一種浮游植物細胞粒徑分布的檢測分析方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于浮游植物細胞粒徑分布的檢測分析方法，1）對含有浮游植物細胞的樣品進行預處理，將細胞濃度調至適宜范圍；2）根據葉綠素a自發熒光，經流式細胞儀分析，篩選出浮游植物細胞；3）在相同測試條件下利用不同粒徑的熒光微球擬合前向散色信號強度值（FSC）與顆粒粒徑值Φ的Φ-FSC標準曲線，獲將FSC信號強度轉化為粒徑值的擬合函數；4）在步驟2）基礎上，生成篩選后浮游植物細胞進樣顆粒數量分布同FSC分布的峰圖，在步驟3）基礎上，計算進樣樣品中細胞計數均值所對應的顆粒粒徑，獲得浮游植物細胞粒徑分布情況。本發明操作簡單，能得到統計意義上的浮游植物粒徑分布，可用以開展浮游植物群體粒徑組成、生態結構等研究。
【專利說明】
一種浮游植物細胞粒徑分布的檢測分析方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生態環境研究領域，具體涉及采用流式細胞術檢測分析浮游植物細胞 的粒徑分布，尤其是快速獲得統計意義上的粒徑分布。
【背景技術】
[0002] 浮游植物是在水中以浮游方式生活的微小植物的統稱，廣泛分布于全球海洋與淡 水水體中，是水生態系統中最主要的初級生產者和能量轉換者。在對浮游植物研究的眾多 參量中，粒徑是一個非常重要的參數，浮游植物的新陳代謝、光合作用、能量利用等生理特 征都與粒徑有關，不同粒徑的浮游植物對水生態系統的初級生產力的貢獻不同。
[0003] 近年來，在水生態學與生物地球化學領域中，廣泛開展了對浮游植物粒徑組成、影 響因素，以及浮游植物的生物、化學過程粒徑效應等研究工作，這對揭示水生態環境中浮游 植物群落結構與功能，以及生物、化學過程的作用機理等具有重要的科學意義。
[0004] 目前測量浮游植物粒徑的方法主要包括顯微測微計法、圖像分析法、葉綠素a粒 級分離法、庫爾特計數法等。顯微測微計法和圖像分析法都具有直觀的優點，但其工作量 大，耗時多，難以實現有統計學意義上的多個細胞測量，無法直接給出其粒徑分布。葉綠素 a粒級分離法采用網篩和濾膜進行粒級分離，精度不高，方法也較為繁瑣。庫爾特法可以通 過測量細胞的等效球徑和表面積，直接得到細胞體積及其分布，但此方法無法將浮游植物 與泥沙等其他顆粒區分開，因此測量之前需要事先將浮游植物分離出來。
[0005] 近年來，有研究采用流式細胞術，借助于浮游藻類細胞的葉綠素自發熒光對浮游 植物豐度、群落結構組成、種群動態等方面進行檢測分析，尤其是針對水體中微型藻類（原 綠球藻、聚球藻）或超微型真核生物，通常多直接通過散色光及熒光信號強弱直接辨識與 計數，獲得該類型（微型或超微型）藻類在整個種群中所占比重。因缺乏有效的檢測分析 方法，目前還未見采用流式細胞術對浮游植物粒徑分布情況進行檢測，亦無法獲取具有統 計意義的水樣中浮游植物細胞粒徑分布譜圖。

【發明內容】

[0006] 針對現有技術的不足，本發明提供一種用于浮游植物粒徑分布的檢測分析方法， 該方法操作簡單，樣品需求量少，分級效率高，能將浮游植物與泥沙等其他雜質區分開來， 并快速得到浮游植物的粒徑分布，繪制水樣中浮游植物粒徑分布譜圖。
[0007] 為了實現上述目的，本發明提供的一種用于浮游植物粒徑分布的檢測分析方法，
[0008] 1)、采用流式細胞儀，對預處理后的待測樣品進行檢測，篩選出浮游植物細胞；
[0009] 2)、在相同測試條件下利用不同粒徑的熒光微球擬合前向散色信號強度值（FSC) 與顆粒粒徑值Φ的Φ-FSC標準曲線，獲將FSC信號強度轉化為粒徑值的擬合函數；
