一種農藥殘留快速檢測消除假陽性的檢測方法
【專利摘要】一種農藥殘留消除假陽性的快速檢測方法屬于食品安全領域，具體涉及一種應用于生姜與大蒜農藥快速檢測的方法。一種農藥殘留快速檢測消除假陽性的檢測方法，具體包括以下步驟：步驟a、測試試劑配制，步驟b、樣品前處理，步驟C、檢測判斷；本方法樣品提取液經過加熱處理，可以消除生姜及大蒜中次生物的干擾；同時提取液經過離心處理可以將色素及或其他固形物除去，減少對檢測結果的干擾；此外，樣品經絞碎處理，浸提更充分。
【專利說明】一種農藥殘留快速檢測消除假陽性的檢測方法 技術領域
[0001] -種農藥殘留消除假陽性的快速檢測方法屬于食品安全領域，具體涉及一種應用 于生姜與大蒜農藥快速檢測的方法。 【背景技術】
[0002] 常用農藥中，對人毒性較大，容易引起中毒的是殺蟲劑，而在殺蟲劑中引起中毒事 件最多的是有機磷和氨基甲酸酯類農藥，且這兩類農藥在實際生產中使用頻率較高，這就 對有機磷和氨基甲酸酯類農藥的快速檢測提出了更高的要求。目前，常用的有機磷和氨基 甲酸酯類農藥檢測方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、超臨界流體色譜法、 生物傳感器法、免疫分析法、酶抑制法等。
[0003] 色譜檢測法精度最高，但其檢測過程復雜、檢測時間長，蔬菜的品種多、來源廣，并 且蔬菜的銷售要保持新鮮，在流通市場停留的時間短，因此，色譜法很難在蔬菜銷售之前完 成檢測。而生物傳感器法及免疫分析法因前期投入大、實驗條件苛刻，當前在中國還僅用于 實驗室。酶抑制法以準確性高、檢測速度快、操作簡單、成本低等優點得到廣 泛應用，是現階段常用的有機磷和氨基甲酸酯類農藥的快速檢測方法，并已成為蔬菜 中有機磷和氨基甲酸酯類農藥快速檢測的國標方法。
[0004] 但是，酶抑制率法測定某些特別蔬菜中農藥殘留量存在假陽性，這一點在國家標 準GB/T 5009.199-2003的說明中就明確指出："蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及 番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質，容易產生假陽性"，干擾檢測結果，給農產品 質量安全的監管增加難度。
【發明內容】

[0005] 本發明設計了一種生姜及大蒜農藥殘留的快速檢測方法，其目的在于解決酶抑制 率法中檢測生姜和蒜中容易出現的假陽性問題。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為： 一種農藥殘留快速檢測消除假陽性的檢測方法，具體包括以下步驟： 步驟a、測試試劑配制 首先分別配制好需要的試劑為PH8.0磷酸鹽緩沖液、顯色劑、底物和乙酰膽堿酯酶液， 起配置方法如下： pH7.0-9.0磷酸鹽緩沖液：取11.5-12.5g磷酸氫二鉀(K2HP04)和3-3.5g磷酸二氫鉀 (KH2P04)，溶于1000ml蒸餾水中便得到pH7.0-9.0磷酸鹽緩沖液； 顯色劑：取140-170mg硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和14.8-16.4mg碳酸氫鈉(NaHC03)，用 17-23ml的上述磷酸鹽緩沖液溶解，于2-5 °C冰箱保存。
[0007] 底物:取23-27mg硫代乙酰膽堿，加2.6-3.3ml蒸餾水溶解，搖勻后置于3-6°C冰箱 保存。
[0008] 乙酰膽堿酯酶液:根據酶的活性，用緩沖液溶解，搖勻后置于2-5°C冰箱保存。其中 酶液2.5-3.2min的吸光度變化應控制在0.3以上。
