一種用于檢測紅霉素的熒光偏振免疫分析方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫分析技術和獸藥殘留檢測領域，具體涉及一種用于檢測紅霉素的 焚光偏振免疫分析方法。
【背景技術】
[0002] 紅霉素（Erythromycin，ERY)是第一個問世的大環內酯類藥物，主要用于治療由 革蘭氏陽性菌及支原體引起的畜禽疾病，還被用作飼料添加劑來提高飼料轉化率，促進生 長。但是該類化合物在畜禽體內代謝緩慢，易殘留在動物體內，能夠對機體產生副作用，這 對人們的健康造成一定的威脅。因此，世界各國對紅霉素在動物性食品中殘留限量均做出 了要求。歐盟自2006年起禁止所有抗生素用作促生長的飼料添加劑使用，EC1181/2002規 定紅霉素在畜禽組織中的最高殘留限量不得超過200 μ g/kg，我國農業部235號也明確規 定了紅霉素在肌肉、牛奶和脂肪等產品中的最高殘留限量。
[0003] 目前監測動物源性食品中紅霉素殘留的方法見報道的主要有儀器檢測方法。主要 有：高效液相-串聯質譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法等，雖然這些儀器方法準確度高、 重復性好、適用于定量檢測等優點，但是設備價格昂貴，操作復雜，需要專門的技術人員，難 以實現樣品的大規模篩選和推廣。
[0004] 免疫檢測方法以其靈敏、高效、特異、簡便的優點在藥物殘留檢測領域已被廣泛應 用。其中常用的酶聯免疫吸附方法和免疫測流層析技術，由于需要多步分離和洗滌操作，而 耗時較長。

【發明內容】

[0005] 本發明針對現有的紅霉素免疫檢測技術中，操作復雜、耗時長等缺點，建立一種用 于檢測紅霉素的熒光偏振免疫分析方法，整個檢測過程只需要一步競爭反應，操作簡單、快 速。
[0006] 本發明的目的是提供一種用于檢測紅霉素的熒光偏振免疫分析方法。
[0007] 本發明所提供的用于檢測紅霉素的熒光偏振免疫分析方法，包括下述步驟：
[0008] 1)將一系列已知濃度的紅霉素標準品的溶液分別與熒光標記物溶液以及紅霉素 單克隆抗體溶液混合，孵育進行競爭反應，測定所得體系的熒光偏振值；以測定的熒光偏振 值為縱坐標，所述一系列已知濃度的磺胺二甲基嘧啶標準品的濃度為橫坐標，繪制標準曲 線；
[0009] 2)以待測樣品代替步驟1)中的紅霉素標準品，按照步驟1)中的加樣量，將所述待 測樣品與所述熒光標記物溶液以及所述紅霉素單克隆抗體溶液混合，孵育進行競爭反應， 測定所得體系的熒光偏振值，根據步驟1)中的標準曲線，計算出所述待測樣品中紅霉素的 濃度。
[0010] 上述方法步驟1)中，所述熒光標記物為紅霉素半抗原與熒光素的偶聯物。
[0011] 所述紅霉素半抗原選自下述任意一種：紅霉胺（ERM)和羧甲基羥胺改造后的紅霉 素半抗原（ERY-CMO)。
[0012] 所述熒光素選自下述任意一種：異硫氰酸熒光素（FITC)、二氯三嗪基氨基熒光素 (DTAF)、AF647羧酸琥珀酰亞胺酯（AF647)以及4' -氨甲基熒光素（4' -AMF)。
[0013] 具體地，所述熒光標記物具有表1所示的結構。
[0014] 表1各焚光標記物的結構
[0015]
[0016] 優選的，所述熒光標記物為ERM-FITC。
[0017] 所述紅霉素單克隆抗體選自實驗室雜交瘤細胞株5B2、6C1和6D9所 分泌的單克隆抗體5B2、6C1和6D9中的任意一種（Zhanhui Wang et al.，Food Chemistry, 2015, 171，98-107)。
[0018] 優選的，所述紅霉素單克隆抗體為5B2。
[0019] 所述一系列已知濃度的紅霉素標準品的溶液的溶質為紅霉素標準品，溶劑為硼酸 鹽緩沖液。
[0020] 所述硼酸鹽緩沖液的摩爾濃度為45-55mmol/L，pH值為8. 0-8. 5。
[0021] 所述一系列已知濃度為 1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62. 5ng/mL、 31. 25ng/mL、15. 625ng/mL、7. 8125ng/mL、3. 906ng/mL 和 I. 953ng/mL 10 個梯度濃度。
[0022] 所述熒光標記物溶液的濃度為工作濃度，所述熒光標記物的工作濃度為標記物的 熒光值是背景值（緩沖溶液）10倍時對應的濃度，為15nM。
[0023] 所述紅霉素單克隆抗體溶液的濃度為工作濃度，所述抗體結合曲線中50%的抗體 結合時的抗體稀釋倍數作為抗體的工作濃度，為8ug/mL。
[0024] 步驟1)和步驟2)中，所述紅霉素標準品的溶液、所述熒光標記物溶液和所述紅霉 素單克隆抗體溶液以等體積混合，所述體積具體可為70 μ L-100 μ L，具體可為70 μ L。
