比率型電化學發光紙芯片的制備及在鉛離子檢測中的應用
【專利摘要】本發明公開了一種比率型電化學發光紙芯片的制備方法及所述的三維紙基設備在鉛離子檢測中的應用。通過蠟打印技術在紙芯片上制備工作區，并印制三電極，進而對工作區功能化，經過層層修飾，在工作區滴加含有H2O2的磷酸鹽緩沖溶液，連接電化學工作站，實現Pb2+的高靈敏、便攜式檢測。
【專利說明】
比率型電化學發光紙芯片的制備及在鉛離子檢測中的應用
技術領域
[0001]本發明涉及一種電化學發光檢測技術領域，更具體地說是一種適合于鉛離子檢測的三維紙芯片實驗室技術平臺的構建。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著經濟快速發展的同時，環境污染問題日益突出，大氣污染、土壤污染、水污染等問題接踵而至。重金屬離子，如Pb2+，Hg2+等是引起水體污染的主要原因之一，它不僅會對生態系統產生很大的影響，而且對人類健康構成嚴重的威脅。例如，長期暴露在富含Pb2+環境中，會損害人類的中樞系統，甚至會損害人的大腦、肺、腎臟等器官，因此檢測重金屬離子意義重大。目前，重金屬離子的檢測方法主要有以下幾種，包括:分光光度法、電位滴定法、色譜法、熒光方法、電化學方法、光電化學方法以及電化學發光方法等。在這些檢測方法中，電化學發光方法以其靈敏度高、線性范圍寬、操作簡單等優點備受科學家青睞。但是在普通的電化學發光檢測方法中，由于電極所處環境或儀器原因，容易使檢測結果產生假陽性，檢測結果的準確度有待進一步提尚。
[0003]比率型電化學發光檢測方法，是指在一次檢測中，引入兩種電化學發光試劑，通過控制電位，使兩種發光試劑在單次掃描過程中在不同電位下發光，目標物的存在使兩種發光試劑發光強度發生變化，通過測定兩種發光試劑發光強度比值的變化，實現待測物質的檢測。這種檢測方法能夠有效降低外在環境對檢測產生的影響，因此可以提高檢測結果的準確度。
[0004]三維紙基設備，作為一種新興的實驗室檢測平臺，廣泛應用在生物樣品、醫藥、環境診斷等領域。這種紙基設備制備過程簡單，所需紙源儲量豐厚且易于實現集成化及小型化。將比率型電化學發光方法與紙芯片結合，所得三維紙基電化學發光設備具有制備工藝簡單，所需費用低，便于攜帶，測定結果可信度高，有望在資源有限的偏遠地區得到應用，解決水體中重金屬離子檢測的瓶頸問題。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是制作一種操作簡單、易于修飾和攜帶的三維比率型電化學發光紙芯片，以實現Pb2+的靈敏檢測。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明是通過以下措施來實現的:三維比率型電化學發光紙芯片的制備及在鉛離子檢測中的應用，其特征是包括以下步驟:
(1)在計算機上設計如附圖1所示的比率型電化學發光三維紙芯片的疏水蠟批量打印圖案；
(2)將紙片剪裁成常用A4大小的紙，將步驟(I)中設計的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將帶有蠟圖案的A4紙放置到烘箱中，150 °C加熱2 min，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水墻；
(3)采用絲網印刷的方法，將工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟(2)中所得紙上，樣式如附圖2所示，其中右側為工作區，上面印有工作電極，左側為參比區，上面印有參比電極和對電極；
(4)對(3)中親水區域功能化，將CdS量子點功能化的DNA適配體鏈，定義為鏈I，其堿基序列如核苷酸序列表所示，固定在親水區域，隨后用巰基己醇封鎖活性位點，滴加磷酸鹽和H2O2組成的電解液，連接電化學工作站，在-1.5-1.0 V電位范圍內，測定發光強度；
(5)將一定濃度的Pb2+的底物鏈，定義為鏈2，其堿基序列如核苷酸序列表所示，其中至左向右，第十個堿基，也就是堿基A代表腺嘌呤核糖核苷酸，和Pb2+的特異性DNA模擬酶鏈，定義為鏈3，其堿基序列如核苷酸序列表所示，按一定比例混合在一起，43 °C下反應3 h;
(6)將一定濃度的Pb2+加入到步驟(5)所得混合液中，混勻，室溫下反應30min；
(7)將步驟(6)中混合物滴加到步驟(4)所得紙芯片表面，室溫下孵育5h，二次水沖洗掉非特異性吸附的適配體鏈；
(8)將AuO魯米諾功能化的DNA適配體鏈，定義為鏈4，其堿基序列如核苷酸序列表所示，滴加到步驟(7)所得紙芯片表面，室溫下反應，二次水沖洗掉非特異性吸附的適配體鏈，連接電化學工作站，再次測定發光強度；
(9)繪制兩次發光強度比率的變化與Pb2+濃度關系曲線，完成Pb2+的測定；
步驟(2)中所述的紙材料，其特征在于其為一級色譜紙；
步驟(4)中所述親水區域功能化，其特征在于:在紙芯片上生長Ag納米棒:向紙芯片表面滴加40 yL的Ag納米粒子的生長溶液，此溶液中包含15 mM的AgNO3和200 mM的抗壞血酸，室溫下反應20 min，隨后用二次水沖洗表面，室溫下干燥即可。
[0007]步驟(4)中所述鏈I，其特征在于:其特定的堿基序列以及其5’端修飾上氨基，其3’端修飾上巰基。
[0008]步驟(8)中所述DNA鏈4，其特征在于:其特定的堿基序列以及其3’端修飾上巰基。
[0009]本發明的有益效果
