一種快速定量檢測ST2和NT-proBNP的試紙的制作方法
【技術領域】
[0001] 本實用新型屬于臨床醫學診斷領域，具體涉及一種快速定量檢測ST2和NT-proBNP的試紙。
【背景技術】
[0002] 可溶性生長刺激表達基因2蛋白（ST2)基因是1989年由Tominaga等首先在BALB/ C-3T3細胞系中得到的，是IL-I(白細胞介素1)受體家族成員之一，該基因表達兩種蛋 白產物：一種帶有跨膜結構，稱為跨模型ST2(ST2L)，一種可以分泌到細胞外，稱為分泌型 ST2 (sST2)。研宄發現ST2可由心臟成纖維細胞和心肌細胞表達，是生物機械應力誘導產生 的一種心肌蛋白。ST2基因表達于肥大細胞激活的輔助性T細胞2 (Th2)巨噬細胞和心肌細 胞。人的ST2基因約40kb，位于人類染色體2ql2,可編碼一種可溶性蛋白（sST2)和一種跨 膜形式蛋白（ST2L)，兩者的轉錄分別受到不同的啟動子調控。
[0003] 研宄表明sST2是IL-33的誘騙受體，它可以與IL-33結合，從而阻斷IL-33與 ST2L結合，繼而削弱IL-33/ST2L信號通路的心血管保護作用在心肌受到過度牽拉造成損 傷的過程中，大量sST2生成使心肌缺乏足夠的IL-33的保護，從而加速心肌重構和心室功 能障礙，最終導致死亡風險增高。IL-33是IL-I家族成員，可以與靶細胞上的膜受體結合后 介導下游信號通路，或者被運輸到靶細胞的細胞核作為DNA結合因子行使功能。研宄表明， 機械應力可刺激心臟成纖維細胞產生IL-33,與其受體復合物（由ST2L和IL-IRAcP組成） 結合后，將活化信號傳遞至細胞內，經過下游的IL-I相關蛋白激酶髓樣分化因子88和腫 瘤壞死因子受體相關因子6等一系列信號分子，激活核轉錄因子KB(nuclearfactorKB， NF-KB)和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)，從而調 芐基因轉錄，導致Th2細胞效應分子IL-5IL-4和IL-13等的釋放。當心臟成纖維細胞和心 肌細胞受到過大的壓力負荷時，這些效應分子可以使心臟作出適應性反應，防止過度牽拉 導致的心肌肥大和心肌纖維化發生。與此同時，心肌sST2大量生成，sST2與IL-33結合后 競爭性抑制其與ST2L結合，阻斷經ST2L的信號傳導，最終抑制NF-B和MAPK激活，從而大 大降低IL-33/ST2L信號通路的內源性心肌保護作用。ST2能夠獨立的診斷心力衰竭，結合 NT-proBNP時，其對心衰的診斷的敏感性和特異性均高于ST2和NT-proBNP單獨診斷的結 果，其中NT-proBNP是指N末端腦鈉肽，腦鈉肽（B-type-NatriureticPeptide，BNP)由日本 學者Sudoh等于1988年首先在豬腦中發現，而Hunt等在1995年第一次對N-端腦鈉肽前 體（N-terminal-pr〇-BNP，NTproBNP)進行了描述。BNP主要由左心室分泌，在心肌細胞受到 容量負荷和壓力負荷增高時，非活性前體Pro-BNP裂解為活性BNP和非活性的NT-proBNP。 2000年11月美國食品藥物管理局批準美國Biosite公司的Triage?BNP檢測應用于臨床， 發展到今天，美國心臟協會（AHA)和歐洲心臟病學會（ESC)等全球心血管權威機構以及美 國臨床生化學院（NACP)在其制訂的"心衰診斷和治療指南"及"心臟標志物的應用指南" 中，把BNP/NT-proBNP列為不可缺少的心臟標志物，以指導心衰的治療。NT-proBNP能客觀 反映充血性心力衰竭（CHF)及嚴重程度，其血漿水平隨心衰程度增加而增高，能更好地輔 助診斷心衰分級。超聲判斷CHF的金標準是左室射血分數（LVEF)下降，而血清NT-proBNP水平升高則預示左室射血功能的減退更加嚴重，甚至比超聲檢查更具優越性。
[0004] 免疫膠體金技術（Immunecolloidalgoldtechnique)是以膠體金作為示蹤標志 物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸（HAuC14)在還原劑如 白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成 為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正 電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體 金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合。根據膠體金的一些物理性 狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠 體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。
