一種測定人血漿中丹參酮iia磺酸鈉濃度的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬醫學檢驗領域，涉及體內藥物的分析測定方法，具體涉及一種測定人血 漿中丹參酮ΠΑ磺酸鈉（STS)濃度的方法。
【背景技術】
[0002] 現有技術公開了丹參酮 IIA 橫酸鈉 （Sodium Tanshinone IIA Sulfonate，STS)在 臨床上用于治療冠心病、心絞痛，心肌梗死等心血管疾病。盡管丹參酮IIA磺酸鈉（STS)應 用于臨床已超過30年，但實踐顯示其臨床用藥參考資料依然不足，如人體藥代動力學參數 未見報道，致使限制了其在臨床上安全、有效應用。STS人體藥代動力學參數缺乏的重要原 因之一是缺乏測定人血漿中STS濃度的方法。迄今，國內外尚未見測定人血漿中STS的分 析方法的文獻報道。
[0003] 現有技術的測定STS在動物血漿樣本中濃度的方法在靈敏度、定量線性范圍、特 異性等方面均不適用于測定其在人血漿中的濃度。有文獻報道一種反相離子對色譜法 (Ion-Pair Reversed-Phase HPLC-UV)測定STS在大鼠血衆中濃度的方法，該方法的最低定 量限是〇. 5 μ g/mL，顯然其靈敏度之低不能滿足人血漿中STS低濃度點的測定要求；另有報 道米用液相色譜-串聯質譜法（Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry)測 定大鼠血漿中STS的方法，該方法的定量線性范圍為l-500ng/mL，實際上，其中的大鼠靜脈 注射后的最高血藥濃度高達l〇〇〇〇ng/mL，遠遠超過了方法學的驗證范圍，測定結果不準確； 此外，由于動物血漿的基質不同于人血漿基質，并且人血漿中常有合并用藥的情況，因此， 測定動物血漿的分析方法在特異性上也不能滿足人血漿樣品的測定要求；還研究公開STS 在血漿中不穩定，可能與光照等因素有關，但未對此進行方法學驗證，而保證STS在分析過 程中的穩定性是保證其人血漿濃度測定方法準確度的關鍵。
[0004] 鑒于現有技術存在的問題，本申請的發明人擬提供一種測定人血漿中丹參酮IIA 磺酸鈉濃度的方法。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是克服有技術存在的缺陷，提供一種簡便、快速、靈敏、可測定人體 血漿中丹參酮ΠΑ磺酸鈉血藥濃度的方法。
[0006] 本發明的測定人血漿中丹參酮IIA磺酸鈉濃度的方法，采用與現有的技術不同的 實驗方法，針對測定物進行了實驗條件優化：采用結構類似物為內標；樣品預處理過程采 用了無紫外線黃光安全燈（去除420nm以下波長的光線）條件下進行，控制STS降解；采用 了不同的分析色譜柱，以高強度硅膠顆粒C18為色譜柱填料，優化了流動相條件；采用甲酸 銨緩沖鹽溶液（含0. 3-0. 5mmol/L甲酸銨，10-20ppm甲酸）和乙腈的混合液作為流動相，等 度洗脫。本方法無需特殊的設備和試劑，具有操作簡便、快速、血漿用量少、成本低等優點， 適合常規血藥濃度監測。
[0007] 具體而言，本發明提供了一種測定人血漿中丹參酮IIA磺酸鈉濃度的方法，其特 征是，待測樣品經簡單預處理后，在酸性流動相下，經色譜柱分離，用串聯質譜檢測，包括以 下步驟：
[0008] 1)樣品預處理
[0009] 取待測樣品于離心管中，加入內標工作液、一定濃度的甲酸水溶液和定量的有機 溶媒沉淀蛋白，混旋，15000rpm離心后，吸取上清液，加含0. 1 %甲酸的50%甲醇水溶液，混 勻，4°C待測；
