在兩液體間的薄固態界面上成像的方法
【專利摘要】在此描述了一種用于光學顯微工具的流體室，其具有固態膜，該固態膜具有第一側和相對的第二側；位于所述膜第一側的第一流體腔，包括具有第一折射率的第一液體；以及位于所述膜第二側的第二流體腔，包括具有第二折射率的第二液體，其中，第二折射率與第一折射率不同。在此還描述了把單個的生物分子成像的方法，該方法包括在具有不同折射率的第一液體和第二液體之間的固態膜處產生隱失照明場；以及探測位于所述固態膜處的單個的生物分子所連接的光學探測標記所發射的光。
【專利說明】在兩液體間的薄固態界面上成像的方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求于2009年3月26日遞交的第61/211，260號美國臨時專利申請的所有權益。通過參考引用，該專利申請的全部內容被并入本申請。
[0003]政府支持
[0004]本發明是在第HG-004128號合同下，在國家衛生研究院撥款的政府支持下完成的。政府對本發明擁有一定的權利。
技術領域
[0005]本發明是有關光學顯微鏡領域。更具體地，本發明利用兩液體間的薄固態界面改進了生物分子的成像。
【背景技術】
[0006]第一個參照人基因組序列的完成標志著一個時代的到來，基因體變異直接影響了藥物發現和醫療。這個新的范式產生了對便宜和超快的DNA測序方法的急迫需求。在不久的將來，醫療從業者將能夠在臨床場合，在開處方之前常規地分析患者的DNA，并且與記載有和任何藥品相關的基因信息的在線數據庫進行核對。此外，負擔得起的測序技術將改變比較基因組學和分子生物學的研究，允許科學家快速測序來自細胞變異體的整個基因組。為了實現超快和便宜的DNA測序，需要新技術來代替基于Sanger雙脫氧鏈終止協議的經典方法。這些新技術應該解決兩個主要的瓶頸:(I)樣本尺寸應該被降到最低，使得可以從單個的DNA分子或少量的拷貝讀出序列；以及(2)與當前的現有技術相比，讀出速度應該提高幾個數量級。
[0007]固態表面，如氮化硅、氧化硅及其他，已經被很多生物醫學應用所采用，包括組織工程、可植入裝置以及基本研究。薄固態表面已經被用于不同的微米級和納米級結構裝置，如生物傳感和DNA測序應用中所采用的納米縫隙和納米孔陣列。最近有資料顯示氮化硅膜適于作為襯底，以為例如生物分子探測和DNA測序這些應用產生固態納米孔。涉及DNA易位的單分子光學探測的，以及通過固態納米孔解鏈的固態裝置已經被認為對生物傳感和基因組測序非常關鍵。對于通過這些裝置進行單分子的體外光學信號測量，采用顯微鏡的隱失模式非常有用。
[0008]在生物醫學研究和醫療裝置領域，希望能夠利用目標材料通過成像來研究分子、細胞和組織。全內反射熒光顯微鏡(TIRFM或TIRF)就是一項這樣的成像技術。固態材料已經被用于那些情況，然而它們與最新的光學顯微方法不兼容，如TIRF。在現有的技術中，很難把這些固態材料表面帶入另一表面，如蓋玻片的隱失場，并且構造把氮化硅膜和生物樣本帶入TIRF隱失場環境所要求的納米流體通道非常繁瑣。此外，由于微粒所固有的密度(即使在干凈的房間環境里)、在處理這些氮化硅晶圓的過程中所產生的顆粒物以及這些氮化硅膜芯片的溫度約束限制，用氮化硅表面密封這些納米孔非常困難。

【發明內容】

[0009]本發明的實施例通過橫亙這些固態膜的兩介質之間的折射率匹配的TIRFM(全內反射熒光顯微鏡)，在這些固態膜(攜帶納米孔裝置和其他生物樣本)處實現了隱失模式激發。這使得可以獲得膜上的一個或者更多生物分子的高分辨率、高對比度以及高感光度圖像。
[0010]根據本發明的一個方面，披露了光學顯微工具的流體室，其包括具有第一側和相對的第二側的固態膜，位于膜第一側的第一流體腔，該第一流體腔包括具有第一折射率的第一流體，以及位于膜第二側的第二流體腔，該第二流體腔包括具有第二折射率的第二流體，其中，第一折射率高于第二折射率。
[0011]固態膜可以是氮化硅、氧化硅、氧化鋁、氧化鈦或其他介電材料。
[00?2 ]固態膜可以包括沉積在娃晶圓上的氮化娃層。該氮化娃層可以是5?50nm厚。該娃晶圓可包括一窗口，所述氮化硅層覆蓋或延伸跨越該窗口。
[0013]第一液體可以是水性緩沖溶液或水。第二液體可以是細胞液、細胞膜或甘油。第一液體可以是濃縮的尿素溶液或CsCl溶液。
[0014]可以在所述膜的第二側提供連接到光學生物標記的生物分子。該生物分子可以是DNA分子。該生物分子可以是RNA分子。該生物分子可以是蛋白分子。該光學生物標記可以是易激發的熒光團。
[0015]第一液體腔可以是微通道。
[0016]固態膜可以包括至少一個納米孔，在一些實施方式中，其包括多個納米孔。這些納米孔可以排布成圓形或多邊形陣列。
[0017]根據本發明的又一方面，披露了用于把單個的DNA分子成像的光學顯微工具，其包括流體室，該流體室包括覆蓋硅晶圓的窗口的固態膜，位于該固態膜一側的第一液體腔，該第一液體腔內的具有第一折射率的第一液體，位于該固態膜另一側的第二液體腔，該第二液體腔內的具有第二折射率的第二液體，其中，第二折射率低于第一折射率;蓋玻片，流體室安置在蓋玻片上，使得蓋玻片形成所述第一液體腔的底面;物鏡;物鏡和蓋玻片之間的浸鏡油;光源，被設置成把光導向所述物鏡，所述物鏡被設置成把所述光聚焦，使得產生小于所述固態膜覆蓋的窗口的隱失照明場；以及圖像探測器，探測所述固態膜處的單個的DNA分子發出的光。
