持續 監測每每個耗材或者耗材中的子組分，并且2)檢測帶電分子組成的變化以及生物細胞或樣 品組分的數目。
[0074]在這方面，一旦有信號輸入鎖定放大器的輸入級435,可以執行數據分析。根據一 些實施例，數據分析分兩步進行以確定微生物生長。第一步，在每一個時間點下分析原始光 譜數據（即檢測到的電抗信號vs頻率）（如斜率、曲線下的面積、X截距、Y截距等）以得到單獨 的數據點。第二步，從每一個耗材或耗材的子組分獲得多個數據點后，使用通用算法以確定 表明微生物存在的與已知對照值有顯著統計學偏差的數據點。由于對微生物生長的靈敏度 加強，本文所描述的示例提供微生物生長的更快的檢測時間。
[0075]在可替代實施例中，來自原始"電抗"數據的信號提取的數據值可以用來確定微生 物生長與否。在這方面，提取的數據可以利用數學函數確定截距或曲線下的面積。這些數學 函數的結果可以與閾值對比。因此，在閾值之上的累積變化可以用來區別包含微生物的耗 材。因此，測量信號的異相組分的頻譜示出零交叉特征，該零交叉特征（i)依賴于Cm值，并且 (ii)在適宜低頻率下進行設定。在某些實施例中，頻率被設定在約IOOkHz或其下的值。這允 許使用標準測量設備，該標準測量設備如本文描述的鎖定放大器、LCR儀和/或網絡分析器。 [0076]與標準光學方法相比，上述實施例改善檢出時間（TTD)達5-70%。如下所述，當在 與傳統光學方法相比時，數據示出當在低頻率調節下檢測時對于大量微生物的檢測能夠以 更快的TTD發生。更進一步地，數據表明通過使用高頻調節可以進一步加強檢測靈敏度，由 此導致甚至更快的TTD。
[0077]在這方面，如圖5中所示，在較小的聚碳酸酯管中進行實驗，其包括：IOmL BACTEC 標準需氧介質、3mL袋裝血液、17CFU(集落形成單位）的大腸桿菌(A25922)，以及鍍金金屬電 極(黃銅主體），所述電極延伸入耗材內部并浸入介質/樣品混合物中。耗材中的電極與鎖定 放大器的其他組分相互連接。該設備的橋式電阻被設置為187歐姆，這造成在40到80kHz頻 段的光譜靈敏度。
[0078]當與進行平行掃描的對照(無微生物)管進行比較時，如下面的表1所示，多數微生 物和介質的TTD均顯著改善。這樣可以表明微生物的靈敏度為IO4-IO5CFU,比在約IO 9CFU下 檢測微生物的當前光學檢測系統的靈敏度高至少2到4個數量級。這些結果代表減少了 70% 的檢出時間，更具體的細節將關于附圖5在下面進行討論。這些水平的檢測從未被報道過， 并且完全是出乎意料的。對于圖示，示出大腸桿菌的頻率隨時間的變化(相對于對照）。在低 頻率下，TTD約為10小時，這加快了多達5-10%。在高頻率下，TTD改善至約4小時，這幾乎加 快了70%。
[0080] 表1
[0081] 再次參考表1，針對表1中報告的各種樣品重復上述實驗，其中上述實驗的結果在 圖5中被圖示說明。例如，其中3mL袋裝血液和17CFU的金黃色葡萄球菌(S.aureus)(A25923) 生長在7-8小時內被檢測。相比于檢測集落生長的標準光學檢測技術在約12-14小時的時 間，這表示檢出時間減少42%。
[0082] 表1圖示說明進行不同實驗的結果，這些實驗包括下述條件:7mL袋裝血液和17CFU 大腸桿菌微生物(A25922); 7mL袋裝血液和17CFU金黃色葡萄球菌(A25923); 7mL袋裝血液和 17CFU流感嗜血桿菌（H. influenzae) (A19418);7mL袋裝血液和17CFU奠腸球菌 (H.faecalis)(A29212);以及7mL袋裝血液和 17CFU念珠菌（C.glabrata)(A66032)。
