一種液液萃取-gfaas法測定一價銅含量的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于微量元素檢測技術領域，具體地，設及一種液液萃取-GFAAS法測定一 價銅含量的方法。
【背景技術】
[0002] 銅離子是生物體不可缺少的微量元素。在生物體內，銅主要是W與酶、蛋白質分子 W及一些生物小分子如氨基酸絡合的狀態存在。銅離子參與生物體一些重要的生理過程， 如細胞呼吸、神經遞質的傳遞、抗氧化應激和鐵離子的攝取都依賴于銅離子。人體許多疾病 與體內銅離子失衡有關，如肝豆狀核變性、瘋牛病、阿爾茲海默癥和癌癥等。神經退行性疾 病與銅藍蛋白的喪失生物活性或Cu(I)毒性有關。銅離子在生物體內發揮的作用主要是基 于它氧化還原的化學性質，也就是Cu 2+和Cu+氧化態之間的轉換。細胞內的一些重要生物化 學反應是由于兩個氧化態之間的轉換而得W進行。
[0003] 目前生物體大多只能定量測定總銅，并不能區分Cu(I)和化（n)。生物體系iig/L級 的痕量Cu(I)離子測定國內外迄今沒有文獻報道。在Cu(E)離子存在下，測定Cu(I)銅離子 面臨著如何消除化（H)離子的干擾問題。在純化學體系中測定Cu(I)離子時，Cu(I)離子很 容易被空氣的氧所氧化，在無機溶液中很不穩定。但由于其能與聯哇嘟形成高強度雙配位 基Cu(I)離子配合物，且在有機溶劑中能穩定存在，因此可用分光光度法測定。但對生物樣 本痕量的化(I)離子仍然無法用分光光度法測定。

【發明內容】

[0004] 本發明針對現有技術的不足，提供了一種液液萃取-GFAAS法測定一價銅含量的方 法。
[0005] 本發明的上述目的是通過W下技術方案予W實現。
[0006] -種液液萃取-GFAAS法測定一價銅含量的方法，包括如下步驟： 51. 標準工作曲線的制作:在惰性氣體的保護下，將化Cl的標準品用飽和KCl溶液定容， 得到1000 ppm的亞銅標準溶液;取亞銅標準溶液與pH 9的甘氨酸-NaOH緩沖溶液按體積比1: 9混合，再向混合溶液中加入等體積的0.06%(w/w) 2 J/-聯哇嘟的正戊醇溶液，混勻，靜置 分層，取上層有機層用2 J/-聯哇嘟的正戊醇溶液依次稀釋成10、1、0.1、0.Olppm溶液，取 0.0 lppm溶液ImL上機，制作工作曲線； 52. -價銅的檢測:將樣品與等體積20%的S氯乙酸混勻，根據樣品含銅量，再與抑9的 甘氨酸-化OH緩沖溶液按不同比例稀釋，再向混合溶液中加入ImL的0.06%(w/w)2，2/ -聯哇 嘟的正戊醇溶液，混勻，靜置分層，取上層有機層，上機用石墨爐原子吸收法測定一價銅含 量； 其中，S2所述樣品為血清時，取樣品的上清液用緩沖溶液稀釋20倍;S2所述樣品為細胞 液、細胞膜液、組織液或尿液時，取樣品的上清液用緩沖溶液稀釋1倍;S2所述樣品為不含蛋 白的無機溶液時，直接將樣品用緩沖溶液稀釋1倍。
[0007] 甘氨酸與Cu(n)能形成穩定的無機絡合物，其穩定常數為15.1，且在pH 8-10范 圍，極易生成配位比1:2的穩定銅氨絡合物，所形成的甘氨酸馨合銅不溶于有機溶劑，其中 抑為卵寸最優。2,2/-亞銅試劑（2,2/-聯哇嘟）是測定化（I)的特效試劑，與Cu(I)形成 的絡合物能很好地溶解在有機溶劑而難溶于水。當含有甘氨酸的水溶液生物樣本用含有2， 2/-聯哇嘟的有機溶劑萃取時，就能將兩者很好地分離在水相和有機相中，從而達到將兩 種離子分離而達到分別測定的目的。分離后的有機相用石墨爐原子吸收測定Cu(I)，就能大 大提高測定化(I)的靈敏度。
[0008] 優選地，S2所述樣品為含蛋白的樣品時，將樣品與=氯乙酸混勻后離屯、去蛋白，再 取去蛋白后的上清液進行后續步驟。含蛋白質的樣品包括血清、細胞液、細胞膜液、組織液。 不含蛋白的無機溶液或其他生物體液如尿液，可減少去蛋白步驟。優選地，所述不含蛋白的 無機溶液包括礦泉水、自來水。