[0010] 3)、生成篩選后浮游藻類細胞顆粒數量分布同FSC的峰圖，根據擬合函數關系，確 定浮游植物細胞粒徑分布。
[0011] 本發明的具體技術方案如下：
[0012] 1)樣品預處理
[0013] 用50 μ m篩絹對含有浮游植物的水樣進行過濾，去除50 μ m以上的雜質顆粒，浮游 動物、碎肩、泥沙等。根據樣品細胞濃度多寡，選擇稀釋或濃縮樣品，達到理想樣品所含細胞 濃度：1X10 5~100X 10 5cells/ml。
[0014] 若樣品中存在群體生長的浮游植物，如微囊藻、魚腥藻、束絲藻等，可用超聲波細 胞粉碎機，選擇特定的功率、時間和超生頻率，對浮游植物群體進行超聲分散，使成為單細 胞分散狀態，以便于進樣分析。
[0015] 若為實驗室純種樣品，因雜質含量較少，可直接進樣。
[0016] 2)采用流式細胞術篩選浮游植物
[0017] 根據樣品調試測試條件，調整PerCP-PE雙色熒光補償，利用邏輯門框選出含葉綠 素a (PerCP通道檢測呈陽性）的細胞，即為樣品中浮游植物，同時得到浮游植物在樣品中的 數量百分比。
[0018] 3)顆粒粒徑Φ同前向角散射強度值（FSC)標準曲線繪制
[0019] 因顆粒粒徑同前向角散射強度值（FSC)呈正相關關系，故在步驟2)相同的測試條 件下，以FITC通道檢測標準粒徑熒光微球（如：0. 5μπι、1 μπι、2μπι、6μπι)的FSC強度均值， 擬合出顆粒粒徑Φ-FSC的標準曲線，獲得Φ-FSC擬合函數，將該條件下的FSC信號強度轉 化為粒徑值。
[0020] 4)浮游植物細胞粒徑分布分析
[0021] 在步驟2)基礎上，以FSC強度值為橫坐標，篩選后浮游植物細胞計數情況 (counts)為縱坐標，生成篩選出的浮游植物細胞數量分布同FSC強度分布的峰變化圖。
[0022] 根據研究需要，在流式細胞儀分析軟件中，將橫坐標FSC值截分成若干區段，確定 每個區段FSC強度均值和對應的細胞計數均值，并在步驟3) Φ-FSC曲線擬合函數基礎上， 計算進樣樣品中細胞計數均值所對應的顆粒粒徑，獲得浮游植物細胞粒徑分布情況。
[0023] 若所采用的流式細胞儀及配套軟件能夠自動提供每個進樣顆粒的FSC信號強度， 則可直接在步驟3) Φ-FSC曲線擬合函數基礎上，直接換算每個進樣浮游藻類細胞的粒徑 值，并獲得浮游植物細胞粒徑分布情況與分布譜圖。
[0024] 本發明分級效率高，樣品需求量少，操作簡單，能將浮游植物與其他雜質顆粒區 分，避免雜質顆粒對實驗結果的干擾，并且能夠快速處理多個樣品，得到統計意義上的浮游 植物粒徑分布，可以滿足科學、高效開展浮游植物群體粒徑組成、生態結構等實驗研究的相 關要求。
【附圖說明】
[0025] 圖1顯示為本發明的檢測分析方法的流程圖。
[0026] 圖2為實施例2中框選出的浮游植物細胞群體。
[0027] 圖3為熒光微球流式細胞測試分析結果。
[0028] 圖4為熒光球顆粒粒徑同FSC值得標準曲線。
[0029] 圖5浮游植物細胞進樣顆粒分布與FSC信號強度峰變化。
【具體實施方式】
[0030] 以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0031] 實施例1
[0032] 流式細胞儀最早應用于生物醫學研究領域。當單個帶有熒光素標記物或具有自發 熒光色素的細胞通過激光照射區時，受激發產生散色光和熒光信號，其中前向散射光（FSC) 信號強弱與所檢測細胞的粒徑有關，而熒光信號可以用來區分浮游植物與泥沙等其他雜 質。