[0018]所述光源可以包括至少一個激勵激光器，在一些實施方式中，包括多個產生不同波長激光束的激光器。所述圖像探測器可以包括電子倍增電荷耦合器件(CCD)攝像機或光探測器。
[0019]生物素-鏈霉親和素化學法可被用于把單個的DNA分子固定在所述固態膜上。
[0020]根據本發明的又一方面，披露了用于成像單個的生物分子的光學顯微工具，其包括用于產生位于固態膜的隱失照明場的裝置，該固態膜位于具有不同折射率的第一液體和第二液體之間；以及用于探測位于所述固態膜上的單個的生物分子所連接的光學標記發射出的光的裝置。
[0021]所述用于產生位于固態膜的隱失照明場的裝置可以包括激勵激光器和聚焦透鏡。所述用于探測由光學標記發射的光的裝置可以包括光探測器或電子倍增CCD攝像機。
[0022]所述光學顯微工具還可以包括用于把所述單個的生物分子固定于所述固態膜的
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[0023]所述隱失照明場可以小于所述固態膜的尺寸。
[0024]根據本發明的又一方面，披露了成像單個的生物分子的方法，其包括在固態膜處產生隱失照明場，該固態膜位于具有不同折射率的第一液體和第二液體之間；以及探測位于所述固態膜的單個的生物分子所連接的光學標記發射的光。
[0025]所述方法還包括把所述單個的生物分子固定于所述固態膜。
[0026]從所述探測到的光產生圖像。
[0027]根據本發明的又一方面，披露了成像單個的DNA分子的方法，其包括把光導向光學顯微工具的物鏡；引導光穿過第一液體;在氮化硅膜處反射該光以在第二液體內產生隱失照明場；以及把所述隱失照明場激發的并連接至所述單個的DNA分子的光學標記所發射的光導向成像探測器。
[0028]所述隱失照明場可以在所述第二液體內產生。所述單個的DNA分子可以被固定在所述第二液體內氮化硅膜上。
【附圖說明】
[0029]圖1是根據本發明一個實施例的流體室的示意圖。
[0030]圖2是根據本發明一個實施例的流體室的界面的透視圖。
[0031 ]圖3是根據本發明一個實施例的界面處TIR的示意圖。
[0032]圖4是根據本發明一個實施例的光學顯微工具的示意圖。
[0033]圖5是根據本發明一個實施例的在TIRF下成像的單個的DNA分子的熒光圖像。
[0034]圖6是根據本發明一個實施例的DNA測序方法的示意圖。
[0035]圖7是根據本發明一個實施例的利用一比特(a)和兩比特(b)DNA讀出的同時進行電子光學探測的示意圖。
[0036]圖8是根據本發明一個實施例的多色光學顯微工具設置的示意圖。
[0037]圖9是根據本發明一個實施例的孔定位計數的直方圖。
[0038]圖1OA和1B根據本發明的一個實施例展示了多孔探測中的額外步驟，包括從多個孔同時讀出(圖10A)和多個比特的同時讀出(圖10B)。
[0039]圖11是根據本發明一個實施例的流體室的示意圖。
[0040]圖1IA是根據本發明一個實施例的圖11所示的流體室的詳細示意圖。
[0041]圖1IB是根據本發明一個實施例的圖11所示的界面的詳細示意圖。
[0042]圖12是根據本發明一個實施例的在TIRF下成像的單個的DNA分子的熒光圖像。
[0043]圖13是根據本發明一個實施例的分析硬件的方塊圖。
[0044]圖14A?C根據本發明一個實施例展不了電和光信號的同步。
[0045]圖15A?15B根據本發明一個實施例展示了DNA分子穿過納米孔的過程。
[0046]圖16A?16B展示了在如圖15A?15B所示的穿過事件過程中，電和光信號的同步。
[0047]圖17是根據本發明一個實施例的界面處TIR的示意圖。
【具體實施方式】
[0048]本發明的實施例是有關通過厚度為納米級的固態膜成像單個的分子和生物材料的方法。該方法具有優勢，因為除了可以對單個的分子和生物材料進行傳統的電測量外，還可以進行光學(如熒光)測量。在一個實施例中，通過兩易混的/不相混的液體間的薄固態界面，在隱失模式下成像單個的分子或生物材料。流體室提供了具有不同折射率的兩易混液體間的固態界面。該固態界面的厚度可以是幾納米或幾十納米，并可以用氮化硅、氧化硅和/或類似物制成。
[0049]可以在所述兩液體上施加電勢，使得生物分子(如DNA、RNA或蛋白)穿過所述固態界面中的納米孔或納米孔陣列。在DNA易位中，單鏈DNA分子被電泳驅動，以單列形式穿過納米孔。在該實施例中，通過生物化學轉化，目標DNA序列的每一堿基首先被映射至2或4單元代碼，2 10-20bp核苷酸序列。接著，這些2-單元或4-單元代碼被雜交成互補的，熒光標記的，以及自我猝滅的分子信標。因為在穿過納米孔的易位過程中，分子信標是連續地解鏈，它們的熒光標記沒有滅失，并且由單色或多色(如兩種或更多顏色)全內反射熒光顯微鏡(TIRF)讀取。接著，把獲得的單色或多色光學信號關聯至所述目標DNA序列。
[0050]本發明的實施例有優勢，因為其可以獲得高分辨率和高感光度的單個的生物分子或生物材料的圖像，這些生物分子或生物材料被固定在所述固態界面上，位于“厚”的水性液體層(即高折射率液體)之上。更具體地，通過在所述“厚”的水性液體層內的深處實現隱失場，在該薄固態界面處的分子或生物材料的高光學對比度探測可被用于成像所述單個的生物分子或生物材料。