[0009] 步驟b、樣品前處理 (1) 將選取的l、2-l、5g生姜與l、2-l、5g大蒜用清水沖洗干凈，注意不要破壞樣本表面 組織； (2) 將經過以上步驟1處理好的生姜與大蒜用絞碎機絞碎，各稱取分別絞碎后獲得生姜 0.8-1.2g與0.8-1、2g大蒜，再加入5ml配置好的pH8.0磷酸鹽緩沖液，充分振蕩后，置于90-120°C水浴鍋中加熱處理，熱處理時分開進行，生姜的處理條件是90-120°C持續2-3min，大 蒜的處理條件是80-110°C持續l_2min;將熱處理好的提取液放置室溫25-28°C保存； (3) :取上步驟2中放置于室溫25-28Γ保存的樣品，放入離心管中，5000轉每分鐘的離 心機持續旋轉09-1.2 min，處理完成后的清液加以18-20°C保存。
[0010] 步驟C、檢測判斷 (1)空白對照液測試 取試管加入2-3ml磷酸鹽緩沖液，再加入0.09-0.12ml乙酰膽堿酯酶液、0.3-0.5ml顯色 劑，搖勻后放置于35-38°C恒溫水浴鍋存放15-20min，再加入0.08-0.1 lml底物搖勻，馬上 放人分光光度計于400-420nm處測定，記錄下反應2.5-3.5min的吸光度變化值Δ A0的數 值。
[0011] (2)樣品液測試 取試管加入2-3ml經步驟b3處理好的樣品液，再加入0.09-0.12ml乙酰膽堿酯酶液、 0.3-0.5ml顯色劑，搖勻后放置于35-38 °C恒溫水浴鍋存放15-20min，再加入0.08-0.1 lml 底物搖勻，馬上放人分光光度計于400_420nm處測定，記錄下反應2.5-3.5min的吸光度變化 值A At的數值。
[0012] (3)計算判斷 通過步驟1、2測得Δ A0和Δ At的數值，用以下公式計算出酶抑制率(％) 抑制率(％)=[ Zl A0 - Zl At]/M A0]X100..................(1) (4) 定性判定 當提取液的抑制率250%時，表示蔬菜中有高劑量的有機磷或氨基甲酸酯類農藥存在， 樣品為陽性。
[0013] 本發明采用上述技術方案，本方法樣品提取液經過加熱處理，可以消除生姜及大 蒜中次生物的干擾；同時提取液經過離心處理可以將色素及或其他固形物除去，減少對檢 測結果的干擾;此外，樣品經絞碎處理，浸提更充分。 【附圖說明】 【附圖說明】
[0014] 圖1為本發明生姜及大蒜中農藥殘留物的快速檢測流程圖。 【具體實施方式】
[0015] 實施例1 一種農藥殘留快速檢測消除假陽性的檢測方法，具體包括以下步驟： 步驟a、測試試劑配制 首先分別配制好需要的試劑為PH8.0磷酸鹽緩沖液、顯色劑、底物和乙酰膽堿酯酶液， 起配置方法如下： pH8.0磷酸鹽緩沖液:取11.9g磷酸氫二鉀(K2HP04)和3.2g磷酸二氫鉀(KH2P04)，溶于 1000ml蒸餾水中便得到pH8.0磷酸鹽緩沖液； 顯色劑:取160mg硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg碳酸氫鈉(NaHC03)，用17-23ml的 上述磷酸鹽緩沖液溶解，于4 °C冰箱保存。
[0016] 底物:取25mg硫代乙酰膽堿，加3ml蒸餾水溶解，搖勻后置于4°C冰箱保存。
[0017] 乙酰膽堿酯酶液:根據酶的活性，用緩沖液溶解，搖勻后置于2-5°C冰箱保存。其中 酶液3min的吸光度變化應控制在0.3以上。
[0018] 步驟b、樣品前處理 (1) 將選取的1.3g生姜與1.3g大蒜用清水沖洗干凈，注意不要破壞樣本表面組織； (2) 將經過以上步驟1處理好的生姜與大蒜用絞碎機絞碎，各稱取分別絞碎后獲得生姜 lg與lg大蒜，再加入5ml配置好的pH8.0磷酸鹽緩沖液，充分振蕩后，置于100 °C水浴鍋中加 熱處理，熱處理時分開進行，生姜的處理條件是l〇〇°C持續2-3min，大蒜的處理條件是100°C 持續l-2min;將熱處理好的提取液放置室溫25-28°C保存； (3) :取上步驟2中放置于室溫25-28Γ保存的樣品，放入離心管中，5000轉每分鐘的離 心機持續旋轉〇. 9-1.2 min，處理完成后的清液加以18-20 °C保存。
