基于金屬離子特異響應的熒光檢測法在免疫檢測中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物免疫檢測技術領域，具體地說，設及基于金屬離子特異性響應的 巧光檢測方法在免疫檢測中的應用。
【背景技術】
[0002] 本發明是利用各種金屬離子巧光分子對金屬離子的特異性響應W及巧光分子與 金屬離子容易發生特異性反應從而引起自身巧光強度發生變化，并將運種變化應用于免疫 檢測的技術。由于不同濃度的金屬離子引起巧光強度的變化是不同的，因此，用巧光光譜儀 對相關巧光強度進行測量可實現免疫檢測中的定量檢測。
[0003] 巧光分子，因其具有最高可達單分子檢測的高靈敏度，對亞微粒也具有可視的亞 納米空間分辨能力和亞毫秒時間分辨能力，所W在原位檢測（巧光成像技術）W及利用光纖 進行遠距離檢測等方面具有眾多優勢，已經發展成為一項重要的檢測技術。在免疫檢測方 面，人們將免疫反應的特異性與巧光物質的敏感性、直觀性相結合開發出了一種新的免疫 檢測技術一-免疫巧光技術（IFA)。目前，在免疫巧光技術中常用的巧光標記物有：有機染 料、半導體量子點陣及稀±離子配合物。相比較半導體量子點陣及稀±離子配合物，有機染 料具有制作簡單、原料來源豐富、價格低的優點。但是，傳統有機染料的分子由于具有對光 不穩定、背景巧光干擾強W及與生物分子的連接缺少共性等不足使其在應用上受到很大限 制。
[0004] 金屬納米粒子因為能夠共價結合抗原和抗體，已被應用于抗原抗體的特異性檢 測，運方面最典型的就是膠體金免疫檢測技術。運一檢測技術主要是利用納米金的紅色，通 過抗體與納米金結合(金標抗體)，當抗原濃度較高時，金標抗體濃度也比較高，聚集產生紅 色：表示是陽性反應。由于運一檢測技術本身顯色機理的原因，其靈敏度較低，不適合用于 檢測低濃度的待測物，因此在應用上受到較大限制。而其他金屬納米粒子，如銀納米粒子、 氧化銅納米粒子等在免疫檢測中也一直沒有得到應用。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于彌補傳統免疫檢測技術中的不足，將金屬離子巧光檢測方法與 金屬納米標記免疫技術相結合，采用金屬納米作為信號放大系統，利用磁珠作為抗原和抗 體的載體，提供一種基于金屬離子特異響應的巧光檢測法在免疫檢測中應用的技術，它能 實現對測樣品的快速分離，具有操作簡便、檢測快速、準確性好、檢測成本低、靈敏度高的優 點，可在免疫分析檢測及臨床研究中發揮重要作用。
[0006] 為實現上述目的，本發明采取了W下技術方案。
[0007] -種基于金屬離子特異響應的巧光檢測法在免疫檢測中的應用。
[0008] 進一步，所述巧光檢測法為利用金屬離子促使巧光分子結構發生改變，使所述巧 光分子產生一個從無到有的巧光變化，所述巧光變化的強度能通過巧光光譜儀直接判斷和 測量。
[0009] 進一步，所述巧光分子含有金屬納米顆粒，所述金屬納米顆粒能通過化學反應產 生金屬離子，所述金屬離子與免疫檢測中的反應物結合在一起能引起金屬離子巧光強度發 生變化，且不同濃度金屬離子引起的巧光強度的變化程度是不同的，用巧光光譜儀對巧光 強度的變化進行測量便能實現對待測樣品的定量檢測。
[0010] 進一步，在基于金屬離子特異響應的巧光檢測中采用磁珠作為抗原、抗體的載體。
[0011] 進一步，所述磁珠采用活化試劑進行活化，經活化后的磁珠能與抗原、抗體相結 合，進而實現對抗原和抗體的負載。