[0051 ]圖1展示了本發明一個實施例的流體室。如圖1所示，流體室100包括第一腔104和第二腔108。第一液體112在第一腔104內，而第二液體116在第二腔108內。如此選擇該兩液體112和116，使得它們具有不同的折射率。第一液體112的折射率比第二液體116的高。這樣選擇兩液體112和116的折射率，以在界面120處達成全內反射(TIR)。例如，第一液體112可以是細胞質U= 1.36)或細胞膜(η = 1.47)，而第二液體116可以是水性緩沖溶液(η =1.33)。在又一實施例中，第一液體112含有鹽。兩液體112和116均為水性溶液。
[0052]流體室100還包括界面120。界面120包括固態膜124。界面120位于第一腔104和第二腔108之間，以把兩液體112和116隔離。兩液體112和116之間的界面120使得可以發生全內反射(TIR)。更具體地，TIR照明在固態膜124(如SiN膜)處發生，并且在第一腔104內產生隱失波。界面120，尤其是膜124形成了生物分子互動的基底。
[0053]圖2詳細展示了界面120。如圖2所示，界面220包括具有窗口224的芯片228。芯片228作為框架支持覆蓋窗口 224的固態膜。該芯片的尺寸的例子可以是5mm*5mm*300ym，而該膜的尺寸的例子可以是50μηι*50μηι*5?50nm。界面220可以用任何合適的固態材料(如娃基材料)，以傳統的技術制成，包括化學氣相沉積(CVD)、濕蝕刻以及光刻法。
[0054]在一個實施例中，芯片228是硅，并且覆蓋有氮化硅膜。可以理解，該膜可以是任何能形成薄膜的介電材料。膜的材料的其他例子包括氧化硅、氧化鋁、氧化鈦等。芯片材料的其他例子包括玻璃、熔融硅石、石英等。
[0055]在此描述的固態膜的厚度可以是大約5?60nm。例如，固態膜可以是大約1nm厚。然而，可以理解，可以根據兩易混液體間由TIR照明產生的隱失波的期望的尺寸和衰減，來選擇所述膜的厚度，其可以小于5nm或大于60nm。膜的納米級厚度幫助界定了兩液體間界面的清晰的邊界，TIR就在該界面處發生。
[0056]可以理解，在一些實施例中，固態膜可以包括納米孔、納米縫隙或納米孔陣列。這些納米孔(I?10nm)或納米孔陣列跨越界面連接了這些液體。固態納米孔具有可調的尺寸，并且可以承受較大范圍的溫度、PH以及化學變化。可以用例如Ar離子束或電子束雕刻，或反應性離子蝕刻等方法來制作納米孔。
[0057]圖3展示了設于普通顯微鏡蓋玻片240上的流體室100，用于和光學顯微工具一起進行基于TIR的測量。蓋玻片240設于物鏡236上，蓋玻片240和物鏡236之間有浸鏡油238。一種或更多連接至光學標記，例如熒光團，的生物分子或生物材料被固定在膜224上，以進行成像。
[0058]光學標記可以是任何暴露于隱失波時照明或者發射輻射的材料。光學生物標記的例子包括熒光丙烷或熒光共振能量轉移(FRET)標記(如熒光團)、量子點或有機化合物。如業界一般技術人員所能理解的，可以利用已知的技術把光學生物標記和目標生物分子締合，例如共價或非共價締合。在本發明的一個實施例中，光學標記可以是化學綴合的。在本發明的一個替代實施例中，可以通過融合把生物分子和光學標記締合，如綠熒光蛋白融合至細胞受體或信號分子。
[0059]激光束242被聚焦于物鏡236的后焦面。由于浸鏡油238和蓋玻片240之間的折射率匹配，光反射進入介質I 216。在膜224處，由于兩液體212和216的折射率不匹配，光全內反射246。當光從更高折射率介質(更稠)到更低折射率(更稀)介質，其反射離開表面的法線。當該兩介質的界面處的入射角大于臨界角時，光全內反射回較稠的介質內。在較稀的介質內產生隱失波246，其具有指數衰減強度，可激發膜224表面的熒光團(激發光的“趨膚”深度的數量級一般為幾十納米)。由激發熒光團250產生的光可被位于蓋玻片240下方的物鏡236聚焦，被成像裝置測量，如CCD攝像機或光探測器。
[0060]在一個實施例中，這樣產生光，使得隱失波246的面積小于膜224的面積。在又一實施例中，這樣產生光，使得隱失波246的面積等于膜224的面積。
[0061]可以理解，在一些實施例中，可利用各種刺激劑，用膜上的納米孔、納米縫隙或納米孔陣列來局部刺激活細胞表面。利用在此描述的隱失模式成像，在細胞膜的末端位置，可以測量對這些刺激的響應。
[0062]生物分子或生物材料(如細胞)可被直接放置于將被成像的膜224上。作為替代方案，可以在膜224和將被成像的生物分子或生物材料之間提供薄的緩沖或中間層。例如，有機聚合物薄層可被用作該中間層。
[0063]圖4展示了根據本發明一個實施例的光學顯微工具400的一個例子。可以理解，顯微工具400的元件和元件的設置可以與如圖4所示的不同。顯微工具400包括激光源402、x軸位移臺406、透鏡414、透鏡418、白光源422、偏振分光鏡(PBS)426、透鏡430、物鏡436、雙色鏡(DM) 468、濾鏡472、反光鏡476、透鏡480以及探測器484，如CXD。流體室被置于蓋玻片440上，該流體室包括第一液體412，折射率不同于第一液體412的第二液體416，以及固態膜424。在蓋玻片440和物鏡436之間提供浸鏡油。