[0005] 鑒于目前尚無快速定量檢測ST2和NT-proBNP聯檢的方法，本實用新型的目的是 提供一種可用于快速定量檢測ST2和NT-proBNP聯檢的試紙以及一種可用于快速定量檢測 ST2和NT-proBNP聯檢的試紙盒，所述試紙和試紙盒具有方便快捷、操作簡單、結果準確等 優點。 【實用新型內容】
[0006] 本實用新型的一個目的是提供一種快速定量檢測ST2和NT-proBNP聯檢的試紙， 本實用新型所述快速定量檢測ST2和NT-proBNP聯檢的試紙具有方便快捷、操作簡單、結果 準確等優點，適于臨床快速診斷。
[0007] 本實用新型的技術方案是：
[0008] 一種快速定量檢測ST2和NT-proBNP聯檢的試紙，包括支撐墊片1，位于所述支撐 墊片上的硝酸纖維素膜2,所述硝酸纖維素膜的一端上方層疊連接吸水墊3,另一端上方層 疊連接偶合物墊片4,所述偶合物墊片一端上方層疊連接樣本墊片5,所述樣本墊片另一端 部的下方設有第一固定部件6,上方設有第二固定部件7,其特征在于，所述硝酸纖維素膜2 中間部位第一檢測線8和第二檢測線9分別包被有抗ST2或抗NT-proBNP的單克隆或多克 隆抗體，在所述第一檢測線和第二檢測線的兩邊分別設有控制線10,所述偶合物墊片4上 涂布有金標記的ST2和NT-proBNP抗體以及控制線偶合物。優選地，所述控制線9包被有 抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA標記的膠體金。
[0009] 其中所述BSA是指牛血清白蛋白。
[0010] 優選地，所述第一固定部件6為雙面膠，第二固定部件7為單面膠。
[0011] 優選地，所述兩條控制線10與第一檢測線8和第二檢測線9為平行設置。
[0012] 本實用新型的另一個目的是提供了一種快速定量檢測ST2和NT-proBNP抗體的試 紙盒，在本實用新型所述的定量檢測ST2和NT-proBNP抗體的試紙的基礎上還包括一外殼 11〇
[0013] 所述外殼優選塑料外殼。
[0014] 所述外殼包裹所述試紙，露出樣本墊片5、硝酸纖維素膜2上的第一檢測線8和第 二檢測線9和兩條控制線10、以及吸水墊3。
[0015] 本實用新型所述的試紙盒具有方便攜帶和貯存的優點。
[0016] 本實用新型所述的快速定量檢測ST2和NT-proBNP抗體的試紙或試紙盒的工作原 理是：采用免疫反應原理，通過雙抗體夾心法制備而成。檢驗時樣本中的ST2和NT-proBNP抗原首先分別與偶合墊上的ST2和NT-proBNP抗體偶合物發生免疫反應，形成免疫復合 物。其后免疫復合物隨著樣本在硝基纖維素膜上層析流動，當免疫復合物層析至硝基纖維 素膜上的檢測區（ST2和NT-proBNP檢測線）時，分別與預先包被在硝基纖維素膜上的抗 ST2和NT-proBNP抗體發生反應從而被固定在硝基纖維素膜的檢測線上。樣本中的ST2和 NT-proBNP越多，檢測線上的復合物越多，條帶上的光密度值就越高。同時，在檢測過程中， 控制線偶合物（即DNP-BSA標記的膠體金），也會隨樣本在硝基纖維素膜上層析，當層析至 硝基纖維素膜的控制線時，DNP-BSA膠體金會與預先包被在硝基纖維素膜上的抗DNP抗體 發生反應從而被固定在對照區（控制線）上。由于膠體金為紅色，因而固定在硝基纖維素 膜控制線上的抗DNP中的DNP-BSA膠體金免疫復合物將顯示紅色。當樣本中不含ST2和 NT-proBNP時，則只顯示兩條控制線。當樣本含ST2和NT-proBNP時，檢測線就會分別清晰 的顯示出來。
[0017] 當反應結束后，利用多功能免疫檢測儀（瑞萊生物工程（深圳）有限公司）將控 制線和檢測線的光密度進行分析，并將所分析得到的結果進行運算，從而得到相對光密度 值（RI)。然后檢測儀根據已預先設置在檢測儀內的標準曲線對ST2和NT-proBNP的濃度進 行計算并顯示結果，以ng/mL和pg/ml為單位表示。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本實用新型所述快速定量檢