[0009] 優選地，所述離屯、為1200巧m離屯、1 Omin。
[0010] 優選地，S2所述樣品為細胞液、細胞膜液或組織液時，另取未去蛋白前的樣品測定 蛋白濃度，W蛋白含量定量一價銅濃度。S2所述樣品為細胞液、細胞膜液或組織液時，因細 胞無法定量體積，故須另取未去蛋白前的樣品測定蛋白濃度，用同體積的樣本含銅量除W 含蛋白量，即每克蛋白所含的亞銅質量定量一價銅濃度。
[0011] 優選地，S2所述樣品來自細胞時，將樣品進行如下預處理:培養數天后的細胞收 集，超聲或冰凍破碎后，分離得到的上清即細胞液，沉淀下來的細胞膜用適量表面活性劑溶 解，再作為樣品進行測定。
[0012] 優選地，S1、S2所述混勻的方法為旋滿振蕩Imin。
[OOU]優選地，S1、S2所述緩沖溶液中的甘氨酸濃度含O.Olmol/L。
[0014] 優選地，S2所述上層有機層的上機量為50化L。
[0015] 與現有技術相比，本發明有益效果在于:本發明提供了一種生物樣品中痕量一價 銅離子含量的檢測方法，對探討機體銅代謝失衡有重要意義。本發明方法能夠區分Cu(I)和 Cu(n)，在測定Cu(I)時消除了 Cu(E)離子的干擾，對生物體系痕量Cu(I)離子的檢測限達 0. l〇yg/L，相對偏差<5%。回收率:95~102〇/〇。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明，但實施例并不對本發明做任何 形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法 和設備。
[0017]實施例1 標準品準備:5g裝的化Cl標準品開封后，用l(m ImL塑料管分裝，小屯、充入氣氣，將管內 空氣驅凈后用密封膠封好管口，并儲存于放硅膠的干燥器中。
[0018] -種液液萃取-GFAAS法測定一價銅含量的方法，包括如下步驟： SI.標準工作曲線的制作：配制工作曲線時，取出其中一管，稱取CuCl的標準品 (99.999%，阿拉下)0.0156g置于10血容量瓶，用飽和KCl溶液稀釋至刻度線，即得1000 ppm亞 Cu標準溶液，從中取10化L置于5血塑料管，力的00化抑為9 Glycine(甘氨酸)-化OH緩沖溶 液，再加1000化0 . 〇6%2，2/ -聯哇嘟的正戊醇溶液，旋滿振蕩Imin,靜置分層，上層即得 I(K)PPm亞銅標準溶液，再從上層有機層取10化L用2,2/ -聯哇嘟的正戊醇溶液依次稀釋成 10，1,0.1,0.Olppm溶液，用0.Olppm溶液上機，正戊醇為稀釋劑做工作曲線。
[0019] S2.化（I)測定:將2(K)化血清樣品與20化L20%S氯乙酸混勻，1200轉離屯、IOmin去 蛋白，取血清上清液50化置5血塑料管內，加入95化L抑為9的甘氨酸Glycine-NaOH緩沖溶 液，混勻后加入1000化0. 〇6%2，2/ -聯哇嘟的正戊醇溶液，旋滿振蕩Imin，靜置分層后取上層 50化L，上機用石墨爐原子吸收法測定。
[0020] 所述樣品還可為細胞液或其它生物體液等；當測定細胞液、細胞膜液或組織液時， 去蛋白后的液體與甘氨酸Glycine-NaOH緩沖溶液按1:1稀釋，除了按上述步驟測定之外，另 取一定體積樣本測定蛋白濃度，W蛋白含量定量亞銅濃度； 如果是不含蛋白的無機液或其它生物體液如尿液，就可減少去蛋白運個步驟。當需檢 測細胞膜的Cu(I)時，培養數天后的細胞收集，超聲或冰凍破碎后，分離得到的上清即細胞 液，沉淀下來的細胞膜可用適量表面活性劑(如2%Triton X-100)溶解，再作為樣品進行測 定。
[0021] 按照上述方法對農夫山泉、自來水、尿血清、細胞液和細胞膜中的Cu(I)進行測定， 結果如表1。每組樣品重復實驗=次。
[0022] 表1不同樣品的檢測實例
注:yg/評ro:微克每克蛋白；TCu:總銅 該方法檢測限:0.1化g/L，相對偏差<5%。回收率:95~102%。運對探討人體銅代謝失衡 有重要意義。