[0033] 浮游植物都含有光合色素，受激光激發能自發產生熒光，并且不同色素的熒光特 性不同。如受488nm激光激發，葉綠素a發出紅色熒光（PerCP通道），藻紅蛋白則發出橘 黃色熒光（PE通道）。而葉綠素a是浮游植物最基本的光合色素，所有的浮游植物均含有 葉綠素a。故利用PerCP通道檢測并篩選出陽性細胞，可將浮游植物與其他雜質區分出來。 再利用流式細胞儀的FSC前向散色光信號，通過標準粒徑的熒光微球標定，可得到浮游植 物的粒徑分布。
[0034] 根據上述思路，根據附圖1所示，本實施例的具體操作步驟為：
[0035] 樣品的預處理
[0036] 對于天然水體樣品，因樣品中顆粒物組成復雜，為保證不堵塞儀器進樣孔，上樣前 用50 μ m篩絹對含有浮游植物的樣品進行過濾，去除50 μ m以上的雜質顆粒。若為實驗室 純種樣品，因雜質含量較少，可直接進樣。
[0037] 流式細胞儀進樣的理想樣品細胞濃度為1X105~100X 10 5cells/ml，根據 樣品的實際濃度多寡，如果大于l〇〇Xl〇5cells/ml，則用純水對樣品進行稀釋，若小于 1 X 105cells/ml，則用離心法對樣品進行濃縮，離心轉速約2000rad/min，離心10_15min，以 達到理想濃度。
[0038] 對于樣品中存在群體生長的浮游植物，如微囊藻、魚腥藻、束絲藻等，可用超聲波 細胞粉碎機，選擇特定的功率、時間和超生頻率，對浮游植物群體進行超聲分散，使成為單 細胞分散狀態，以便于進樣分析。
[0039] 利用流式細胞儀篩選浮游植物
[0040] 以BD公司生產的FACS Verse型號流式細胞儀為例。取0.5-2ml經預處理的樣 品，置于流式細胞儀中，選用488nm激光激發，Detectors/Amps(信號器/高壓）窗口確認 FSC、SSC為LIN (線性放大），其他FL1-3為LOG (對數放大），在Threshold (閥值）窗口確 認FSC為設閥參數，初步確認預設閥值52, Compensation (熒光補償）窗口中所有預設數值 皆為零。觀察FSC-SSC、FSC-PerCP、FSC-PE、PerCP-PE等各二維散點圖中的散點的位置，根 據樣品上機情況調整各探測器電壓，原則在于得到相互獨立、離散的細胞族群，盡量不出現 族群、細胞碎片之間有重疊現象。
[0041] 在浮游植物細胞內，常含有葉綠素、藻紅蛋白以及輔助色素等多種細胞色素，而它 們的熒光發射光譜相互重疊，因而流式細胞儀的每個光電倍增管實際檢測到的都是兩種或 幾種熒光之和，只不過是以某一種物質的熒光為主。熒光補償的作用就是使每一個熒光檢 測器只檢測一種物質的熒光，這樣才能獲得細胞內某一種色素含量（一種熒光強度）的準 確結果。
[0042] 本發明利用488nm激光激發出樣品本身的兩種自發熒光，即葉綠素a(PerCP通道 檢測），藻紅蛋白（PE通道檢測），不存在絕對的陰性樣本。因此在調熒光補償時主要依照 "橫平豎直"的原則，在PerCP-PE二維散點圖中，通過調整FL2-% FL1，FL1-% FL2,將單陽 及雙陽的類群調整至各自的區域。
[0043] 在上述條件下，設定儲存細胞總數10000個（在計算機運算能力允許條件下，可適 當擴大細胞總數，以保證取樣量和準確度），收集實驗數據。在PerCP-FSC二維散點圖中利 用邏輯門框選出含葉綠素a(PerCP檢測呈陽性）的細胞，視為樣品中的浮游植物，同時可以 得到它們在樣品中所占的數量百分比。
[0044] 3)顆粒粒徑Φ同前向角散射強度值（FSC)標準曲線繪制