[0083] 因此，在7mL溶真菌的介質中大腸桿菌的生長在約8.5到9小時內被檢測到，這相比 于標準光學檢測技術在溶真菌的介質中對于大腸桿菌的檢測（10-11小時），改善TTD。金黃 色葡萄球菌在溶真菌的介質中的生長在約10小時內被檢測到，相比于標準光學檢測技術有 23 %的提高。流感嗜血桿菌在溶真菌的介質中的生長在約16小時內被檢測到。其TTD相比于 使用標準光學檢測技術對于流感嗜血桿菌的TTD(16小時）改進16%。對于溶真菌的介質中 的糞腸球菌集落，其TTD為11小時，代表相對于使用標準光學檢測技術11-12小時TTD的8% 的改進。溶真菌的介質中的念珠菌的TTD在約17小時內被檢測，這代表了使用標準光學檢測 技術檢測念珠菌TTD(20-42小時）的45%的改進。圖5和表1中還報告了在標準需氧介質中的 樣品相對于標準光學檢測技術TTD的改善。
[0084] 圖6圖示說明在上述較小體積中實現的檢出時間的改進同樣在較大體積的樣品/ 介質中實現。具體地，在MCTEC瓶中組合40ml標準MCTEC介質和I Oml血液。樣品被接種有 50-60CFU的大腸桿菌。在低頻率下，使用本文描述的裝置及方法，TTD為10.5-11小時，這加 快了多達5%。在高頻率下，TTD改善至9.5-10小時，這加快了多達14%。
[0085] 圖5圖示說明不同頻率下大腸桿菌的檢出時間。以同樣的方式準備所有的耗材，唯 一的不同在于是否有微生物存在和外部電路的電參數。在這方面，用四個16mL耗材進行實 驗，每一耗材中準備有IOmL標準需氧介質和3mL血液。兩個耗材還加入大腸桿菌的17個集落 形成單位(一個用于低頻模式，而一個用于高頻模式）。耗材的電極是30mm金電極。在實驗過 程中，對耗材施加500mV的峰與峰電壓，并且經由每分鐘120轉的速率震蕩來攪拌耗材。 [0086]在低頻模式(如I-IOkHz)下，對于含介質和血液的耗材施加的信號沒有產生偏差。 相比之下，對于在低頻模式下加入具有大腸桿菌的耗材，頻率的偏差大約10小時一一如圖5 中所描述的在信號偏差點510處一一被檢測到。這代表了相對于標準光學檢測技術在檢出 時間上5-10%的改善。對于大腸桿菌，經典的BACTED TDD為約11小時。
[0087] 在高頻模式（如40-80kHz)下，可變橋式電阻（如圖4A和圖4B中的405)被調節至500 Ω。因此，在4小時標志附近一一如圖5中所描述的在信號偏差點520處），檢測到帶有大腸桿 菌的耗材中的施加的信號的偏差。這代表了相對于標準光學檢測技術在檢出時間上70%的 改善。在之前的大腸桿菌實驗中，從來沒有在這些檢測水平和這一時間框架下的檢測被報 道，是完全出乎意料的。而本發明人并不意在堅持某一特定理論，在信號偏差點520處的該 早期檢測特征被確信主要歸因于細胞電容，或者與微生物細胞的膜電勢相關的電荷。當這 些細胞持續復制并產生代謝副產物時，介質的離子濃度達到臨界點，在該臨界點處發生第 二特征，如圖5中信號偏差點525處所描述的。兩個信號都代表了對生長中的微生物初步鑒 定可能性的獨特特征。因此，目前的應用描述了通過使用高和低頻檢測二者來加強檢測靈 敏度從而產生更低的檢出時間。
