一種uht滅菌乳中復原乳的鑒別方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種乳制品檢測方法，具體地說是一種UHT滅菌乳中復原乳的鑒別方 法。
【背景技術】
[0002] 在液態奶中大量使用進口乳粉，是發展中國家乳品消費處于快速增長時期的特有 現象。加工企業用乳粉生產復原乳（reconstitutedmilk，將干燥的或者濃縮的乳制品與水 按比例混勻后獲得的乳液）操作方便，風險低，不需要建設奶源基地，但是嚴重損害了農民 的利益，侵犯了消費者的知情權。更為嚴重的是，復原乳完全割斷了加工企業與養殖戶之間 共同提高原料奶質量的責任關系，使進口乳粉成為我國的境外奶源基地。
[0003] 目前國際組織和國外都沒有頒布用于復原乳鑒定的標準，國際上將經過熱殺菌的 多種液態奶，分別命名為"巴氏殺菌奶"、"高溫巴氏殺菌奶"、"超巴氏殺菌奶"、"延長保質期 的奶"、"直接法超高溫滅菌奶"、"間接法超高溫滅菌奶"、"保持法滅菌奶"等不同品類，以示 相互區分。我國現行標準只命名了其中的三個，即巴氏殺菌奶、超高溫滅菌奶（間接法）和 保持法滅菌奶。因此，有必要開發一種鑒定UHT滅菌乳中復原乳的方法，促進乳品行業的健 康發展。

【發明內容】

[0004] 本發明針對不添加營養強化劑和/或乳糖水解酶，或僅添加礦物質、維生素的UHT 滅菌乳。復原乳鑒定是世界性的難題。在國內外無同類標準可以借鑒的情況下，本發明創新 性提出了復原乳鑒定方法，并針對我國實際情況建立起區分含復原乳產品的方法，不僅為 我國復原乳監管奠定了技術基礎，而且推動我國在該領域的技術創新處于國際先進水平。 本發明進一步提高了乳制品檢測方法的權威性，保障消費者知情權、保護奶農利益、促進民 族奶業健康發展等方面更好地發揮作用。
[0005] 本發明中的生乳（rawmilk)是指從健康奶畜擠下的經過或不經過過濾和冷卻，但 未經過任何加熱和其他除菌處理的常乳。乳粉包括全脂、脫脂、部分脫脂等不同類型，此外 乳清粉、濃縮乳也可能被企業用于液態奶生產。復原乳（reconstitutedmilk)是指將干燥 的或者濃縮的乳制品與水按比例混勻后獲得的乳液。本發明將"熱處理"具體定義為"采用 加熱技術且強度不低于巴氏殺菌、殺滅和抑制生乳中微生物生長使得堿性磷酸酶呈陰性， 同時控制其物理化學性狀只發生有限變化的操作統稱"。本發明將"超高溫瞬時滅菌（UHT) " 具體定義為經135°C以上滅菌數秒。
[0006] 下面對糠氨酸、乳果糖含量的測定方法進行描述。
[0007] (一）糠氨酸含量的測定方法：
[0008] 牛奶在加熱過程中梅拉德反應，使蛋白質和糖生成糠氨酸（ε-Ν-2-呋喃甲 基-L-賴氨酸）。試樣經鹽酸水解后測定蛋白質含量，水解液經C18萃取，用高效液相色譜 (HPLC)或超高效液相色譜（UPLC)在紫外（280nm)檢測器下對糠氨酸樣品進行分析，以外標 法定量糠氨酸。最后計算每百克蛋白質中糠氨酸的含量。需要說明的是，本發明對糠氨酸 含量的測定方法中僅使用確認為分析純的試劑和GB/T6682中一級水。
[0009] 本發明糠氨酸含量測定方法所使用的試劑為：
[0010] 甲醇（CH30H):色譜純。
[0011] 3mol/L鹽酸溶液：在7.5mL水中加入2.5mL濃鹽酸（12mol/L)，混勻。
[0012]10. 6mol/L鹽酸溶液：在12mL水中加入88mL濃鹽酸（12mol/L)，混勻。
[0013] 0· 1%三氟乙酸溶液：吸取lmL三氟乙酸（色譜純）溶于水中，定容至1L，超聲波 脫氣35min〇
[0014] 6g/LKC1溶液（m/v):準確稱量6gKC1溶于部分水中，定容至1L，過0. 45μm水 相濾膜，超聲波脫氣35min。
[0015] 糠氨酸（furosine) (ε-N- (2-呋喃甲基）-L-賴氨酸）標準貯備溶液：將糠氨酸標 準物按其純度換算后，用3mol/L鹽酸溶液配制成200μg/mL的標準貯備溶液，-20°C條件下 可貯存24個月。
[0016] 糠氨酸標準工作溶液：微量移液器吸取250μL標準貯備溶液于25mL容量瓶，以 3mol/L鹽酸溶液定容，配制成2μg/mL糠氨酸標準工作溶液。
[0017] 高純度氮氣：99· 99%。
[0018] 本發明糠氨酸含量的測定方法使用的儀器為：
[0019] 高效液相色譜儀：配有梯度洗脫系統及紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
[0020] 凱氏定氮儀。
[0021] C18萃取柱：柱容量500mg。
[0022] 干燥箱：110°C±2°C。
[0023] 密封耐熱試管：容積為20mL。
[0024]注射器：10mL。
[0025] 容量瓶：容積分別為25mL和1L。