(I)比率型電化學發光方法和紙芯片連用，具有便攜式、高靈敏等特點。
[0010](2)紙作為電化學發光檢測基底，具有原料豐富，便于攜帶，易于折疊等特點。
[0011](3)整個比率型紙基電化學發光器件制備過程簡單，所需費用低，有望在資源有限的偏遠地區實現Pb2+的便攜式檢測。
【附圖說明】
[0012]圖1:三維紙芯片的疏水蠟批量打印圖案；
圖2:疏水蠟打印圖案上絲網印刷上工作電極、參比電極和對電極，其中，右側為工作電極，左側為參比和對電極。
【具體實施方式】
[0013]為了更好地理解本發明，下面通過實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明不僅僅局限于下面的實施例。
[0014]實施例1
一種比率型三維電化學發光紙芯片的制備及其在Pb2+檢測中的應用:
(I)在計算機上設計比率型電化學發光三維紙芯片的疏水蠟批量打印圖案； (2)將紙片剪裁成常用A4大小的紙，將步驟(I)中設計的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將帶有蠟圖案的A4紙放置到烘箱中，150 °C加熱2 min，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水墻；
(3)采用絲網印刷的方法，將工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟
(2)中所得紙上，其中右側為工作區，上面印有工作電極，左側為參比區，上面印有參比電極和對電極；
(4)對(3)中親水區域功能化，將CdS量子點功能化的DNA適配體鏈，定義為鏈I，固定在親水區域，隨后用巰基己醇封鎖活性位點，滴加磷酸鹽和H2O2組成的電解液，連接電化學工作站，在-1.5-1.0 V電位范圍內，測定發光強度；
(5)將一定濃度的Pb2+的底物鏈，定義為鏈2，和Pb2+的特異性DNA模擬酶鏈，定義為鏈3，按一定比例混合在一起，43 °C下反應3 h；
(6)將一定濃度的Pb2+加入到步驟(5)所得混合液中，混勻，室溫下反應30min；
(7)將步驟(6)中混合物滴加到步驟(4)所得紙芯片表面，室溫下孵育5h，二次水沖洗掉非特異性吸附的適配體鏈；
(8)將AuO魯米諾功能化的DNA適配體鏈，定義為鏈4，滴加到步驟(7)所得紙芯片表面，室溫下反應，二次水沖洗掉非特異性吸附的適配體鏈，連接電化學工作站，再次測定發光強度；
(9)繪制兩次發光強度比率的變化與Pb2+濃度關系曲線，完成Pb2+的測定。
【主權項】
1.比率型電化學發光紙芯片的制備及在鉛離子檢測中的應用，其特征是包括以下步驟: (1)在計算機上設計比率型電化學發光三維紙芯片的疏水蠟批量打印圖案； (2)將紙片剪裁成常用A4大小的紙，將步驟(I)中設計的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將帶有蠟圖案的A4紙放置到烘箱中，150 °C加熱2 min，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水墻； (3)采用絲網印刷的方法，將工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟(2)中所得紙上，其中右側為工作區，上面印有工作電極，左側為參比區，上面印有參比電極和對電極； (4)對(3)中親水區域功能化，將CdS量子點功能化的DNA適配體鏈，定義為鏈I，固定在親水區域，隨后用巰基己醇封鎖活性位點，滴加磷酸鹽和H2O2組成的電解液，連接電化學工作站，在-1.5-1.0 V電位范圍內，測定發光強度； (5)將一定濃度的Pb2+的底物鏈，定義為鏈2，和Pb2+的特異性DNA模擬酶鏈，定義為鏈3，按一定比例混合在一起，43 °C下反應3 h； (6)將一定濃度的Pb2+加入到步驟(5)所得混合液中，混勻，室溫下反應30min； (7)將步驟(6)中混合物滴加到步驟(4)所得紙芯片表面，室溫下孵育5h，二次水沖洗掉非特異性吸附的適配體鏈； (8)將AuO魯米諾功能化的DNA適配體鏈，定義為鏈4，滴加到步驟(7)所得紙芯片表面，室溫下反應，二次水沖洗掉非特異性吸附的適配體鏈，連接電化學工作站，再次測定發光強度； (9)繪制兩次發光強度比率的變化與Pb2+濃度關系曲線，完成Pb2+的測定； 步驟(2)中所述的紙材料，其特征在于其為一級色譜紙； 步驟(4)中所述親水區域功能化，其特征在于:在紙芯片上生長Ag納米棒:向紙芯片表面滴加40 yL的Ag納米粒子的生長溶液，此溶液中包含15 mM的AgNO3和200 mM的抗壞血酸，室溫下反應20 min，隨后用二次水沖洗表面，室溫下干燥即可。2.根據權利要求1所述的比率型電化學發光紙芯片的制備及在鉛離子檢測中的應用，其特征在于:權利要求1步驟(4)中所述鏈I特定的堿基序列以及其5’端修飾上氨基，其3’端修飾上巰基。3.根據權利要求1所述的三維紙基比率型電化學發光紙芯片的制備及在Pb2+檢測中的應用，其特征在于:權利要求1步驟(8)中所述DNA鏈4特定的堿基序列以及其3’端修飾上疏基。
【文檔編號】G01N21/76GK106018390SQ201610346621
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】李麗, 張彥, 梁琳琳, 葛慎光, 劉海云, 于京華
【申請人】濟南大學