[0088]圖7示出了在高頻模式下通過測量根據時間的變化速率，對于洛菲不動桿菌 (A. Iowf f i i)的檢出時間。可變橋式電阻（如圖4A和圖4B中的405)被調節至200 Ω。頻段為 50-60kHz。準備兩個ImL耗材(如一個對照，而一個具有樣品），其中加入0.9mL標準需氧介質 和OmL血液。根據此實驗，向其中一個耗材加入洛菲不動桿菌的28個集落形成單位。耗材具 有兩個15mm電極。在實驗過程中，向耗材施加250mV的峰與峰電壓，并且經由每分鐘100轉的 速率的震蕩來攪拌耗材。當施加高頻率時，檢測到正常頻率的變化速率約11小時，如圖7中 信號偏差點810處所描述的。這代表了傳統光學檢測系統的50%的減少。對于洛菲不動桿 菌，經典的BACTED TDD為約20小時。
[0089]圖8代表在高頻模式下檢測藤黃微球菌(M. Iuteus)的實驗結果。可變橋式電阻(如 圖4A和圖4B中的405)被調節至200Ω。頻段為60-70kHz。準備兩個ImL耗材(如一個對照，而 一個具有樣品），其中加入〇. 9mL標準需氧介質和OmL血液。向上述其中一個耗材加入藤黃微 球菌的21個集落形成單位。耗材具有兩個15mm電極。在實驗過程中，向耗材施加250mV的峰 與峰電壓，并且經由每分鐘100轉的速率的震蕩來攪拌耗材。如圖8中信號偏差點910處所示 的，檢測到正常頻率的變化速率約28-30小時，其代表了相比于傳統光學檢測系統的30%的 減少。對于藤黃微球菌，經典的BACTED TDD為約42小時。
[0090] 上述檢測時間之前從未被報道過，且是完全出乎意料的。因此，目前的應用描述了 對于微生物生長通過使用高和低頻二者加強檢測靈敏度可以產生更低的檢出時間。
[0091] 盡管本文參考具體實施例已經描述了本實用新型，但應當明確，這些實施例僅是 本實用新型的原理和應用的圖示說明。因此，應當明確可以對所示實施例做出多種修改，并 且在不脫離本實用新型的如隨附權利要求所要求保護的精神和范圍的情況下，可以設想其 他設置。
【主權項】
1. 一種對微生物生長敏感的系統，其特征在于，所述系統包括： 信號處理電路，所述信號處理電路連接到適于接收生物樣品的容器； 兩個或更多個電極，所述兩個或更多個電極刺入所述容器并且與所述生物樣品接觸， 其中所述電路被配置以測量所述樣品的總阻抗并檢測所述總阻抗的電抗。2. 如權利要求1所述的系統，其特征在于，所述系統進一步包括調節元件。3. 如權利要求2所述的系統，其特征在于，所述調節元件是與鎖定放大器的電容級并聯 的一個或更多個可變電阻。4. 如權利要求2所述的系統，其特征在于，所述調節元件是橋式電阻-電容調節電路。5. 如權利要求1所述的系統，其特征在于，所述電路在高頻操作模式和低頻操作模式之 間可轉換，其中高頻在40kHz到80kHz的范圍內，而低頻在IkHz到IOkHz的范圍內。6. 如權利要求5所述的系統，其特征在于，所述系統進一步包括調節元件。7. 如權利要求6所述的系統，其特征在于，所述調節元件是橋式電阻-電容調節電路。8. 如權利要求4或權利要求7所述的系統，其特征在于，所述系統進一步包括與所述橋 式電阻串聯或與所述橋式電阻并聯的開關。9. 如權利要求8所述的系統，其特征在于，當所述開關打開時，所述系統以低頻模式運 行，而當所述開關關閉時，所述系統以高頻模式運行。
【文檔編號】G01N27/02GK205538786SQ201520983323
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2015年10月14日
【發明人】P·S·貝蒂, M·A·布拉斯克, S·霍斯曼, D·波利, J·L·羅薩萊斯, K·L·史密斯
【申請人】貝克頓·迪金森公司