[0045] 由于流式細胞儀的前向散色光（FSC)信號僅反應檢測細胞的相對粒徑，因此實驗 需要利用標準粒徑的焚光微球對細胞的絕對粒徑進行標定。本發明選用美國Polyscience 公司生產的黃綠色熒光的標準微球，粒徑分別為0. 5 μ m、l μ m、2 μ m、6 μ m，利用FITC通道 進行檢測并收集數據。
[0046] 熒光微球標準液的制備：由于熒光微球標準液本身的濃度不同，需要采用高純水 將標準液稀釋至前述進樣樣品適宜的濃度范圍（1X10 5~l〇〇Xl〇5cells/ml)，待測。
[0047] 分別取0. 5~1ml各種粒徑的熒光微球標準液，保證步驟2的測試條件不變，在 FITC-FSC二維散點圖中，不同粒徑的熒光微球會各自聚成一團，找到并框選出它們，讀取不 同粒徑熒光微球的FSC均值及變異系數，擬合出熒光顆粒粒徑Φ-FSC的回歸曲線，獲得擬 合函數關系，將該條件下的FSC信號強度轉化為粒徑值。
[0048] 4)浮游植物細胞粒徑分布分析
[0049] 在步驟2)基礎上，以FSC強度值為橫坐標，篩選后浮游植物細胞樣品計數情況 (counts)為縱坐標，在流式細胞儀分析軟件上（儀器自帶分析軟件或其他常用分析軟件， 如Flowjo)生成步驟2)篩選出的浮游植物細胞進樣顆粒數量分布同FSC強度分布的峰變 化圖。
[0050] 根據研究需要，將橫坐標FSC值截分成若干區段（截分區段越細，則獲得的細胞顆 粒粒徑信息越豐富），確定每個區段FSC強度均值和對應的細胞計數均值，并根據步驟3) Φ-FSC曲線擬合函數，計算進樣樣品中細胞計數均值所對應的顆粒粒徑，獲得浮游植物粒 徑分布情況。
[0051] 若所采用流式細胞儀及其配套軟件能夠自動提供進樣顆粒的FSC值，則可直接在 步驟3) Φ-FSC曲線擬合函數基礎上，直接換算每個進樣浮游藻類細胞的粒徑值，并獲得浮 游植物細胞粒徑分布情況與分布譜圖。
[0052] 實施例2
[0053] 以某水庫回水區浮游植物樣本為例，根據本發明的方法對淡水樣本中的浮游植物 顆粒粒徑分布進行檢測分析。操作過程及結果如下：
[0054] 1)由于采集的淡水樣本濃度與實驗要求的1X105~100X 10 5cells/ml相符，因 此直接將樣本通過50 μ m篩絹后，上機測試。
[0055] 2)本實施例采用BD公司生產的FACS Verse型號流式細胞儀進行實驗。取1ml經 預處理的樣品，置于流式細胞儀中，按專利所述方法調整測試條件及熒光補償后，設定儲存 細胞總數10000個，收集實驗數據。在PerCP-FSC二維散點圖中利用邏輯門框選出含葉綠 素a(PerCP檢測呈陽性）的細胞，得到篩選后的浮游植物群體見圖2。
[0056] 3)實驗選用美國Polyscience公司生產的黃綠色焚光的標準微球，粒徑分別為 1 μ m、2 μ m、6 μ m，由于藥品本身的濃度不同：1 μ m微球液濃度為1 X 10scells/ml、2 μ m微 球液濃度為1 X 107ce 11 s/ml、6 μ m微球液濃度為2 X 106ce 11 s/ml，為將藥品濃度稀釋至 4X105cells/ml，則需要將Ιμπι微球液由1滴（約40μ1)稀釋至10ml，2ym微球液由1滴 (約40 μ 1)稀釋至5ml，6 μm微球液由1滴（約40 μ 1)稀釋至4滴。實驗按上述配比制備 一定熒光微球標準液，取〇. 5ml，在相同測試條件下上機檢測（圖3)。
[0057] 實驗得到不同粒徑熒光微球的FSC值：427. 48，336，671，8917，擬合的顆粒粒徑 Φ-FSC 標準曲線函數為：FSC = 345. 3 · Φ2-700. 9 · Φ+691. 6(R2= 1. 000, p < 0· 01，見 圖4)。