[0012] 進一步，所述活化試劑為采用戊二醒或者水溶性的碳二亞胺縮合劑。
[0013] 本發明的積極效果是： (1)將傳統的金屬離子巧光檢測方法與金屬納米標記免疫技術相結合并應用于免疫檢 測中，不僅解決了傳統巧光分子與生物蛋白分子連接困難的問題，實現了對檢測信號的有 效放大，而且避免了傳統免疫試驗中酶的使用，解決了酶催化反應對實驗條件要求苛刻而 產生的問題。
[0014] (2)采用磁珠作為抗原、抗體的載體，實現了對待測樣品的快速分離，使檢測過程 更簡便快速，使檢測的準確性、靈敏度都有很大的提高。
[0015] (3)利用化學反應代替傳統的酶催化過程并將所述巧光檢測方法引入生物免疫檢 巧。，縮短了反應時間，提高了體系的穩定性，降低了檢測成本，可在免疫分析檢測及臨床研 究中發揮重要作用。
【附圖說明】
[0016] 附圖1為采用酶標板作為抗原、抗體的載體，基于銀離子特異響應的巧光檢測法 在免疫檢測中的應用的流程圖。
[0017] 附圖2為采用磁珠作為抗原、抗體的載體，基于銀離子特異響應的巧光檢測法在 免疫檢測中的應用的流程圖。
[0018] 圖中的標號分別為： 101、酶標板； 102、磁珠； 2、包被抗體； 3、抗原； 4、標記抗體； 5、銀納米顆粒； 6、銀離子巧光分子。
【具體實施方式】
[0019] W下結合附圖繼續介紹本發明基于金屬離子特異響應的巧光檢測法在免疫檢測 中的應用的【具體實施方式】。提供4個實施例。應當指出，本發明的實施不限于W下所述的 實施方式。
[0020] 實施例1 采用酶標板作為抗原、抗體的載體，基于銀離子特異響應的巧光檢測法在甲胎蛋白 (AFP)檢測中的應用（參見圖1 )，應用中，酶標板101可采用96孔酶標板、48孔酶標板或384 孔酶標板等不同孔數的酶標板，所述酶標板均包含可拆與不可拆兩種型號，酶標板的顏色 包含黑色、白色W及無色透明色。所用包被抗體2為單克隆AFP抗體；所用抗原3采用AFP 抗原；所用銀標抗體為用銀納米顆粒5標記的多克隆AFP標記抗體4 ;所用金屬離子巧光分 子檢測液為含有銀離子巧光分子6的巧光檢測液。
[0021] 首先，將包被抗體2吸附在酶標板101上。
[0022] 然后，將包被抗體2修飾的酶標板101與抗原3結合，并進一步與由標記抗體4與 銀納米顆粒5相連接而得到的銀標抗體相連接。
[0023] 第三通過銀納米顆粒5與抗原3的對應關系，越多的抗原3能結合更多的銀納米 顆粒5,可通過銀納米顆粒5實現對抗原3的標記及信號的放大。
[0024] 最后，向標記好銀納米顆粒5的酶標板101中加入銀離子巧光檢測液(銀離子巧光 分子6)，通過測試銀離子巧光檢測液的巧光強度能定量出體系中銀納米顆粒5的多少，實 現對抗原3的檢測。
[0025] 其具體操作步驟如下(結合圖1進行說明）： (1)采用酶標板101作為抗原、抗體的載體（內容同上)。
[0026] (2)制備銀離子巧光檢測液 ①采用化合物A作為銀離子巧光分子；所述化合物A的結構式為：
式中Et=乙基。
[0027] 所述化合物A自身處于一種巧光關閉的狀態，沒有巧光；但是，當有銀離子存在 時，銀離子會與化合物A發生反應，致使化合物A的結構發生改變而轉換成化合物B;化合 物B自身卻有著很強的巧光，從而能實現一個巧光從無到有的變化：
式中Et=乙基。