[0064]在所展示的顯微工具400中，激光或白光可被用于進行全內反射熒光顯微。在一個實施例中，激光410由激光源402產生，并且由透鏡414和418導向和整形。透鏡430被配置成降低激光束的光斑大小。可以理解，透鏡414和418也可以降低激光束的光斑大小。利用X軸位移臺406沿X軸移動光纖親合器，可以使光偏移光軸。在又一實施例中，白光由白光源422產生。在又一實施例中，白光和激光均可被用于進行全內反射熒光顯微。分光器426被配置成把由激光源和/或白光源422產生的光導向第一液體412內的樣本(如生物分子)。在又一實施例中，可以同時使用多個激光波長，或者一次使用一個波長，來激勵單色或多色熒光團。
[0065]經過透鏡430和雙色鏡468后，所產生的光被物鏡436所限制，從而足夠導致全內反射的光被導向樣本。可以理解，物鏡436可以進一步降低激光束的光斑大小。可以理解，激光束的光斑尺寸可以是直徑大約為0.5?1臟。透鏡414、418、430和/或436收斂光束，使得光束在硅膜處產生的光點的尺寸為直徑大約為5μπι至大約與膜424的面積相當。例如，如果膜424的尺寸為50*50μπι2，那么可以產生尺寸為5?50μπι的光點。
[0066]光442在固態膜424處全內反射至蓋玻片440，從而在第二液體416內產生隱失場。位于固態膜424附近的熒光團被隱失波激發，其使得熒光團發射熒光。接著，熒光和反射光452被雙色鏡468導向濾光鏡472。雙色鏡468和濾光鏡472過濾光，使得只有熒光發射通過。反射鏡476引導熒光通過透鏡480到達探測器484。
[0067]探測器484可以是EMCCD攝像機，比如可以從北愛爾蘭貝爾法斯特的AndοrTechnology pic.(Andor)處購買的iXon BV887。探測器484的其他例子包括雪崩光電二極管(APD)和光電倍增管(PMT)。探測器484可以連接至合適的成像系統，比如基于微軟Windows的個人計算機和成像軟件，比如Solis軟件(也來自Andor)，用于處理由探測器484產生的數據信號，以產生圖像或一系列圖像。定制的軟件可用于分析這些數據信號，探測熒光發射，并確定受檢測的生物分子或生物材料的序列或其他特征。
[0068]可以理解，界面處TIR激發的面積取決于激發光束的性質。利用已知的光束整形技術可以把激光束整形，以控制TIR模式下的激光照明場。這樣，就可以根據需要提高或降低光束的直徑，或將其拉長。
[0069]圖5展不了用顯微工具，如顯微工具400，產生的圖像的例子。在圖5中，展不了一個示例性樣本的TIRF照明504的視野。圖5還展示了用具有兩個代表性液體的顯微工具成像的單個的熒光DNA分子508，具體而言，這兩種液體是7M CsCl (η = 1.416)和8M尿素(η =1.416)。然而，可以理解，根據本發明的實施例，可以用其他液體來成像單個的生物分子。在圖5中，單個的DNA分子在氮化硅膜上被成像，信號背景比約為2.5，圖像獲取為5幀每秒。
[0070]圖6?1B展示了本發明的一個實施例，其中膜124包括納米孔600。如圖6所示，包括具有納米孔610的膜124尤其適用于利用DNA易位進行DNA測序。可以理解，包括具有納米孔600的膜124的實施例并不限于利用DNA易位進行DNA測序。例如，該實施例可以適用于基因型鑒定應用、生物分子成像以及生物分子篩選。在又一例子中，可以通過納米孔600把蛋白成像。
[0071]在DNA易位中，單鏈DNA分子被電泳驅動以單列的方式穿過納米孔600。可以理解，在這些實施方式中，流體室100還進一步包括與電源連接的電極，其被配置成產生施加于液體112和116的電勢，以電泳驅動DNA分子穿過納米孔600。
[0072]在圖6中，待探測的連接至光學標記的單個的生物分子是與代表核苷酸A、T、U、C或G的序列代碼雜交的寡核苷酸。在一個實施例中，光學標記是特異性報告所述DNA序列的熒光標記。在標記操作的一個例子中，原始的DNA是核苷酸基團取代的(每一堿基型由3?16個核苷酸的唯一序列取代)。這樣，在納米孔測序的過程中，當雜交寡核苷酸從待測序的編碼的核酸解鏈時，可以探測到連接至光學標記的寡核苷酸。
[0073]例如，在DNA轉換操作中，原始DNA序列中的每一堿基由2個二進制代碼單元的唯一組合表示(開口圓和實心圓分別標記為O和I)。在該例子中，O和I被定義為10個核苷酸的唯一DNA序列，分別為“S0”和“SI”。被轉換的單鏈DNA與兩種分子信標雜交，該兩種分子信標與所述2個代碼單元互補，并且該被轉換的單鏈DNA顯示最小的橫截面。例如，一個信標可以在5’端含有紅色熒光團并在3’端含有猝光劑Q，而另一信標可以在5’端含有綠色熒光團并在3’端含有相同的猝光劑分子。廣譜猝光劑Q對兩種熒光團都有抑制作用。這兩種不同顏色的熒光團使得可以區分這兩個信標。在又一DNA轉換操作中，原始DNA序列中的每一堿基由四個獨特代碼(序列)中的一個來表示，接著，這四個代碼分別與對應的4色分子信標雜交。在這兩個操作中，經轉換的DNA序列誘導相鄰的信標的排布，使得相鄰信標上的猝光劑抑制熒光發射，從而使DNA保持“暗”，直至各代碼單元被相繼地從DNA去除(除了第一個信標)。可用于本發明的熒光團的例子包括TMR和Cy 5。可采用的其他類型的熒光分子包括CPM，Invitrogen提供的Alexa系列焚光標記，焚光紅家族，以及德克薩斯紅。業界技術人員所知的其他信號分子也在本發明的范圍之內。可用于本發明的多種其他熒光團包括美國專利第6，528，258號中所列的那些，通過參考引用，其全部內容被并入本申請。可用于本發明的猝光分子包括Dabcyl、Dabsyl、甲基紅以及El Ie粹光劑。業界技術人員所知的其他粹光分子也在本發明的范圍之內。這顯著降低了由相鄰分子和溶液中的自由信標所造成的熒光背景，從而獲得較高的信號/背景比。
