一種測定甲磺酸達比加群酯中基因毒性雜質的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物分析領域，具體地，涉及一種利用HPLC (高效液相色譜）測定甲磺 酸達比加群酯中基因毒性雜質的方法。
【背景技術】
[0002] 甲磺酸達比加群酯為達比加群的前藥，系德國勃林格殷格翰公司開發，于2008年 4月在德國和英國率先上市，這是繼華法林之后50年來上市的首個新類別口服抗凝血藥 物，是抗凝血治療領域和潛在致死性血栓預防領域的一項重大進展，具有里程碑意義。
[0003] 然而在甲磺酸達比加群酯藥物合成中，磺酸類物質與微量的低級醇在合成反應中 生成烷基磺酸酯如甲磺酸甲酯（麗S)、甲磺酸乙酯（EMS)，這些物質可與DNA發生烷基化反 應，從而可能成為引發癌癥的誘因。
[0004] 磺酸酯類化合物作為潛在的基因毒性雜質，可以盡量控制條件或改變工藝路徑 來避免這些雜質的生成，同時各種分析技術手段用于研究檢測磺酸酯類物質的限度，如 GC-MS、HPLC-MS和手性色譜法，以及各種新型的檢測器類型如MS、ELSD得到應用，提高了檢 測效率和靈敏度。目前對磺酸酯類雜質的檢測研究仍然以GC-MS和HPLC-MS為主。
[0005] 本專利申請人發現，用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，有機相與磷 酸緩沖液的混合溶劑作為流動相梯度洗脫，可檢測出甲磺酸達比加群酯中磺酸酯類雜質， 且靈敏度高，可以有效控制原料藥質量，解決了基因毒性無法定性定量分析檢測的難題。

【發明內容】

[0006] 本發明提供一種利用HPLC測定甲磺酸達比加群酯中磺酸酯類基因毒性雜質的方 法，從而實現對甲磺酸達比加群酯中磺酸酯類基因毒性雜質在原料藥中的控制。
[0007] 本發明的技術方案：提供一種利用HPLC測定磺酸酯類基因毒性雜質的方法， 選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以有機相與緩沖液的混合溶劑作為流動相梯度 洗脫。
[0008] 檢測步驟如下：采用色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以有機相與緩沖 液的混合溶劑作為流動相梯度洗脫，柱溫20°C~30°C，流速為0. 6~1.0 mL/min。
[0009] 所述有機相為選自乙腈。
[0010] 所述緩沖液為磷酸緩沖液。緩沖液的濃度范圍為〇. 005mol/L~0. 05mol/L，優選 0.Olmol/L〇
[0011] 所述的磷酸可以用用醋酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀代 替。
[0012] 所述緩沖液的pH值為4. 0~5. 0。
[0013] 所述流動相為有機相與緩沖液的混合溶劑梯度洗脫，以有機相為流動相A，以緩 沖液為流動相B，按0-20分鐘，流動相A比例為90%，流動相B比例為10%，20-30分鐘，流動 相A比例為70%，流動相B比例為30%，30-50分鐘，流動相A比例為90%，流動相B比例為 10%進行梯度洗脫。
[0014] 所述的檢測條件：柱溫20°C~30°C，優選25°C ;流速為0. 6~1.0 mL/min，優選 0· 8mL/min。檢測波長為 220nm± 10nm，優選 220nm。
[0015] 本發明所述的檢測方法，可以依照以下方法實現： (1)取待檢測樣品適量，用乙腈或它與水的混合溶劑溶解，配制成合適濃度的樣品溶 液。
[0016] (2)取磺酸酯類雜質適量，用乙腈或它與水的混合溶劑溶解，配制成合適濃度的對 照品洛液。
[0017] (3)設置流動相的流速為0· 8mL/min ;檢測波長220nm ;色譜柱溫度為25°C。
[0018] (4)分別取（1)、2)的樣品溶液和對照品溶液10μ L，注入高效液相色譜儀，完成甲 磺酸達比加群酯中磺酸酯類毒性雜質的含量測定。
[0019] 本發明的技術效果：通過利用HPLC，對甲磺酸達比加群酯原料藥中基因毒性雜質 (或疑似基因毒性）磺酸酯類毒性雜質進行痕量檢測分析，靈敏度可達lppm。
【具體實施方式】
[0020] 下面詳細描述本發明的實施例，需要說明的是下面描述的實施例是示例性的，僅 用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。另外，如果沒有明確說明，在下面的 實施例中所采用的所有試劑均為市場上可以購得的，或者可以按照文本或已知的方法合成 的，對于沒有列出的反應條件，也均為本領域技術人員容易獲得的。
[0021] 實施例1 儀器：Agilentl260高效液相色譜儀，1260紫外檢測器 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（250 X 4. 6mm，5 μ m); 流動相A :乙腈 流動相B :0· Olmol/L的磷酸緩沖液（ρΗ4· 5) 梯度洗脫見下表； 流速：〇· 8mL/min
檢測波長：220nm 柱溫：25°C 進樣體積：10 μ L 稀釋劑：乙腈 試驗步驟： 供試品溶液：稱取甲磺酸達比加群酯樣品I. 〇〇14g置IOmL量瓶，用稀釋劑溶解并稀 釋至刻度，搖勻。