[002引②銀離子巧光檢測液的配置 將銀離子巧光分子6溶于乙醇與水的混合溶劑中（含20%乙醇)，構成混合溶劑并使銀 離子巧光分子6的最終濃度保持在1~20iiM;向混合溶劑中分別加入雙氧水與憐酸的水 溶液，保持溶液中雙氧水和憐酸的最終濃度分別為10~lOOmM和1~20iiM;超聲，使各成 分混合均勻；然后置于4°C條件下保存備用。
[0029] ③對制得的銀離子巧光檢測液的測試 取100yL銀離子巧光分子溶液注入10yL的20~50yM硝酸銀溶液，反應lOmin后， 用530~560nm可見光激發，可觀察到明顯的巧光產生，采用巧光分光光度儀測試，在585nm 處有強的巧光，即認為該銀離子巧光檢測液對銀粒子有靈敏的響應，可應用于免疫檢測。
[0030] (3 )制備銀標抗體 ①將銀納米顆粒5與抗體結合，選擇直徑為5nm~200nm的銀納米顆粒5 :取lOmL的 1~20nM銀納米顆粒5溶液加入1~5yL5mg?血1的AFP多克隆抗體，將混合好的溶液 置于搖床上混合12~2地。（注：當銀納米顆粒5直徑大于200皿時，加入雙氧水，銀離子 的溶出速度會比較緩慢，需要超過化，而且銀離子很難完全溶出；當銀納米顆粒5直徑小于 5nm時，銀納米顆粒5完全溶出所產生的銀離子數小于1〇3,不足W達到所需的放大效果)。
[0031] ②向得到的銀標抗體溶液中加入200yL1~5%牛血清白蛋白（BSA)對銀納米顆 粒5表面沒有結合甲胎蛋白多克隆抗體的部分進行封閉，25°C搖床上混合12h，后置于4°C 條件下保存備用。
[0032] ③對制得的銀標抗體的測試 I、經紫外可見吸收光譜表征，證明獲得的是銀標抗體。
[0033]II、經抗體活性測試，證明銀標抗體保持了原有的抗體活性。
[0034] III、結論：制備的銀標抗體可用于免疫檢測。
[0035] 注：W上各步驟可一并做，也可W分開做，是為進行巧光檢測的前序部分或者準備 部分。
[0036] (4)W甲胎蛋白（AFP)為例進行免疫檢測 ①將AFP的單克隆包被抗體2溶于抑=9. 6的碳酸鹽緩沖液中（4yg?mL1)，在酶標板 101的每個孔中加入100yL的上述溶液，4°C條件下過夜。
[0037] ②用憐酸鹽吐溫緩沖液（PBST)清洗步驟①的酶標板101S至五次，加入100~ 400yL1%的牛血清白蛋白（BSA)封閉。
[0038] ③用憐酸鹽吐溫緩沖液（PBST)清洗步驟②的酶標板101S至五次，加入不同濃度 的甲胎蛋白（AFP)，在37°C條件下解育1~化。
[0039] ④用憐酸鹽吐溫緩沖液（PBST)清洗步驟③的酶標板101S至五次，加入100~ 200yL步驟（3)制備的銀標抗體，在37°C條件下解育1~化。
[0040] ⑥用憐酸鹽吐溫緩沖液（PBST)清洗步驟④的酶標板101S至五次，加入100yL步 驟（2)制備的銀離子分子溶液，反應30min后，通過巧光光譜進行定量檢測。
[0041] 檢測實施例1中巧光強度的表征意義(檢測原理） (1)當甲胎蛋白濃度較高時，結合相應量的銀標抗體，加入雙氧水腐蝕后產生較高濃度 的銀離子，從而會促使較多的銀離子巧光分子發生反應，檢測液會產生較強的巧光。
[0042] (2)當甲胎蛋白濃度較低或者濃度為0時，產生的銀離子濃度響應較低或者不產 生銀離子，從而只有較少量的銀離子分子發生反應或者沒有銀離子分子發生反應，銀離子 巧光檢測液的巧光強度也相對較弱或者是沒有巧光。
[0043] (3)本發明能利用銀標抗體在對甲胎蛋白（AFP)的檢測中實現用巧光法檢測甲胎 蛋白。但是，采用實施例1的方法容易產生較強的背景巧光干擾，從而影響檢測的靈敏性