[0019] 步驟C、檢測判斷 (1)空白對照液測試 取試管加入2.5ml磷酸鹽緩沖液，再加入0. lml乙酰膽堿酯酶液、0.4ml顯色劑，搖勻后 放置于37°C恒溫水浴鍋存放18min，再加入0. lml底物搖勻，馬上放人分光光度計于412nm處 測定，記錄下反應3min的吸光度變化值△ A 〇的數值。
[0020] (2)樣品液測試 取試管加入2.5ml經步驟b3處理好的樣品液，再加入0. lml乙酰膽堿酯酶液、0.4ml顯色 劑，搖勻后放置于35-38°C恒溫水浴鍋存放18min，再加入0.1ml底物搖勻，馬上放人分光光 度計于412nm處測定，記錄下反應2.5-3.5min的吸光度變化值Δ A t的數值。
[0021] (3)計算判斷 通過步驟1、2測得Δ A0和Δ At的數值，用以下公式計算出酶抑制率(％) 抑制率(％)=[ Zl A0 - Zl At]/ /1 AO] X 100 (4) 定性判定 當提取液的抑制率250%時，表示蔬菜中有高劑量的有機磷或氨基甲酸酯類農藥存在， 樣品為陽性。
[0022] 實施例2 一種農藥殘留快速檢測消除假陽性的檢測方法，具體包括以下步驟： 步驟a、測試試劑配制 首先分別配制好需要的試劑為PH8.0磷酸鹽緩沖液、顯色劑、底物和乙酰膽堿酯酶液， 起配置方法如下： PH8.0磷酸鹽緩沖液：取11.5g磷酸氫二鉀(K2HP04)和3g磷酸二氫鉀(KH2P04)，溶于 1000ml蒸餾水中便得到pH8.0磷酸鹽緩沖液； 顯色劑:取140mg硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和14.8mg碳酸氫鈉(NaHC03)，用17ml的上述 磷酸鹽緩沖液溶解，于2 °C冰箱保存。
[0023]底物:取23mg硫代乙酰膽堿，加2.6ml蒸餾水溶解，搖勻后置于3°C冰箱保存。
[0024]乙酰膽堿酯酶液:根據酶的活性，用緩沖液溶解，搖勻后置于2°C冰箱保存。其中酶 液2.5min的吸光度變化應控制在0.3以上。
[0025] 步驟b、樣品前處理 (1) 將選取的1.2g生姜與.1.2g大蒜用清水沖洗干凈，注意不要破壞樣本表面組織； (2) 將經過以上步驟1處理好的生姜與大蒜用絞碎機絞碎，各稱取分別絞碎后獲得生姜 0.8g與0.8g大蒜，再加入5ml配置好的pH8.0磷酸鹽緩沖液，充分振蕩后，置于90°C水浴鍋中 加熱處理，熱處理時分開進行，生姜的處理條件是90 °C持續2min，大蒜的處理條件是80 °C持 續lmin;將熱處理好的提取液放置室溫25-28 °C保存； (3) :取上步驟2中放置于室溫25-28Γ保存的樣品，放入離心管中，5000轉每分鐘的離 心機持續旋轉〇. 9-1.2 min，處理完成后的清液加以18-20 °C保存。
[0026] 步驟C、檢測判斷 (1)空白對照液測試 取試管加入2ml磷酸鹽緩沖液，再加入0.09ml乙酰膽堿酯酶液、0.3ml顯色劑，搖勻后放 置于35°C恒溫水浴鍋存放15min，再加入0.08ml底物搖勻，馬上放人分光光度計于400nm處 測定，記錄下反應2.5min的吸光度變化值Δ A 〇的數值。
[0027] (2)樣品液測試 取試管加入2ml經步驟b3處理好的樣品液，再加入0.09ml乙酰膽堿酯酶液、0.3ml顯色 劑，搖勻后放置于35-38°C恒溫水浴鍋存放15min，再加入0.081ml底物搖勻，馬上放人分光 光度計于400nm處測定，記錄下反應2.5min的吸光度變化值△ A t的數值。
