一種基于金雜化的氧化鎳鈷納米花構建的赭曲霉毒素傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明一種金雜化的氧化鎳鈷納米花構建的赭曲霉毒素傳感器的制備方法及應用。具體是采用具有良好電化學催化性能的金雜化的氧化鎳鈷納米花，制備一種檢測糧食中赭曲霉毒素的傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]赭曲霉毒素是繼黃吐霉毒素后又一個引起世界廣泛關注的霉菌毒素。它是由曲霉屬的7種曲霉和青霉屬的6種青霉菌產生的一組重要的、污染食品的真菌毒素，赭曲霉毒素是由多種生長在糧食(小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等)、花生、蔬菜(豆類)等農作物上的曲霉和青霉產生的。動物攝入了霉變的飼料后，這種毒素也可能出現在豬和母雞等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害動物肝臟與腎臟。這種毒素主要是引起腎臟損傷，大量的毒素也可能引起動物的腸黏膜炎癥和壞死，還在動物試驗中觀察到它的致畸作用。
[0003]目前生物傳感器已經廣泛用于各種真菌毒素的檢測，因為生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、結構簡單、操作簡便、易于小型化、可連續、快速自動化檢測分析等一系列優點。其中，由于無標記型傳感器可以直接用于檢測抗原抗體的識別過程并且避免了標記物帶來的干擾，得到了更加廣泛的關注。
[0004]本發明將金雜化的氧化鎳鈷納米花修飾到玻碳電極表面，構建無標記型傳感器。第一，金雜化的氧化鎳鈷納米花中的金具有良好的生物相容性，并且能夠有效地固定抗體；第二，金雜化的氧化鎳鈷納米花中的氧化鎳鈷納米花具有良好的電化學催化活性，能夠提高傳感器的靈敏度；第三，金雜化的氧化鎳鈷納米花的花狀結構具有大的比表面積，能夠進一步增加抗體的固定和增加催化過程的接觸面積。該方法在檢測過程中產生了良好的電化學信號，可用于赭曲霉毒素的分析。該方法具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速等優點，而且制備過程較為簡單，為目前有效檢測赭曲霉毒素提供了新途徑。

【發明內容】

[0005]本發明的目的之一是基于金雜化的氧化鎳鈷納米花構建無標記型生物傳感器。
[0006]本發明的目的之二是將該無標記型生物傳感器應用于赭曲霉毒素的高靈敏、特異性檢測。
[0007]本發明的技術方案如下
1.一種基于金雜化的氧化鎳鈷納米花構建的赭曲霉毒素傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的氧化鋁粉末對玻碳電極進行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮氣吹干；
(2)在電極表面滴加6yL濃度為1 ~ 2 mg/mL的金雜化的氧化鎳鈷納米花水溶液，干燥；
(3)繼續將6PL濃度為5 ~ 20 Pg/mL的赭曲霉毒素抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4°C冰箱中孵化1 h，清洗干凈；
(4)用3yL濃度為5 ~ 20 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°C冰箱中孵化1 h，清洗干凈；
(5)將6μ L濃度為0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素抗原用于和抗體的特異性識別，室溫下孵化1 h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲存備用。
[0008]金雜化的氧化鎳鈷納米花的制備
將0.5 ~ 2 mmol六水合硝酸鎳、1 ~ 4 mmol六水合硝酸鈷和3 ~ 12 mmol六次甲基四胺加入到10 ~ 40 mL乙醇和20 ~ 80 mL水的混合溶液中，室溫條件下攪拌10 min后，將上述溶液轉移到反應釜中，在90°C條件下反應4 h，離心洗滌后干燥，得到氧化鎳鈷納米花；
取0.1 ~ 0.4 g氧化鎳鈷納米花加入到10 ~ 40 mL無水乙醇中，隨后加入0.1 ~ 0.4mL的三氨丙基三乙氧基硅烷，將該混合溶液于70°C下反應1.5 h，冷卻到室溫，離心洗滌后干燥，得到氨基化的氧化鎳鈷納米花；
向10 ~ 40 mL的金納米水溶液中加入10 ~ 40 mg的氨基化的氧化鎳鈷納米花，震蕩12 h，離心洗滌后干燥，得到金雜化的氧化鎳鈷納米花。
[0009]赭曲霉毒素的檢測方法
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL的pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；
(2)選擇計時電流法對赭曲霉毒素抗原進行檢測，將輸入電壓設置為-0.4 V，取樣間隔設置為0.1 S，運行時間設置為400 S ；
(3)當背景電流趨于穩定后，每隔50s向磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL濃度為5mol/L的雙氧水溶液，然后記錄電流隨時間的變化，繪制工作曲線；
(4)將待測樣品溶液代替赭曲霉毒素抗原標準溶液進行檢測。
[0010]本發明的有益成果
(1)本發明采用金雜化的氧化鎳鈷納米花具有良好的生物相容性，通過形成金氮鍵化學鍵合至玻碳電極表面。
[0011](2)本發明采用的金雜化的氧化鎳鈷納米花對雙氧水具有優越的電化學催化性能，提高了生物傳感器的靈敏度。
[0012](3)本發明采用的金雜化的氧化鎳鈷納米花具有大的比表面積，能夠有效固定大量的抗體并增加催化過程的接觸面積。
[0013](4)本發明將制備的無標記型生物傳感器用于赭曲霉毒素的檢測，檢測限低，線性范圍寬，可以實現簡單、快速、靈敏和特異性檢測。
【具體實施方式】
[0014]實施例1 一種基于金雜化的氧化鎳鈷納米花構建的赭曲霉毒素傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的氧化鋁粉末對玻碳電極進行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮氣吹干； (2)在電極表面滴加6μ L濃度為1 mg/mL的金雜化的氧化鎳鈷納米花水溶液，干燥；
(3)繼續將6μ?濃度為5 Pg/mL的赭曲霉毒素抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4°C冰箱中孵化1 h，清洗干凈；
(4)用3μ L濃度為5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°C冰箱中孵化1 h，清洗干凈；
(5)將6μ L濃度為0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素抗原用于和抗體的特異性識別，室溫下孵化1 h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲存備用。
[0015]實施例2 —種基于金雜化的氧化鎳鈷納米花構建的赭曲霉毒素傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的氧化鋁粉末對玻碳電極進行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮氣吹干；
(2)在電極表面滴加6μ L濃度為1.5 mg/mL的金雜化的氧化鎳鈷納米花水溶液，干燥；
(3)繼續將6μ?濃度為10 Pg/mL的赭曲霉毒素抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4°C冰箱中孵化1 h，清洗干凈；
(4)用3μ L濃度為10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°C冰箱中孵化1 h，清洗干凈；
(5)將6μ L濃度為0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素抗原用于和抗體的特異性識別，室溫下孵化1 h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲存備用。
[0016]實施例3 —種基于金雜化的氧化鎳鈷納米花構建的赭曲霉毒素傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,