G-sers基底的制備方法及癌細胞檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及集成光學及醫學，尤其涉及銀納米結構-石墨稀-金納米結構器件的制備方法及癌細胞檢測方法。
【背景技術】
[0002]癌癥是醫學上一個重大難題，從癌癥的發現到確診不僅浪費較多的時間而且花費巨額的金錢，這些問題困擾癌癥患者和醫務工作者多年。開發一種可靠、簡單、有效、低成本的手段對癌細胞和正常細胞進行檢測和診斷是很有必要的。拉曼光譜利用光學的非彈性散射效應發展而來的技術，經過多年的發展，表面拉曼光學增強得到廣泛研究，可以用于生物檢測、成像、分子選擇等領域。但是，目前研究表明對癌細胞的檢測和診斷需要標簽物質標記癌細胞，標簽物質標記癌細胞在其過程中可能對細胞有所破壞，這不僅提高了其成本，同時也增加了相應的難度。
[0003]利用生物熒光蛋白對癌細胞標記，在熒光顯微鏡下能夠實現對癌細胞的觀察，但生物熒光蛋白的成本較高且需要對癌細胞的提前預知。這種方式成本高，工藝復雜，需要對細胞的培育導致培育周期長，效率較低。
[0004]活性納米材料導入癌細胞，利用表面增強拉曼光譜鑒別癌細胞的方式提供了一種有效的檢測方式(專利公開號CN103487425A)，活性納米粒子的制備和導入是一種繁瑣、高成本的過程，電穿孔導入納米材料可能對活細胞帶來破壞，導致細胞信息的丟失，對細胞的鑒別和檢測帶來不可控的因素。
[0005]隨著表面增強拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectra, SERS)的不斷發展，科研工作者開發出越來越多的基底材料。據文獻報道，雖然這些基底材料利用不同工作原理增強表面拉曼信息各有優勢，但是對癌細胞進行標記是必須經歷的處理手段，這使得利用基底對表面拉曼光譜的增強遠離了實際應用。
[0006]石墨烯是近年來發展較為迅速的新型碳材料，由于其良好的化學穩定性和良好的物理特性已經被廣泛的應用于不同領域。石墨烯具有良好的生物相容性，被視為一種優秀的生物結構材料。石墨烯的拉曼特性研究已經較為成熟，根據石墨烯與生物質的化學相互作用可以很好的了解生物質的結構信息，但是石墨烯的拉曼信號較弱，生物靈敏度較低，阻礙了其在生物探測上的應用。由于石墨烯結構特征一一單原子層厚度，光作用路徑短，利用其特性從而開發出了一種能夠有效增強石墨烯拉曼信號的方式一一石墨烯表面增強拉曼光譜(Graphene surface enhanced Raman spectra, G-SERS)。這是利用表面結構對光電場局域以及表面等離子波增加光和石墨烯有效作用，從而增強石墨烯拉曼強度提高其靈敏度。雖然表面增強拉曼光譜能夠提高石墨烯拉曼信號的靈敏度，但是對單純生物質/癌細胞的信號的增強有限，也限制了其實際應用。
【發明內容】
[0007]針對現有技術的缺陷，降低癌細胞檢測成本，提高檢測的可靠度，利用表面增強拉曼的原理設計并開發出一種簡單、通用、快捷、成本低的方法實現了對癌細胞的檢測。該方法能夠有效提高石墨烯表面增強拉曼的信號，由于癌細胞與石墨烯的相互作用使石墨烯拉曼特征峰發生變化，從而實現對癌細胞的檢測，利用癌細胞和正常細胞與石墨烯之間相互作用不同所提供了特征峰發生變化，從而實現對癌細胞與正常細胞的診斷。該方法在增強石墨烯拉曼的同時也能增強癌細胞和正常細胞的拉曼信號，癌細胞和正常細胞在該基底上產生不同的拉曼特征峰，該特征峰也為癌細胞的診斷提供有利可靠的證據。
[0008]為了解決現有技術中問題，本發明提供了一種G-SERS基底的制備方法，G-SERS基底為銀納米結構-石墨稀-金納米結構器件，其制備方式如下:
[0009]步驟1:金納米結構的制備:
[0010]通過鍍膜機電子束蒸鍍的方式，超低真空度條件下，將高純金蒸鍍在硅基底上，蒸鍍速率0.5-5埃/秒，形成1-1Onm厚度的金膜，從而在娃基底上形成不同的金納米結構；
[0011]步驟2:制備石墨烯-金納米結構基底；
[0012]步驟3:銀納米結構-石墨烯-金納米結構器件的制備:將步驟2中得到的石墨烯-金納米結構基底置于電子束蒸鍍腔中，低真空度條件下，蒸鍍速率0.5-5埃/秒，控制時間5-20秒，在石墨稀-金納米結構基底上蒸鍍得到1-1Onm厚度的銀納米結構，從而得到銀納米結構-石墨稀-金納米結構器件。
[0013]作為本發明的進一步改進，步驟I中所述超低真空度為低于8e_7torr，步驟3中低真空度為低于5e-7torr。
[0014]作為本發明的進一步改進，在娃基底上形成不同的金納米結構為納米顆粒和/或納米條。
[0015]作為本發明的進一步改進，步驟2中，制備石墨稀-金納米結構基底的方法為:將氧化石墨烯溶解在去離子水中形成4-10mg/ml的溶液，將其溶液利用勻膠機甩膜的方式在上述步驟I的基底上形成均勾的氧化石墨稀薄膜，制備成氧化石墨稀-金納米結構基底，將得到的氧化石墨烯-金納米結構基底置于高溫管式爐中在惰性氣體600-1000攝氏度退火處理0.5-2小時，制備成石墨稀-金納米結構基底。