[0028] (3)計算判斷 通過步驟1、2測得Δ A0和Δ At的數值，用以下公式計算出酶抑制率(％) 抑制率(％)=[ Zl A0 - Zl At]/ /1 AO] X 100 (4) 定性判定 當提取液的抑制率250%時，表示蔬菜中有高劑量的有機磷或氨基甲酸酯類農藥存在， 樣品為陽性。
[0029] 實施例3 一種農藥殘留快速檢測消除假陽性的檢測方法，具體包括以下步驟： 步驟a、測試試劑配制 首先分別配制好需要的試劑為PH8.0磷酸鹽緩沖液、顯色劑、底物和乙酰膽堿酯酶液， 起配置方法如下： pH8.0磷酸鹽緩沖液:取12.5g磷酸氫二鉀(K2HP04)和3.5g磷酸二氫鉀(KH2P04)，溶于 1000ml蒸餾水中便得到pH8.0磷酸鹽緩沖液； 顯色劑:取170mg硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和16.4mg碳酸氫鈉(NaHC03)，用23ml的上述 磷酸鹽緩沖液溶解，于2-5 °C冰箱保存。
[0030]底物:取27mg硫代乙酰膽堿，加3.3ml蒸餾水溶解，搖勻后置于6°C冰箱保存。
[0031]乙酰膽堿酯酶液:根據酶的活性，用緩沖液溶解，搖勻后置于5°C冰箱保存。其中酶 液3.2min的吸光度變化應控制在0.3以上。
[0032] 步驟b、樣品前處理 (1) 將選取的1.5g生姜與.1.5g大蒜用清水沖洗干凈，注意不要破壞樣本表面組織； (2) 將經過以上步驟1處理好的生姜與大蒜用絞碎機絞碎，各稱取分別絞碎后獲得生姜 1.2g與1.2g大蒜，再加入5ml配置好的pH8.0磷酸鹽緩沖液，充分振蕩后，置于120°C水浴鍋 中加熱處理，熱處理時分開進行，生姜的處理條件是120°C持續3min，大蒜的處理條件是110 °C持續2min;將熱處理好的提取液放置室溫25-28°C保存； (3) :取上步驟2中放置于室溫28°C保存的樣品，放入離心管中，5000轉每分鐘的離心機 持續旋轉1.2 min，處理完成后的清液加以18-20°C保存。
[0033] 步驟C、檢測判斷 (1)空白對照液測試 取試管加入3ml磷酸鹽緩沖液，再加入0.12ml乙酰膽堿酯酶液、0.5ml顯色劑，搖勻后放 置于35-38°C恒溫水浴鍋存放20min，再加入0.1 lml底物搖勻，馬上放人分光光度計于420nm 處測定，記錄下反應2.5-3.5min的吸光度變化值Δ A〇的數值。
[0034] (2)樣品液測試 取試管加入2-3ml經步驟b3處理好的樣品液，再加入0.09-0.12ml乙酰膽堿酯酶液、 0.3-0.5ml顯色劑，搖勻后放置于35-38 °C恒溫水浴鍋存放15-20min，再加入0.08-0.1 lml 底物搖勻，馬上放人分光光度計于400_420nm處測定，記錄下反應2.5-3.5min的吸光度變化 值A At的數值。
[0035] (3)計算判斷 通過步驟1、2測得Δ A0和Δ At的數值，用以下公式計算出酶抑制率(％) 抑制率(％)=[ Zl A0 - Zl At]/ /1 AO] X 100 (4) 定性判定 當提取液的抑制率250%時，表示蔬菜中有高劑量的有機磷或氨基甲酸酯類農藥存在， 樣品為陽性。
[0036] 檢測分析 根據以上3個實施方式的方式，做了以下實驗數據比對。
[0037]不同濃度農藥液測試驗證:在沸水浴加熱時間為3min的條件下，驗證不同濃度農 藥緩沖液與不經加熱處理的農藥緩沖液測試結果，按照步驟c的檢測過程，驗證兩種條件下 對判定結果一致性;對5種有機磷和氨基甲酸酯類農藥驗證結果如下表所示。結果表明，兩 種情況下對抑制率的檢測結果沒有顯著影響，且在50%抑制率的定性判定線結果完全一致， 因此3min熱處理時間對定性判定沒有顯著影響。
[0038] 注表示一致，-表示不一致