[0010] 本發明中，所述的內標為氘5-脫去氫表雄酮硫酸鈉鹽（DHEAS-D5)，蛋白沉淀劑甲 酸溶液濃度為5~15%，有機溶媒為甲醇、乙腈的混合物；
[0011] 樣品處理在無紫外線黃光安全燈（去除420nm以下波長的光線）條件下進行，能 控制STS降解，保證準確度；
[0012] 2)樣品分離
[0013] 采用通用型的液相色譜柱，其填料為高強度硅膠顆粒C18,高效液相系統采用通用 型高壓栗和進樣器，采用甲酸銨緩沖鹽溶液和乙腈的混合液作為流動相，等度洗脫，
[0014] 所述的甲酸銨緩沖鹽溶液中含0· 3-0. 5mmol/L甲酸銨，10-20ppm甲酸；
[0015] 本發明的一個實施例中，優選等度洗脫模式為甲酸銨緩沖鹽溶液（含 0.3-0.5mmol/L 甲酸銨，10-20ppm 甲酸）：乙腈為 60±10 : 40±10，V/V;
[0016] 3)樣品檢測
[0017] 采用通用型串聯質譜檢測器檢測丹參酮IIA磺酸鈉和內標的峰面積；
[0018] 質譜電離方式：電噴霧離子源；極性：負離子檢測；掃描方式：多反應離子檢測掃 描（MRM);離子通道選擇：STS :373. 3 - 357. lamu，DHEAS-D5 :373. 0 - 97. 8amu ;碰撞氣：氮 氣；
[0019] 本發明的一個實施例中，儀器參數優選設定為：掃描間隔：5±lms ;離子源參數： GSl :60±10psi ;GS2 :60±10psi ;氣簾氣：25psi±10 ;噴霧電壓：-4500±500V ;毛細管溫 度：550±100°C ;STS 和 DHEAS-D5 的碰撞能量：50±10eV ;運行時間：3±lmin ;
[0020] 4)濃度計算
[0021] 以樣品濃度為X軸，STS峰面積（As)和內標峰面積（Ai)的比值為Y軸，進行加權 回歸分析，采用標準曲線法推出未知血樣的濃度值（在標準曲線范圍內）。
[0022] 本方法中，待測樣品為人血漿。
[0023] 本發明的測定人血漿中丹參酮IIA磺酸鈉濃度的方法中，對待測樣品經簡單預處 理后，在酸性流動相下，經色譜柱分離，用串聯質譜檢測，無需特殊的設備和試劑，STS測定 的線性良好，濃度范圍均為2~1000ng/mL，方法回收率穩定，日內和日間的精密度（相對標 準差，RSD)均小于10%，本方法具有操作簡便、快速準確、血漿用量少靈敏度高、、成本低等 優點，適合臨床常規血藥濃度監測。
[0024] 本發明的有益效果有：
[0025] 1)內標選擇：采用結構類似物DHEAS-D5為內標，色譜行為相似，色譜峰出峰時間 接近，受到的基質效應干擾接近，保證質控過程的準確；
[0026] 2)預處理方法：一步有機溶媒蛋白沉淀法，簡便、價廉，適用于常規檢測，采用了 無紫外線黃光安全燈（去除420nm以下波長的光線）條件處理血漿樣品，成功控制STS降 解，保證了方法的準確度；
[0027] 3)分離條件：分離采用填料為高強度硅膠顆粒C18色譜柱作為固定相，乙腈和甲 酸銨緩沖鹽溶液的混合液作為流動相，等度洗脫，不受內源性物質基質效應的干擾；
[0028] 4)測定條件：測定采用通用型串聯質譜檢測，該方法不需色譜分離樣品和內標， 簡化了分析步驟，顯著提高了臨床血藥濃度檢測的效率；
[0029] 5)采樣量少：測定一份樣品只需0.1 ml血漿樣本；
[0030] 6)靈敏度高：通過針對樣品和內標采用不同的離子反應通道，避免樣品內標相互 干擾以及內源性物質的干擾，獲得最佳的響應信號，STS的最低定量限為2ng/mL ;
[0031] 7)特異性強：內源性物質和常用合并用藥對測定不干擾；