[0058] 4)將流式細胞分析數據導入分析軟件Flowjo. 7. 6. 1. Min中，在軟件界面上，以 FSC強度值為橫坐標，浮游植物細胞進樣樣品數量值為縱坐標，得到篩選出的浮游植物細胞 進樣顆粒同FSC強度分布的峰變化圖（FSC-Count圖，見圖5)。本實驗將浮游植物細胞粒徑 分為〈2. 5μπι、2. 5-8μπι、8-16μπι、>16μπι 4個粒徑段，并依據步驟3)中FSC信號強度轉化 的粒徑值，則對應的 FSC 值為〈1097. 5,1097. 5-17183. 6,17183. 6-77874, >77874,反演至浮 游植物FSC-Count峰圖中，截取對應的浮游植物細胞群（見圖5)，讀取該FSC強度范圍內浮 游植物在總群體中所占的數量百分比，分別為6. 14%，51.49%，35. 24%，7. 13% (表1)。
[0059] 5)最終得到樣本中浮游植物細胞粒徑分級的結果見表1。
[0060] 表1浮游植物細胞粒徑分布檢測分析結果
[0061]
[0062] 上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟 悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種用于浮游植物粒徑分布的檢測分析方法，其特征在于， 采用流式細胞儀，對預處理后的待測樣品進行檢測，篩選出浮游植物細胞； 在相同測試條件下利用不同粒徑的熒光微球擬合前向散色信號強度值（FSC)與顆粒 粒徑值Φ的Φ-FSC標準曲線，獲將FSC信號強度轉化為粒徑值的擬合函數； 生成篩選后浮游藻類細胞顆粒數量分布同FSC的峰圖，根據擬合函數關系，確定浮游 植物細胞粒徑分布。2. 根據權利要求1所述的檢測分析方法，其特征在于，待測樣品的預處理，待測樣品為 雜質較多的天然水體樣品，采用50μπι篩絹過濾處理；待測樣品為具有群體細胞的樣品，進 行超聲分散，使成為單細胞分散狀態，以便于進樣分析。3. 根據權利要求1所述的檢測分析方法，其特征在于，浮游植物細胞篩選，選擇流式細 胞儀的488nm激光激發，調整測試條件，以PerCP、PE通道做雙色熒光補償，在PerCP-FSC二 維散點圖中框選PerCP陽性細胞，含有葉綠素 a，得到浮游植物在樣品中的數量百分比。4. 根據權利要求1所述的檢測分析方法，其特征在于，顆粒粒徑值Φ同FSC信號的標 準曲線，以FITC通道檢測標準粒徑熒光微球的FSC強度均值，擬合出顆粒粒徑Φ-FSC的標 準曲線，獲得Φ-FSC曲線擬合函數，將該條件下的FSC信號強度轉化為粒徑值。5. 根據權利要求1所述的檢測分析方法，其特征在于，浮游藻類細胞顆粒數量分布同 FSC的峰圖，以FSC強度值為橫坐標，篩選后浮游藻類細胞樣品計數情況（counts)為縱坐 標，生成篩選出的浮游植物細胞進樣顆粒數量分布同FSC強度分布的峰變化圖。6. 根據權利要求1所述的檢測分析方法，其特征在于，浮游植物細胞粒徑分布，在流式 細胞儀分析軟件中，將橫坐標FSC值截分成若干區段，確定每個區段FSC強度均值和對應的 浮游植物細胞計數均值，并在所述Φ-FSC曲線擬合函數基礎上，計算進樣樣品中細胞計數 均值所對應的顆粒粒徑，進而獲得浮游植物細胞粒徑分布情況。
【文檔編號】G01N15/02GK105865988SQ201510033191
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月23日
【發明人】李哲, 肖艷, 陶思圓, 郭勁松, 張振
【申請人】中國科學院重慶綠色智能技術研究院