分別抽取生姜和大蒜各5個批次，每個批次取3個不同實施例的處理樣品，按照本發明 的檢測方法，T1、T 2、T 3分別實施例1、實施例2實施例3的檢測方法，檢測結果與國標G B / T5009-2003《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測》酶抑制率發對比，并用 氣象色譜法做定量驗證；用本發明方法檢出的30組生姜及大蒜數據，經色譜法驗證未出現 過假陽性結果，而國標法則出現11次假陽性結果(如下表所示）。
【主權項】
1. 一種農藥殘留快速檢測消除假陽性的檢測方法，其特征在于具體包括以下步驟： 步驟a、測試試劑配制 首先分別配制好需要的試劑為PH8.0磷酸鹽緩沖液、顯色劑、底物和乙酰膽堿酯酶液， 起配置方法如下： PH8.0磷酸鹽緩沖液：取11 .5-12.5g磷酸氫二鉀（K2HP04)和3-3.5g磷酸二氫鉀 (KH2P04)，溶于1000ml蒸餾水中便得到pH8.0磷酸鹽緩沖液； 顯色劑：取14〇-17〇11^硫代二硝基苯甲酸(0了咄)和14.8-16.411^碳酸氫鈉(他!^〇3)，用 17-23ml的上述磷酸鹽緩沖液溶解，于2-5°C冰箱保存； 底物:取23-27mg硫代乙酰膽堿，加2.6-3.3!111蒸餾水溶解，搖勻后置于3-6°(：冰箱保存； 乙酰膽堿酯酶液:根據酶的活性，用緩沖液溶解，搖勻后置于2-5 °C冰箱保存； 其中酶液2.5-3.2min的吸光度變化應控制在0.3以上； 步驟b、樣品前處理 (1) 將選取的1.2-1.5g生姜與.1.2-1.5g大蒜用清水沖洗干凈，注意不要破壞樣本表面 組織； (2) 將經過以上步驟1處理好的生姜與大蒜用絞碎機絞碎，各稱取分別絞碎后獲得生姜 0.8-1.2g與0.8-1.2g大蒜，再加入5ml配置好的pH8.0磷酸鹽緩沖液，充分振蕩后，置于90-120°C水浴鍋中加熱處理，熱處理時分開進行，生姜的處理條件是90-120°C持續2-3min，大 蒜的處理條件是80-110°C持續l_2min;將熱處理好的提取液放置室溫25-28°C保存； (3) :取上步驟2中放置于室溫25-28Γ保存的樣品，放入離心管中，5000轉每分鐘的離 心機持續旋轉〇. 9-1.2 min，處理完成后的清液加以18-20 °C保存； 步驟C、檢測判斷 (1) 空白對照液測試 取試管加入2-3ml磷酸鹽緩沖液，再加入0.09-0.12ml乙酰膽堿酯酶液、0.3-0.5ml顯色 劑，搖勻后放置于35-38°C恒溫水浴鍋存放15-20min，再加入0.08-0.1 lml底物搖勻，馬上 放人分光光度計于400-420nm處測定，記錄下反應2.5-3.5min的吸光度變化值Δ A0的數 值； (2) 樣品液測試 取試管加入2-3ml經步驟b3處理好的樣品液，再加入0.09-0.12ml乙酰膽堿酯酶液、 0.3-0.5ml顯色劑，搖勻后放置于35-38 °C恒溫水浴鍋存放15-20min，再加入0.08-0.1 lml 底物搖勻，馬上放人分光光度計于400_420nm處測定，記錄下反應2.5-3.5min的吸光度變化 值A At的數值； (3) 計算判斷 通過步驟1、2測得Δ A0和Δ At的數值，用以下公式計算出酶抑制率(％) 抑制率(％)=[ Zl A〇 - Zl At]/M A0]X100..................(1) (4) 定性判定 當提取液的抑制率2 50%時，表示蔬菜中有高劑量的有機磷或氨基甲酸酯類農藥存在， 樣品為陽性。
【文檔編號】G01N21/31GK106093032SQ201610769289
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月31日
【發明人】林燕, 孟月志
【申請人】孟月志