[0032] 8)測定時間短：每個樣品的色譜質譜分析測定過程為3min。
【附圖說明】
[0033] 圖1:典型色譜圖：未使用STS的健康受試者的空白血漿，其中，圖aSsts: 373. 3 - 357. lamu，圖 B 為內標 DHEAS-D5 :373. 0 - 97. 8amu。
[0034] 圖2 :典型色譜圖：空白血漿添加 STS和內標標準品（STS的濃度為LLOQ 2ng/ mL，內標的濃度為 200ng/mL)其中，圖 A 為 STS :373. 3 - 357. lamu，圖 B 為內標 DHEAS-D5 : 373. 0 - 97. 8amu。
[0035] 圖3 :使用STS的健康志愿者的血樣測定色譜圖，其中，圖A為STS : 373. 3 - 357. lamu，圖 B 為內標 DHEAS-D5 :373. 0 - 97. 8amu ;STS 血藥濃度為 198. 3ng/mL， 采血時間為靜脈滴注結束后10分鐘。
[0036] 圖4 :使用STS的患者的血樣測定色譜圖，其中，圖A為STS :373. 3 - 357. lamu， 圖B為內標DHEAS-D5 :373. 0 - 97. 8amu ;STS血藥濃度為358. 3ng/mL，采血時間為靜脈滴 注結束后2. 5分鐘。
【具體實施方式】
[0037] 實施例1
[0038] 色譜條件：日本島津UFLC系統：SIL-30AC自動進樣器（1臺），LC-30AD輸液栗（2 臺），D⑶-20A 5R在線脫氣儀（1臺），CBM-20A控制器（1臺），CT0-30A柱溫箱（1臺），美國 AB Sciex公司數據采集與處理軟件：Analyst 1.6. 1。美國Waters公司XSELECTTM HSS T3， 2· 1Χ100_，3· 5μπι，柱溫：室溫，流動相：含0.45mmol/L甲酸銨和18ppm甲酸水溶液：乙 腈（40 : 60, V/V);流速 0· 3mL · min S
[0039] 質譜條件：美國AB Sciex公司Triple Quad? 5500串聯質譜儀，質譜電離方式： 電噴霧離子源。離子源參數：GS1 :60psi ;GS2 :60psi ;氣簾氣：25psi ;噴霧電壓：-4500V ;毛 細管溫度：550°C;碰撞氣：氮氣，掃描方式：多反應離子檢測掃描（MRM) ;STS和DHEAS-D5的 碰撞能量：50± IOeV ;離子通道選擇：STS :373. 3 - 357. lamu，DHEAS-D5 :373. 0 - 97. 8amu ; 掃描間隔：5ms ;
[0040] 血漿樣品預處理
[0041] 取0.1 mL血樣于離心管中，加入10 μ L內標工作液、5 μ L-定濃度的甲酸水溶液和 200 μ L甲醇、乙腈的混合物沉淀蛋白，混旋10s，15000rpm離心10min，吸取上清液10 μ L，加 50 yL含0. 1%甲酸的50%甲醇水溶液，混勻，待測。內標法以峰面積定量。血漿樣品處理 在無紫外線黃光安全燈（去除420nm以下波長的光線）條件下進行；
[0042] 專屬性
[0043] (1)內源性物質的干擾：取不同來源的8名未使用STS的受試者的空白血漿（其 中含一份空白溶血血漿和一份空白高脂血漿），按照上述樣品預處理和測定方法進行測定， 結果未發現血漿內源性物質對STS和內標有干擾；
[0044] (2)內標對STS的干擾：方法驗證的每個含標準曲線的批次都需用空白基質配制 2份只含有內標化合物而不含STS的樣品，按上述方法處理分析，結果未發現內標化合物對 STS測定有干擾；
[0045] (3)基質效應：取6個獨