[0022] 對照品溶液：分別精密稱取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯對照品各10.0 Smg，分別置 IOOmL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液A和Β。精密量取1.0 mL貯備液A 和Β，分別置IOOmL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液C和D，精密量取1.0 mL 貯備液C和D，分別置IOmL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（lppm)。
[0023] 分別取對照品、供試品溶液，在上述色譜條件下進行高效液相色譜分析，記錄色譜 圖，圖中保留時間為4. 32min的色譜峰為甲磺酸甲酯色譜峰，保留時間為5. 23的色譜峰為 甲磺酸乙酯，采用面積歸一化法計算雜質含量。
[0024] 結論：甲磺酸達比加群酯樣品中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量均小于lppm。
[0025] 對照例 采用現有技術中的GC-MS方法對甲磺酸達比加群酯中的基因毒性雜質進行檢測分析， 進一步驗證本發明所采用方法的準確度和靈敏度。
[0026] 色譜柱：DB_1 毛細管柱（3〇m X0. 25mm，0. 25Mm); 溶劑：正己烷； 載氣：氦氣； 進樣口 ：分流，溫度210°C ; 柱溫：程序升溫l〇〇°C保持3分鐘后以15°C每分鐘升溫到200°C保持5分鐘； 柱流速：2. Oml/min ; 分流進樣：分流比10:1 ; 進樣模式：頂空進樣； 頂空進樣器：爐溫KKTC保溫10分鐘，針溫度KKTC，進樣量Iml ; MS參數：采用全掃描模式；采集質量數范圍：40-510。
[0027] 供試品溶液：稱取甲磺酸達比加群酯樣品適量，精密稱定，先用少量水溶解，再用 丙酮并定容制成l〇mg/ml溶液； 對照品溶液：分別精密稱取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯對照品適量，精密稱定，用丙酮溶 解并稀釋配成〇· 〇2mg/ml溶液。
[0028] 分別取對照品、供試品溶液，依法頂空進樣，記錄色譜圖，計算色譜峰面積。
[0029] 結果顯示甲磺酸達比加群酯樣品中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量與采用本發 明的HPLC法測定的含量相符。
【主權項】
1. 一種測定甲磺酸達比加群酯中基因毒性雜質的方法，其特征在于：色譜柱以十八 烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以有機相與緩沖液的混合溶劑作為流動相梯度洗脫，柱溫 20°C~30°C，流速為 0? 6 ~1.0 mL/min。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：以有機相為流動相A，以緩沖液為流動 相B，按0-20分鐘，流動相A比例為90%，流動相B比例為10%，20-30分鐘，流動相A比例為 70%，流動相B比例為30%，30-50分鐘，流動相A比例為90%，流動相B比例為10%進行梯度 洗脫。3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述有機相為乙腈。4. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述緩沖液為選自磷酸緩沖液。5. 根據權利要求4所述的方法，其中磷酸用醋酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫 鉀、磷酸氫二鉀代替。6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述緩沖液的pH值為4. 0~5. 0。7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：流動相的流速為0. 8mL/min。8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：柱溫為25°C。9. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：檢測波長為220 ±10nm。
【專利摘要】本發明公開了一種測定甲磺酸達比加群酯中基因毒性雜質的方法。選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，以有機相與緩沖液的混合溶劑梯度洗脫作為流動相直接進行檢測。該檢測方法檢測靈敏度高、專屬性強、精密度高、準確性強、操作方便，且該方法的適用性很廣，有效控制原料藥的質量。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號】CN105092720
【申請號】CN201410214738
【發明人】嚴潔, 李軒
【申請人】天津市漢康醫藥生物技術有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2014年5月21日