[0074]請再參圖6，與經轉換的DNA互補的熒光標記的寡核苷酸與所述DNA雜交，接著，通過電泳將該分子驅動通過膜124中的納米孔600。當探測到由粘附的熒光團發出的不同顏色的閃光時，納米孔600把寡核苷酸一個一個地從經轉換的DNA相繼剝離。當該分子被引入納米孔，信標被一個一個地剝離。每次當一個新的信標被剝離，就有一個新的熒光團被取消抑制并被顯微鏡記錄。被釋放的信標被自動關閉，抑制其自己的熒光，然后其擴散離開納米孔的附近。一旦第一信標被釋放，來自第二信標的新的熒光團被點亮。
[0075]DNA易位速度由DNA解鏈動力學調節，通過采用光學探針(或信標)獲取堿基之間的對比。DNA進入納米孔600把離子電流突然降低到隔斷的水平。當DNA從另一側出來，恢復開孔電流水平。合適的電壓可被用來調節DNA解鏈的時間(例如I?1ms)。例如，對于10_bp發夾序列，120mV的電壓所導致的解鏈時間大約為10ms。用電場強度來調節該時間，以優化信號/背景水平。
[0076]在這樣的方式下，可以確定任何核酸的序列。對把被測序的核酸轉換為編碼的序列、編碼系統以及納米孔測序的詳細描述請參Soni和Meller(Soni G.V.and Meller A.，Progress towards ultrafast DNA sequencing using sol id-state nanopores,Clinical Chemistry 53，11 (2007))，Meller等在2009年的發表(U.S.Patent Applicat1npublicat1n 2009/0029477)，以及Meller和Weng(PCT Applicat1n N0.PCT US 2009/034296)。通過參考引用，這些參考文獻的全部內容被并入本申請。可以理解，該方法可用于平行納米穿孔陣列。
[0077]圖7展示了用I比特(如圖7(a))和2比特(如圖7(b))編碼的納米孔測序色彩。如圖7所示，在此描述的裝置和方法使得可以同時電和光探測I比特和2比特DNA讀出，并且具有較高的信噪比和單個的熒光團分辨率。
[0078]可以利用多色光學顯微工具實現2比特色彩編碼，比如，如圖8所示的多色TIRF顯微鏡。在如圖8所示的實施例中，兩個具有不同波長的激光源802a和802b可被單獨或同時點亮，以產生具有不同波長的隱失波，從而單獨或同時激勵不同光學標記。類似地，對于3個或更多色彩編碼系統，可以單獨或者同時點亮三個或四個具有不同波長的激光源，以產生三個或更多具有不同波長的隱失波，從而單獨或同時激勵不同光學標記。
[0079]如圖8所示，第一激光源802a產生第一激光束810a，第二激光源802b產生第二激光束810b，第一和第二激光束810a和810b由透鏡L整形并被導向物鏡836。透鏡L被配置成降低由第一和第二激光源802a和802b產生的激光束810a和810b的光斑尺寸。在一個實施例中，激光源802a和802b是可以照明樣本的藍色和紅色二極管激光器(488nm和640nm)的組合。如以上結合圖4所描述的，光802a和802b在膜124處發生全內反射，從而產生隱失場，其激勵連接至在流體室內待成像的生物分子的熒光團。在如圖8所示的實施例中，膜124包括納米孔600，其使得可以進行如上所述的DNA易位。
[0080]接著，利用物鏡836收集熒光850，由雙色鏡DM和濾鏡F過濾并導向探測器884，比如用于成像的幀轉移冷卻式電子倍增電荷耦合器件攝像機或光探測器。探測器884可以連接至合適的成像系統來處理由探測器884產生的數據信號，以產生一幅或一系列圖像，成像系統比如基于微軟Windows的個人計算機和成像軟件，例如SoI i s軟件(也是由Andor提供)。定制的軟件也可以用于分析這些數據信號，探測熒光發射，以及測定待測的生物分子(如DNA)的序列或其他特性。
[0081]圖9展示了在DNA解鏈時，圖8所示的多色光學顯微工具的孔定位計數直方圖的一個例子。
[0082]可以理解，可以利用在此描述的實施例實現納米孔陣列的光學成像。例如，在此描述的光學成像可被用于從如圖1OA所示的多個孔同時讀出，和/或如圖1OB所示同時讀出多比特。
[0083]本發明的實施例還可用于成像細胞或組織粘附，以研究細胞毒性以及與固態材料的生物相容性，如SiN膜。
[0084]本發明的實施例還可用于通過納米孔、納米縫隙或納米孔陣列，以穿過界面的介質中的刺激劑局部地激勵細胞，并通過膜，利用光學顯微鏡測量細胞的反應。細胞對與新生物材料(比如SiN膜)或刺激劑的接觸的反應，可以用細胞膜上生物標記的熒光讀出來測量。
[0085]在熒光標記的核酸或其他生物聚合物穿越或暫時嵌入固態膜中的納米孔的過程中，本發明的實施例可以用于以單分子分辨率成像這些核酸或其他生物聚合物。
[0086]本發明的實施例還可用于測量連接至在納米孔中易位或暫時嵌入納米孔的生物聚合物的熒光標記的蛋白的化學計量比，生物聚合物比如DNA。
[0087]本發明的實施例還可用于多色探測，從而可用于探測連接至DNA的生物獨特的蛋白的空間定位。
[0088]本發明的實施例還可用于通過納米孔進行DNA測序，以及高通量藥物篩選。