[0026] 超高效液相色譜儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
[0027] 有機相濾膜：0.45μ m。
[0028]水相濾膜：0.45μ m。
[0029] 糠氨酸含量的測定步驟如下：
[0030] 步驟一、采樣：取不少于200mL液態奶作為實驗樣品，將樣品在0°C~4°C條件下保 存。
[0031] 步驟二、水解液的制備：吸取2.OOmL試樣，置于密閉耐熱試管中，加入6mL的 10. 6mol/L鹽酸溶液，混勻，往試管中緩慢通入所述高純度氮氣lmin~2min，密閉試管，將 試管置于干燥箱，在ll〇°C下加熱約lh后，輕輕搖動試管，繼續加熱直至加熱23h~24h。加 熱結束后，將試管從干燥箱中取出，冷卻后過濾，制得水解液。
[0032] 步驟三、水解液中蛋白質含量的測定：吸取2.OOmL步驟二制得的水解液，按GB/T 5009. 5測定試樣溶液中蛋白質含量。
[0033] 步驟四、水解液的純化：將C18萃取柱安裝在注射器上。分別用5mL甲醇和10mL 水潤濕萃取柱，保持萃取柱濕潤狀態。吸取0. 500mL步驟二中水解液于萃取柱，用注射器緩 慢推入C18萃取柱內。吸取3mol/L鹽酸溶液緩慢洗脫萃取柱中的樣品至3mL。
[0034] 步驟五、糠氨酸含量的測定：該步驟采用以下兩種方法測定。（a)HPLC法；(b)UPLC 法。
[0035] (a)HPLC法：
[0036] 1)色譜參考條件
[0037] 色譜柱：C18硅膠色譜柱，250_X4. 6mm，5μπι粒徑，或相當者。
[0038] 柱溫：32Γ。
[0039] 流動相：0. 1 %三氟乙酸溶液（5. 1. 2. 4)為流動相Α，甲醇（5. 1. 2. 1)為流動相Β。
[0040] 洗脫梯度：見表1。
[0041] 表1洗脫梯度
[0042]
[0043] 2)測定
[0044] 利用流動相Α和流動相Β的混合液（50 : 50)以lmL/min的流速平衡色譜系統。 注入20μL~50μL的3mol/L鹽酸溶液平衡柱子，以檢測溶劑的純度。注入10μL待測 溶液（步驟四得到的純化后的水解液）測定糠氨酸含量。
[0045] (b)UPLC法
[0046] 1)色譜參考條件
[0047] 色譜柱：WATERSACQUITYUPLC⑩HSST3 色譜柱 1. 8μm(100mmX2. 1mm)，或相 當者。
[0048] 柱溫：30Γ。
[0049] 流動相：6g/LKC1溶液為流動相A，甲醇為流動相B，純水為流動相C。
[0050] 洗脫條件：流動相A，0· 4mL/min。
[0051] 2)測定
[0052] 分別利用流動相B、C、A以0. 4mL/min的流速依次平衡色譜系統。注入2μL~5μL 的3mol/L鹽酸溶液平衡柱子，以檢測溶劑的純度。注入2yL待測溶液（步驟四得到的純 化后的水解液）測定糠氨酸含量。
[0053] 步驟六、糠氨酸含量計算結果：糠氨酸含量以質量分數W計，數值以毫克每百克蛋 白質（mg/ΙΟΟε蛋白質）表τκ,按公式⑵計筧：
[0054]
[0055] 式中：
[0056] W樣品中糖氣酸含量，單位為暈克每百克蛋白質（mg/lOOg蛋白質）；
[0057]AJ!〗試樣品中糠氨酸峰面積的數值；
[0058] Astd糠氨酸標準溶液中，糠氨酸峰面積的數值；
[0059] Cstd糠氨酸標準溶液的濃度，單位為mg/L;
[0060] D測定時稀釋倍數（D= 6);
[0061] m樣品水解液中蛋白質濃度，單位為克每升（g/L)。
[0062] 計算結果保留至小數點后一位。
[0063] 本發明中，上述糠氨酸含量的測定方法精密度控制如下：
[0064] 在重復性條件下獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不大于算術平均值的10%， 在重現性條件下獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不大于算術平均值的20%。上述 HPLC和UPLC檢測方法的檢測限和定量限分別如表2所示。
[0065] 表2HPLC和UPLC的檢測限和定量限
[0066]
[0067](二）乳果糖含量的測定
[0068] 奶樣中加入硫酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液，沉淀脂肪和蛋白質。濾液中加入 員-〇-半乳糖苷酶（0-83]^1：〇81(^86)，在0-〇-半乳糖苷酶作用下乳糖水解為半乳糖 (galactose)和葡萄糖（glucose);乳果糖水解為半乳糖（galactose)和果糖（fructose):
[0069]
[0070] 但牛奶中乳糖含量比乳果糖含量高得多（約100倍），水解生成的大量葡萄糖干擾 果糖的測定。為此，再加入葡萄糖氧