[0023] 補充說明：1，由于不同樣品中的亞銅均轉移到了有機相才進行上機測定，故所有 樣品都可用同一條工作曲線測定。
[0024] 2,上機樣液一般為500至1000微升，故含萃取劑的有機相正戊醇只需要加 ImL。
【主權項】
1. 一種液液萃取-GFAAS法測定一價銅含量的方法，其特征在于，包括如下步驟：51. 標準工作曲線的制作:在惰性氣體的保護下，將CuCl的標準品用飽和KC1溶液定容， 得到lOOOppm的亞銅標準溶液;取亞銅標準溶液與pH 9的甘氨酸-NaOH緩沖溶液按體積比1: 9混合，再向混合溶液中加入等體積的0.06%(w/w) 2，2'-聯喹啉的正戊醇溶液，混勻，靜置 分層，取上層有機層用2，2'-聯喹啉的正戊醇溶液依次稀釋成10、1、0.1、0.01 ppm溶液，取 0.0 lppm溶液lmL上機，制作工作曲線；52. -價銅的檢測:將樣品與等體積20%的三氯乙酸混勻，根據樣品含銅量，再與pH 9的 甘氨酸-NaOH緩沖溶液按不同比例稀釋，再向混合溶液中加入lmL的0.06%(w/w)2，2'-聯喹 啉的正戊醇溶液，混勻，靜置分層，取上層有機層，上機用石墨爐原子吸收法測定一價銅含 量； 其中，S2所述樣品為血清時，取樣品的上清液用緩沖溶液稀釋20倍;S2所述樣品為細胞 液、細胞膜液、組織液或尿液時，取樣品的上清液用緩沖溶液稀釋1倍;S2所述樣品為不含蛋 白的無機溶液時，直接將樣品用緩沖溶液稀釋1倍。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述樣品為含蛋白的樣品時，將樣品與 三氯乙酸混勻后離心去蛋白，再取去蛋白后的上清液進行后續步驟。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述離心為1200 rpm離心10min。4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，S2所述樣品為細胞液、細胞膜液或組織液 時，另取未去蛋白前的樣品測定蛋白濃度，以蛋白含量定量一價銅濃度。5. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，S2所述樣品來自細胞時，將樣品進行如下 預處理:培養數天后的細胞收集，超聲或冰凍破碎后，分離得到的上清即細胞液，沉淀下來 的細胞膜用適量表面活性劑溶解，再作為樣品進行測定。6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，SI、S2所述混勻的方法為旋渦振蕩lmin。7. 據權利要求1所述的方法，其特征在于，S1、S2所述緩沖溶液中的甘氨酸濃度< 0.01mol/L〇8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述上層有機層的上機量為500yL。
【專利摘要】本發明屬于微量元素檢測技術領域，具體公開了一種液液萃取-GFAAS法測定一價銅含量的方法。本發明方法包括如下步驟：S1.標準工作曲線的制作；S2.一價銅的檢測：將樣品與等體積20%的三氯乙酸混勻，根據樣品含銅量，再與pH9的甘氨酸-NaOH緩沖溶液按不同比例稀釋，再向混合溶液中加入1mL的0.06%(w/w)2，2′-聯喹啉的正戊醇溶液，混勻，靜置分層，取上層有機層，上機用石墨爐原子吸收法測定一價銅含量。本發明方法可用于生物樣本痕量一價銅含量的檢測，對探討機體銅代謝失衡有重要意義。
【IPC分類】G01N21/31
【公開號】CN105527235
【申請號】CN201511010910
【發明人】張源, 羅文鴻, 林哲絢, 韓溟, 李慧, 羅紅軍
【申請人】汕頭大學醫學院
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2015年12月30日