[0089]可以理解，可以根據應用，通過改變光束直徑和/或入射激光束的形狀來改變TIR照明場的尺寸。
[0090]在一個實施例中，如圖17所示，物鏡236a可被置于cis腔208之上，而非trans腔204之下。物鏡236a可用于成像。在該設置中，可利用透鏡236b而非物鏡236a把激光束242聚焦于膜224。如以上結合圖3的描述，由于浸鏡油238和蓋玻片240的折射率匹配，來自激光器(通過透鏡236b)的光242反射進入介質I 216。在膜224處，由于兩液體212和216的折射率不匹配，光發生全內反射246。在較稀的介質即介質I 216內產生隱失波246，其具有指數衰減的強度，可激勵膜224表面的熒光團(通常，激發光的“趨膚”深度為數十納米)。由被激勵的熒光團產生的光可以由置于cis腔208上方的物鏡236a聚焦，并由CCD攝像機484或光探測器測量。
[0091 ] 例子
[0092]例I
[0093]樣本幾何尺寸
[0094]以標準的光刻法，在通過LPCVD鍍有SiN層的硅晶圓上，制作在中心處具有獨立的20?50nm厚的氮化硅窗口 [50μπι*50μπι]的硅芯片[5mm*5mm*300ym]。如圖3所示，設計了具有兩部分PTEE/CTFE的流體室，以把這些芯片安置于蓋玻片之上，在芯片和蓋玻片之間形成2?ΙΟμπι厚的微通道。微通道即trans腔204充有具有較高折射率的液體(70%甘油[η =1.42])，而cis腔208充有溶于水的樣本溶液緩沖液[η = 1.33]。
[0095]TIRF設置和光束示意圖
[0096]如圖4所示設置全內反射(TIR)顯微鏡。激光束光斑尺寸被降低至0.7mm，射入市場上可買到的倒置顯微鏡(Olympus IX-71)的定制設計的后光埠，并通過外部安裝的200mm焦距透鏡聚焦于60X 1.45NA油浸TIRF物鏡的后焦面。通過沿X軸移動激光光纖耦合器，使得激光點偏離光軸。選擇玻璃的折射率[η= 1.52]、70%甘油的折射率[n = l.42]以及樣本緩沖液的折射率[n=l.33]，使得光反射穿過tans腔內的油、蓋玻片以及70%甘油，直至到達氮化硅膜處的甘油-水界面。在該界面處，TIR模式的臨界角與Snell定律中所描述的玻璃-水界面的相同，
[0097]IlglassS ill ( Qglass ) — IlglyS ill ( Qgly ) — IlwS ill ( 9w)
[0098]其中，n表示玻璃、70%甘油或水的折射率，而Θ表示對應界面處的入射角。視野的中心沿光傳播的方向偏移，其取決于高折射率液體層的厚度。在經過合適的光學濾鏡后，用外部透鏡把熒光發射放大3倍，由同一物鏡收集并成像于可購買獲得的EMCCD攝像機(AndoriXon BV887)。用供應商提供的Andor Solis軟件或定制編寫的軟件來進行成像。
[0099]樣本固定
[0100]DNA分子[57bp]購自IDT Tech，在5’端具有生物素共軛，在從5’端起的位置20處具有胺修飾的胸腺嘧啶堿基。用供應商的方法，以ATT0647N染料分子[ATTO-tech]標記DNA分子。用生物素-鏈霉親和素化學法把DNA分子固定在氮化硅表面。用新鮮制備的Piranha溶液(在容積比為7: 3的硫磺酸和過氧化氫溶液中清洗15分鐘)清潔表面，再用D1-水充分沖洗。在0.lmg/ml的BSA-生物素中培養表面過夜，用結合緩沖液[1mM Tris-CL pH8.5 ]沖洗，在
0.lmg/ml的鏈霉親和素中培養30?60分鐘，用結合緩沖液沖洗，再以生物素標記的DNA培養15?30分鐘。接著，表面被安裝在流體室內。在蓋玻片和硅芯片之間的trnas微通道內充70%甘油，并在cis腔內充結合緩沖液。然后在氮化硅界面處用TIRFM把表面成像。
[0101]結果
[0102]如圖4所示，氮化硅膜(例如，尺寸為20*40μηι2，厚度為20nm)安裝在蓋玻片上。選擇trans和cis腔內的兩種液體分別為甘油70% (ν/ν) (η = 1.42)和水(η = 1.33)。
[0103]如圖5所示，把激勵激光束整形至形成小于膜尺寸的隱失照明場。通過降低光束直徑至0.7_，光斑尺寸小于SiN膜的尺寸。
[0104]進入物鏡(η = 1.55)的光傳播經過浸鏡油(η = 1.52)、蓋玻片(η = 1.55)、液體2(70%甘油)(η = 1.42)，穿過界面，最終穿過水(η=1.33)。該光束在界面處發生全內反射，該界面把甘油和水分開。
[0105]為了校準激勵場的幾何尺寸，在膜的cis側吸收20nm的TMR珠，并在TIRF模式下成像。通過沿X和Y軸移動這些TMR珠，以及利用成像光學組件的放大因子，計算獲得隱失照明場大約為10*20μηι2。
[0106]在該例子中，用生物素-鏈霉親和素化學(即方法和材料)，把在3’生物素化并在5’以ΑΤΤ0647Ν標記的單個的DNA分子固定在氮化硅表面的cis側。
[0107]例2
[0108]TIRF 設置
