一種快速檢測與鑒定鉤吻中化學成分的分析方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種快速檢測與鑒定鉤吻中化學成分的分析方法，屬于鉤吻分析技術 領域。
【背景技術】
[0002] 鉤吻，又名斷腸草、野葛等，是世界著名的劇毒植物。在全世界一共有三個種屬，分 別為：胡蔓藤(Gelsemium elegans Benth)主要分布在我國福建、浙江、云南、廣西、湖南、貴 州、江西等南部地區及東南亞地區；常綠鉤吻(Gelsemium sempervirens(L.)J.st-Hil)以 及沼澤茉莉(Gelsemium rankinii Small .)，主要分布于北美洲國家。中醫對鉤吻早就記 載，如《中藥大辭典》中描述:其根、壟、葉均可入藥，性溫，味辛、苦，有大毒。具有祛風攻毒、 散結、止痛功能，主要用于治療濕疹、癰腫、療瘡、體癬、跌打損傷、風濕痹痛、神經痛等。民間 亦有用鉤吻總生物堿或鉤吻注射液用于治療肝癌、食道癌、皮膚病等。目前，國內外許多學 者通過大孔樹脂、0DS反相硅膠、Sephadex LH-20、逆流色譜以及制備型HPLC等現代分離技 術手段從鉤吻中分離得到了 121種生物堿、環烯醚萜和留體等成分，其中生物堿和環烯醚萜 是該屬植物的主要活性成分。
[0003] 通過對國內外所有分離與鑒定的文獻分析，目前都是采用傳統的中藥物質基礎研 究思路對鉤吻的化學成分進行了大量的研究，即對鉤吻中的化學成分進行有目的的提取、 分離與純化，再用質譜與核磁進行結構鑒定，發現鉤吻中新的化學成分，篩選到一些有生物 活性的有效成分，從而不斷完善鉤吻的物質基礎。這種研究方法對化學成分研究得比較清 楚，結構式準確，發表的研究結果對后人研究起著很好的借鑒作用。但是，目前除了少數的 幾個化學成分有對照品外，絕大多數化學成分無對照品。后人如需進行藥理與毒理、藥物代 謝研究時，需重新分離和制備化合物，浪費大量的時間、人力和物力。目前為之，國內外也尚 未建立鉤吻的化學成分譜。因此，如何將目前已知化學成分的研究結果有效地記錄下來，建 立鉤吻化學成分譜，為鉤吻植物及其產品的化學成分的快速分析與監控具有重要意義。
[0004] 目前，鉤吻化學成分檢測方法有液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法和液相色譜-串聯質譜法。通過查閱相關文獻，大部分僅能檢測與分析幾個化學物，且需要標準品，不能 從方法與技術上解決鉤吻復雜體系的物質基礎研究。目前，也未見利用液相色譜-四級桿-飛行時間質譜聯用儀結合自建數據包的快速檢測與分析方法。

【發明內容】

[0005] 針對現有技術對鉤吻化學成分檢測技術存在的缺陷，本發明的目的是在于提供一 種快速、準確、能同時檢測鉤吻中包括生物堿、環烯醚萜、酚類等在內的多種化學成分的方 法，該方法具有操作簡單、分析效率高、高通量等優點，可以廣泛應用于鉤吻物質基礎研究、 質量控制、產品研發等各種與鉤吻相關的分析領域。
[0006] 為了實現上述技術目的，本發明提供了一種快速檢測與鑒定鉤吻化學成分的分析 方法，該方法是將鉤吻醇提取物采用液相色譜-四級桿-飛行時間質譜聯用儀檢測，檢測結 果通過鉤吻數據包進行快速自動匹配分析;所述的鉤吻數據包通過將鉤吻中各種已知化合 物的英文名稱、分子式、精確分子量及結構式導入PCDL軟件建立而成。
[0007] 本發明的技術方案通過液相色譜-四級桿-飛行時間質譜聯用儀檢測，結合建立鉤 吻數據包對檢測結果進行分析，能快速、準確地對鉤吻中包括生物堿、環烯醚萜、酚類等在 內的多種化學成分進行同時檢測，并進行結構鑒定分析，克服了現有技術中僅能對鉤吻中 少數幾種有標準品的化合物進行檢測的局限。