[0016]作為本發明的進一步改進，成膜條件:低速600轉/秒，經歷45秒；高速2000轉/秒，經歷12秒。
[0017]作為本發明的進一步改進，步驟2中，制備石墨稀-金納米結構基底的方法為:將化學氣相沉積得到石墨烯通過快速轉移的方式轉移到上述步驟I的基底上得到石墨烯-金納米結構基底。
[0018]—種癌細胞的檢測方法，
[0019]步驟A:
[0020]將肝癌細胞和正常肝細胞各自培養瓶中的培養液倒出，并用滴管滴加0.05-1毫升的胰酶清洗殘留的培養液；接著用去離子水清洗3?5次并倒出；再向培養瓶中加入0.05-1毫升胰酶用于將細胞從培養瓶壁解離下來，并用I?500毫升去離子水將其稀釋得到肝癌細胞和正常細胞的稀釋液；
[0021]步驟B:
[0022]分別將肝癌細胞和正常肝細胞的稀釋液分別滴加在銀納米結構-石墨烯-金納米結構G-SERS器件和硅基底上，所述G-SERS基底為權利要求1至6任意一種制備方法所得到的G-SERS基底，將其烘干得到樣品:肝癌細胞/G-SERS、正常肝細胞/G-SERS、肝癌細胞/Si和正常肝細胞/Si，用于拉曼檢測；
[0023]步驟C:
[0024]采用雷尼紹inVia拉曼光譜儀，采用1800線/毫米光柵，激發波長514.5nm作為入射光照射上述步驟A的樣品得到相應的拉曼光譜；正常細胞/Si和肝癌細胞/Si的拉曼光譜沒有任何區別；將肝癌細胞/G-SERS通過與G-SERS器件和正常肝細胞/G-SERS的拉曼光譜對比，由于癌細胞的特異性基團與石墨烯化學作用從而使石墨烯拉曼特征峰發生變化:石墨烯的D峰(?1350cm-l)半峰寬變窄，同時G峰(?1580cm_l)半峰寬變寬，2D峰(?2650cm-l)退化，2G峰(?2980cm_l)增強，并發生了峰形狀的畸化；同時在?1200cm_l、?1500cm-l、?3100cm-l處出現一個較強的癌細胞特征峰，這些為癌細胞的檢測和診斷提供了可靠的依據，而從而實現對癌細胞的檢測和鑒別。
[0025]本發明的有益效果是:
[0026]尺寸小:該方法制備的微納結構器件尺寸可以小到微米。
[0027]測試效率高:利用金屬微納結構對表面拉曼進行增強，增加入射光與物質的作用幾率，能夠使癌細胞的結構信息更為靈敏的表達出來，提高了檢測和診斷的效率。
[0028]不需要對癌細胞進行預處理和標記:克服了現有技術需要提前對癌細胞進行標記的困難，同時提高了檢測診斷的準確性和可靠性。
【附圖說明】
[0029]圖1不同金屬納米結構微觀圖；
[0030]圖2金屬納米結構在石墨烯表面的微觀圖；
[0031]圖3不同結構及材料的反射吸收譜；
[0032]圖4表面增強石墨烯拉曼光譜；
[0033]圖5細胞在G-SERS基底上的光學照片；
[0034]圖6肝癌細胞和正常肝細胞在硅基底上的拉曼光譜；
[0035]圖7是銀納米結構-石墨烯-金納米結構器件示意圖。
【具體實施方式】
[0036]下面結合附圖對本發明做進一步說明。
[0037]如圖7所示，為銀納米結構-石墨烯-金納米結構器件，其制備方式如下:
[0038]步驟1:金納米結構的制備。
[0039]通過鍍膜機(Syskey Technology)電子束蒸鍍的方式，超低真空度(低于8e-7torr)條件下，將高純金(99.999% )蒸鍍在硅基底(Si，?8mm X 10mm)上，蒸鍍速率0.5-5埃/秒，形成1-1Onm厚度的金膜，從而在娃基底上形成不同的金納米結構(納米顆粒，納米條)。
[0040]步驟2:石墨稀-金納米結構基底的制備。
[0041]方法一:將氧化石墨烯溶解在去離子水中形成大約4-10mg/ml的溶液，將其溶液利用勻膠機(KW-4B智能勻膠機)甩膜的方式在上述步驟I的基底上形成均勻的氧化石墨稀薄膜，制備成氧化石墨稀-金納米結構基底。成膜條件:低速600轉/秒，經歷45秒；高速2000轉/秒，經歷12秒。具有梯度轉速的成膜條件更有利于形成均勻平整的氧化石墨烯膜。將得到備的氧化石墨烯-金納米結構基底置于高溫管式爐(0TF-1200X-100，合肥科晶材料技術有限公司)中在惰性氣體(如高純氬氣，99.999% )600-1000攝氏度退火處理0.5-2小時，制備成石墨稀-金納米結構基底。
[0042]方法二:將化學氣相沉積得到石墨烯通過快速轉移的方式轉移到上述步驟I的基底上得到石墨稀-金納米結構基底。
[0043]步驟3:銀納米結構-石墨稀-金納米結構器件的制備。
[0044]將步驟2中得到的石墨烯-金納米結構基底置于電子束蒸鍍腔中，低真空度(低于5e-7torr)條件下，蒸鍍速率0.5-5埃/秒，控制時間5_20秒，在石墨烯-金納米結構基底上蒸鍍得到1-1Onm厚度的銀納米