[0109]在實驗中，包括獨立的SiN膜(20*20μπι2)1124的硅芯片1128被用作界面，其中，該SiN膜具有納米孔600。該硅芯片1128被安放在蓋玻片1140上，而該蓋玻片1140被安放在定制的三氟氯乙烯(CTFE聚合物)流體室1138上，以產生如圖11所示的微流體trans腔1100。該流體室1138包括保持硅芯片1128的嵌入件1138a和外細胞1138b，以形成所述流體腔。快速硬化的聚二甲硅氧烷(PDMS)薄層被用于把硅芯片1128和CTFE嵌入件1138a粘合，以及把蓋玻片1140和外細胞1138b粘合。具有嵌入件1138a的流體腔是cis腔，而硅芯片1128和蓋玻片1140之間的空間是trans腔。利用輸入-輸出流通道在trans腔內充折射率緩沖液1112。為了進行電測量，在流通道的側開口內提供trans電極1140a，cis電極1140b被浸入嵌入件(均為Ag/AgCl) 1116內的緩沖液。如圖1IA所示，納米孔600用于把流體室1100與倒置顯微鏡1136對齊，以進行光學成像和測量。
[0110]Cis腔內使用的緩沖液nw?1.33(水緩沖液，IM KCl和1mM tris，pH 8.5)和trans腔內使用的緩沖液(具有較高折射率nCs的水性緩沖液)的折射率小于玻璃的折射率ng= 1.5(1^〈1^〈?)。更具體的，含有71 CsCl和1mM tris的pH 8.5的鹽緩沖液(“Cs7M”，n= I.4)被用作cis腔內的緩沖液。
[0111]如圖1lB所示，以小于玻璃/trans腔界面的臨界反射角但稍大于trans/cis臨界角的角度Gg從蓋玻片側引入平行光束，以在SiN膜處產生TIR激勵。用大數值孔徑(NA)的物鏡(Olympus 60X/1.45)來實現TIR，通過把入射激光束聚焦在其后焦面(d)上的軸外點上，從而控制入射角Qg JIR激勵區域的平面位置被位移距離d = h*tan(0Cs)，其中，h是trans腔的高度。
[0112]用長焦距的消色差雙合透鏡(200mm)整形入射激光束的寬度，使得SiN膜上被照明的面積大約為10*2(^1112。通過單模保偏光纖把64011111激光器(20111￥)(丨？1612000，？0丨1^-Source，英國)耦合至系統，產生直徑為0.7_的準直高斯激光束。這樣的高質量光束保證了物鏡入口處的緊聚焦點，從而降低不希望的散射。用普通工藝在膜表面的cis側用鏈霉親和素涂層。每一個均標記有單個的ATT0647N熒光團的短的生物素化的DNA寡核苷酸被固定在膜表面，并通過把熒光投射在工作在最大EM增益和1ms積分下的電子倍增CCD攝像機上進行成像。電子倍增電荷親合器件(EMCCD)攝像機(Andor，iXon DU-860)被用于記錄來自膜表面的熒光圖像。圖12展示了根據本發明一個實施例的，在TIRF下成像的，固定在膜表面的單個的分子的三個典型的圖像。如圖12所示，以高對比度分辨了單個的熒光團，從而無需進一步的圖像處理。
[0113]隨著入射角的提高，TIR的臨界角導致(I)在膜的cis側觀察到的激光的突然消失，
(2)出現移位的TIR激光束，用顯微鏡的目鏡在物鏡的后焦面上成像，以及(3)背景強度的突然降低，這為單個的分子成像提高了信號/背景比。在落射光照明下(從樣本的一側照明和探測)，實現了固定在SiN膜上的單個的熒光團的圖像的信號/背景比的多2倍的提高。
[0114]光和電信號的同時探測
[0115]為同時探測光和電信號設計了硬件(如兼容微軟Windows或Linux的個人計算機)和LABVIEW軟件的組合。圖13示意性地展示了獲取硬件。Axopath 2008放大器1386(Molecular Devices公司，Sunnyvale，加利福尼亞州，美國)通過探頭1388連接至Ag/AgCl電極，以放大穿過納米孔的離子電流信號。用外部四極巴特沃斯濾波器1390在50KHz處對離子電流信號進行低通濾波，并輸入PC內的多功能數據采集卡1392，該PC通過數據采集卡1394(Andor iXon采集卡)從CCD攝像機接收圖像數據。該多功能數據采集DAQ卡1392(Nat1nal Instruments，PCI_6154)在16比特模數轉換分辨率下獲取離子電流信號。來自EM-CCD攝像機1384的“觸發”脈沖(表示每一曝光開始的TTL脈沖)觸發離子電流采集，并用于在計數卡(Nat1nal Instruments，PCI_6602)上產生精確的時間戳。利用具有250KHz時鐘頻率的RTSI總線在內部使計數卡與DAQ卡同步。因此，組合的數據流包括每一 CCD幀開始時的唯一時間戳，其與離子電流采樣同步。當通過離子電流的下降探測到易位事件，軟件1396在計數信息中搜索相應的幀號，并存儲對應該幀號的實際圖像。攝像機的幀速率被設置為大約IKHz (觸發脈沖頻率)。
[0116]圖14A?C展示了電和光信號的同步。由信號發生器產生的毫秒長的電子脈沖被電耦合至所述放大器探頭。這些電流脈沖的形狀和時間量程與納米孔信號相似。用同樣的信號開/關調制激勵激光器，提供同步的光源和電子脈沖。為了進行同步測試，熒光珠被固定于所述膜上，并用以上描述的攝像機成像。
[0117]在DNA通過納米孔易位的過程中，組合這兩種模式來測量同步的光和電信號。首先在所述膜上確定孔的位置。來自孔的熒光信號在位置上是穩定的，并且與所述電信號同步點亮。這樣，對應孔位置的像素隨時間累積最高的熒光強度，這些圖像的總和在對應該孔在CCD上的位置處展示了一峰值。一旦確定了該孔的位置，來自對應該孔的像素的強度被用于進一步的數據分析。
[0118]例3
[0119]實施光和電信號的同時測量，以探測穿過4nm孔的以熒光團標記的dsDNA。在該實驗中，樣本濃度為0.1nM?0.2nM。圖15A?15B示意性地展示了孔的幾何尺寸以及大約為4nm的孔的例子的TEM照片。在與胺基反應性染料共軛之前的酶聚合鏈反應(PCR)過程中，采用與低濃度胺基修飾的胸腺嘧啶堿基結合的以Alexa647熒光團標記的421bp片段(DNA-A1647)。