[0008] 本發明提供的方法可以同時檢測和鑒定鉤吻中生物堿、環烯醚萜、酚類等化合物， 將鉤吻醇提取物通過液相色譜-四級桿-飛行時間質譜聯用儀檢測，用自動MS/MS方法找到 鉤吻醇提取物中所含的精確母離子峰;將這些數據與鉤吻數據包進行快速自動匹配分析， 快速找到鉤吻醇提取物中化學成分的可能分子式與結構式，再根據其對應的精確二級質 譜，鑒定其可能的化學成分;該方法快速、準確地實現了對鉤吻中化學成分的檢測與鑒定， 且具有進樣次數少、操作簡單、分析效率高等優點。
[0009] 本發明的技術方案收集了國內外有關鑒定鉤吻化學成分的文獻，包括生物堿、環 烯醚萜、酚類等在內的216種化合物，把對應的英文名稱、分子式、精確分子量及結構式導入 到P⑶L軟件，建立鉤吻化合成分的數據包。
[0010] 優選的方案，鉤吻提取物為鉤吻鉤吻醇提取物。
[0011]優選的方案，檢測采用Agilent 6530液相色譜-四級桿-飛行時間質譜聯用儀，分 析柱為a 0DS-C18column，150mmX2.0mm I.D.，particle size 5um〇
[0012] 優選的方案，分析柱的液相條件為:流動相A為0.1 %甲酸水，B為乙腈;梯度洗脫:0 ~5111丨11，10%8;5~20111丨11，10%仂90%8;20~25111丨11，90%8 ;25.1111丨11，10%8;總分析時間 30min;進樣體積2yL，流速0.3mL/min;樣品溫度4°C ;柱溫箱30°C。
[0013] 優選的方案，質譜選擇離子參數：毛細管電壓正離子掃描4000V，負離子掃描-3500V;霧化壓力40psig;干燥氣流速9L min-1;氣體溫度350°C ; skimmer電壓60V;誘導解離 電壓170V;采用正負離子掃描方式。
[0014] 優選的方案，檢測結果用自動MS/MS方法找到有二級質譜相對應的各種精確分子 量，保留時間窗控制在0.25min，質量誤差控制在0.05Da，正離子模式一共找到559個化合 物，負離子模式一共找到237個化合物。
[0015] 優選的方案，將這些結果與自建的鉤吻數據包進行搜索與匹配，對測定的精確分 子量與化學成分的精確分子量的誤差限定在5ppm之內，正離子選擇+H和+Na模式，負離子選 擇-H、+C1和+HC00。其結果包括保留時間、測定的精確分子量、精確的分子量、誤差、得分、可 能存在的化學成分及化合物數目；對匹配上的109個化合物;再根據其二級質譜進行進一步 的結構鑒定。根據該分析方法策略，正離子模式共鑒定了 56個鉤吻化合物，負離子共鑒定23 個化合物。
[0016]本發明快速檢測與鑒定鉤吻中化學成分的分析方法如下：
[0017] 1)鉤吻數據包的建立:查閱國內外鉤吻報道化學成分的相關文獻，把這些化學成 分的分子式與英文名稱錄入excell表，并畫出每種化學成分的結構式;再把exell表與結構 式導入的Aglient的P⑶L軟件中，建立鉤吻鉤吻化學成分的數據包。
[0018] 2)鉤吻醇提取物的制備過程:將10kg鉤吻放入的提取罐中加80L的95%乙醇，提取 1.5h，藥液用200目濾網過濾，藥渣再同法提取1次，合并兩次提取液，置濃縮罐中濃縮至相 對密度1.2左右，減壓干燥后即得；
[0019] 3)分析柱為0DS_C18column(150mmX 2.0mm I .D. ;particle size 5μηι);分析的液 相條件為：流動相Α為0.1 %甲酸水，Β為乙腈；梯度洗脫：0-5min，10 % Β; 5-20min，10 % to 90%B; 20-25min，90%B; 25 · lmin，10%B·，總的分析時間30min;進樣體積2yL，流速0 · 3mL/ min;樣品溫度4°C，柱溫箱30°C ;
[0020] 質譜選擇離子參數:毛細管電壓正離子掃描4000V，負離子掃描-3500V;霧化壓力， 40psig;干燥氣流速，9L mi