[0025] 步驟1)和步驟2)中，所述競爭反應的溫度為20_25°C，優選為25°C，時間為 l_5min，優選為 2min〇
[0026] 步驟1)和步驟2)中，所述熒光偏振值的測定條件為：當所述熒光標記物為 ERM-FITC、ERM-DTAF 或 ERY-CMO-4' -AMF 時，激發波長為 485nm，發射波長為 530nm，cutoff 值為515nm ;當所述熒光標記物為ERM-AF647時，激發波長為644nm，發射波長為685nm， cutoff 值為 665nm。
[0027] 所述標準曲線的繪制依據OriginPro 8.0軟件中的四參數方程進行。
[0028] 步驟2)中，所述待測樣品可為動物性食品，具體可為牛奶。
[0029] 上述方法在動物性食品中紅霉素含量檢測中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0030] 所述動物性食品具體可為牛奶。
[0031] 本發明的有益效果是：
[0032] 現有的紅霉素檢測技術操作繁瑣耗時，不能滿足高通量快速檢測的要求，而且其 他免疫分析方法大多為非均相的反應，需要多步孵育和洗滌步驟，耗時長，操作復雜。針對 這些不足，本發明提供了一種均相的、快速的紅霉素熒光偏振免疫檢測方法。方法只需要加 樣，無需分離和洗滌操作，十分鐘內就可獲得檢測結果。本發明通過對三種單克隆抗體和四 種紅霉素熒光標記物的篩選，建立了高效、靈敏的紅霉素熒光偏振免疫分析方法。方法在硼 酸鹽緩沖溶液中標準曲線的靈敏度為7. 39ng/mL，檢測范圍為1. 85-29. 47ng/mL，由于牛奶 基質稀釋了 14倍，在牛奶中的檢測限為14. 08 μ g/L ;該方法快速、簡便高通量，而且能夠滿 足紅霉素的殘留檢測限量要求，非常適合牛奶中紅霉素的檢測需求。
[0033] 本發明所應用的焚光偏振免疫分析技術（Fluorescence Polarization Immunoassay, FPIA)是一種不需要分離和洗滌的均相免疫分析方法。由于操作簡單、快速， 更適用于自動化的高通量篩選等優點，逐漸成為臨床、食品和環境等領域中小分子分析的 常用技術。而且，牛奶中紅霉素殘留的FPIA快速檢測技術還未見報道。
【附圖說明】
[0034] 圖1為四種熒光標記物與三種抗體建立標準曲線的IC5。值比較。
[0035] 圖2為硼酸鹽緩沖液中紅霉素熒光偏振免疫檢測的標準曲線。
【具體實施方式】
[0036] 下面通過具體實施例對本發明進行說明，但本發明并不局限于此。
[0037] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法；下述實施例中所 用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0038] 下述實施例中所使用的紅霉素單克隆抗體為雜交瘤細胞株5B2、6C1和6D9所分泌 的單克隆抗體中的任意一種（Zhanhui Wang et al.，Food Chemistry, 2015, 171，98-107)。
[0039] 實例1、基于半抗原紅霉胺的熒光標記物的制備
[0040] 以ERM-FITC為例，合成方法如下：
[0041] 稱取0· 2mg紅霉胺標準品和Img FITC粉末，加入到200 μ L DMF中振蕩至溶解；加 入50 μ L三乙胺，室溫避光反應7天；取50 μ L反應液用薄層色譜法（TLC)分離，以純FITC 為對照，展開劑為二氯甲烷/甲醇（V:V，1:1);刮取硅膠板上刮下Rf= 0. 5的黃色條帶，甲 醇洗脫，檢測備用。經質譜鑒定，ERM-FITC產物峰m/z為1123. 4。
[0042] 其他紅霉胺的熒光標記物如：DTAF、四甲基羅丹明磺酰氯、AF647的反應步驟與 FITC的標記方法類似，熒光標記物存放在4°C。
[0043] 實例2、基于改造后紅霉素半抗原的熒光標記物的制備
[0044] 步驟1 :紅霉素半抗原的改造
[0045] 將含有44mg羧甲基羥胺NaHCO3調節pH到5-6之間的2mL蒸餾水逐滴加入到含有 IOOmg紅霉素原料的ImL無水乙醇中；置50°C恒溫水浴中攪拌反應5h ;反應結束后，自然冷 卻至室溫，加水淬滅，調節溶液pH值為酸性；用二氯甲烷萃取兩遍，合并二氯甲烷層，加入 無水Na 2SO4振搖，靜置過夜；取二氯甲烷層，40 °C減壓旋蒸至干，用5mL DMF溶解，-20 °C保 存。
[0046] 步驟2 :改造后紅霉素熒光標記物（ERY-CMO-4' -AMF)的合成
[0047] 稱取 200 μ L ERY-CMO 的 DMF 溶液與含有 0· 4mg NHS 與