[0120]如圖16A?16B所示，展示了當在孔的cis側加了 DNA-A1647分子后，九個有代表性的離子電流及其對應的熒光強度(200mV偏壓產生4nA的開孔電流;在最大EM增益下，以Ims積分獲取圖像)。按以上描述的方法確定孔的位置。所展示的熒光強度是從CCD上以納米孔為中心的3*3像素區域提取獲得。可以理解，電流和光學數據的同步采集有助于為每一事件定義內部背景閾值。電事件之前大約5ms時，孔位置處的強度被作為該事件的背景值。只有其中孔位置處的強度比對應的背景高出至少一個標準偏差的光事件才被包括在分析中，以保證該事件具有有意義的背景閾值，以消除亂真信號。
[0121]可以理解的，以上詳細描述和后續的例子只是為了說明本發明，而非限制本發明的范圍。對于業界的技術人員而言，在不超出本發明的精神和范圍的前提下，很容易對所披露的實施例進行各種改動和修改。另外，出于描述和披露的目的，所有指出的專利、專利申請以及發表的內容被明確地并入本申請，比如，這些發表中所描述的方法學可以被用于本發明。這些發表在本申請的申請日之前被提供。但這不應被理解為承認由于先發明或其他原因使得發明人對這些披露沒有權利。有關該日期的聲明以及有關這些文件的內容的描述是基于
【申請人】能夠獲得的信息，并不構成對于該日期或這些文件的內容的修改的承認。
【主權項】
1.一種用于把單個的DNA分子成像的光學顯微工具，包括: 流體室，包括覆蓋硅晶圓的窗口的固態膜，位于所述固態膜一側的第一流體腔，所述第一流體腔內的具有第一折射率的第一液體，位于所述膜的另一側的第二流體腔，以及所述第二流體腔內的具有第二折射率的第二液體，其中，所述第二折射率低于所述第一折射率； 蓋玻片，所述流體室安置于該蓋玻片上，使得該蓋玻片形成所述第一流體腔的底面； 物鏡； 所述TIRF物鏡和所述蓋玻片之間的浸鏡油； 光源，被配制成把光導向所述物鏡，所述物鏡被配置成把所述光聚焦，使得產生小于所述固態膜覆蓋的窗口的隱失照明場；以及 成像探測器，探測位于所述固態膜的單個的DNA分子所發射的光。2.一種用于把單個的生物分子成像的光學顯微工具，包括: 在固態膜處產生隱失照明場的裝置，該固態膜位于具有不同折射率的第一和第二液體之間；以及探測由光學探測標記發出的光，該光學探測標記連接至位于固態膜處的單個的生物分子。3.如權利要求2所述的光學顯微工具，其中，所述單個的生物分子包括DNA分子。4.如權利要求2所述的光學顯微工具，其中，所述在固態膜處產生隱失照明場的裝置包括激勵激光器和物鏡。5.如權利要求2所述的光學顯微工具，其還包括使至少一個所述單個的生物分子穿過所述固態膜上的納米孔的裝置。6.一種把單個的生物分子成像的方法，包括: 在固態膜處產生隱失照明場，該固態膜位于具有不同折射率的第一和第二液體之間；以及 探測位于所述固態膜處的所述單個的生物分子所連接的光學探測標記所發出的光。7.如權利要求2的光學顯微工具或權利要求6所述的方法，其中，所述硅晶圓包括窗口，而所述氮化硅層覆蓋該窗口。8.如權利要求6所述的方法，其還包括把所述單個的生物分子固定在所述固態膜上。9.如權利要求6所述的方法，其還包括使至少一個所述單個的生物分子穿過所述固態膜上的納米孔。10.如權利要求9所述的方法，其中，所述至少一個單個的生物分子是DNA分子，所述方法還包括: 把所述DNA分子轉化成DDP; 把所述DDP與帶有所述光學探測標記的代表核苷酸A、T、U、C或G的序列進行雜交； 電泳驅動至少一個所述生物分子穿過所述納米孔。11.一種光學顯微工具，包括: 流體室，包括覆蓋硅晶圓的窗口的固態膜，位于該固態膜一側的第一流體腔，該第一流體腔內的具有第一折射率的第一液體，位于所述固態膜的另一側的第二流體腔，以及該第二流體腔內的具有第二折射率的第二流體，其中，所述第二折射率低于所述第一折射率； 蓋玻片，所述流體室安置于該蓋玻片上，使得該蓋玻片形成所述第一流體腔的底面； 聚焦透鏡； 光源，被配置成把光導向所述聚焦透鏡，該透鏡被配置成聚焦所述光，使得產生的隱失照明場小于所述固態膜覆蓋的所述窗口； 物鏡，位于所述第二流體腔上方，并被配置成聚焦由所述固態膜處的光學生物標記所發射的光； 以及 成像探測器，探測由所述光學生物標記發射的光。12.如權利要求1、2或11所述的光學顯微工具，其中，所述光源包括激勵激光束。13.如權利要求1、2或11所述的光學顯微工具，其中，采用生物素-鏈霉親和素化學法，把連接至所述光學生物標記的單個的DNA分子固定在所述固態膜上。14.如權利要求1、2或11所述的光學顯微工具，其中，光學生物標記連接至單個的DNA分子。15.如權利要求1、2或11所述的光學顯微工具，其中，所述固態膜包括至少一個納米縫隙。16.如權利要求11所述的光學顯微工具，其還包括第一和第二電極，被配置成施加跨越第一液體和第二液體的電勢，以驅動連接至所述光學生物標記的待成像的生物分子穿過所述納米孔。
【文檔編號】G02B21/16GK105928910SQ201610204864
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2010年3月26日
【發明人】G·V·索尼, A·梅勒
【申請人】波士頓大學董事會