熱穩定的dna聚合酶的表征的制作方法
【專利說明】熱穩定的DNA聚合酶的表征
【背景技術】
[0001] 用于擴增核酸序列的聚合酶鏈式反應（PCR)方法是本領域眾所周知的，且公開在 例如美國專利號4, 683, 202、4, 683, 195和4, 965, 188中。在PCR擴增的每個循環中，將雙 鏈靶序列變性，使引物與變性的靶序列的每條鏈退火，并通過DNA聚合酶的作用來延伸(伸 長）引物。這些步驟可以分別總結為變性、退火和延伸步驟。在典型PCR所用的高溫下，弓丨 物僅與預期的靶序列雜交。但是，擴增反應混合物通常在室溫組裝，遠低于引物的雜交溫 度。在這樣的低嚴謹條件下，引物可能結合僅部分地互補的序列或其它引物并引發不希望 的延伸產物的合成。這些不希望的延伸產物與靶序列一起被擴增，且該擴增與期望的靶序 列的擴增競爭，從而降低特異性擴增的效率。本領域已知幾種用于在PCR反應過程中增加 效率和減少非特異性擴增的方法。例如，最初如下進行熱啟動方法：在最初的高溫溫育步 驟以后手工打開反應試管，并加入缺少的試劑（例如DNA聚合酶）。通過開發化學修飾的 DNA聚合酶，進一步改進了該方法。化學修飾的DNA聚合酶是可逆的滅活聚合酶，其通過共 價修飾而滅活，所述共價修飾位于酶的活性部位或造成使該酶無活性的構象變化。所述化 學修飾可以被熱逆轉，由此將該酶轉化成它的活性形式。因此，含有處于它的無活性形式的 DNA聚合酶的、預裝配的反應混合物可以直接用于擴增，無需在第一個高溫溫育步驟以后添 加酶的額外步驟。化學修飾的DNA聚合酶和修飾它們的方法描述在美國專利號5, 773, 258 和 5, 677, 152 中。
[0002] 高質量DNA聚合酶可用于多種應用，諸如需要進行的PCR擴增的高效率和特異性 的、非常復雜的診斷試驗。

【發明內容】

[0003] 本發明尤其提供了使用質譜法表征DNA聚合酶的方法。具體地，本文提供的方法 可以用于檢測DNA聚合酶中的化學賴氨酸修飾，由此表征所述DNA聚合酶的活性水平。
[0004] 在一個方面，提供了檢測賴氨酸修飾的DNA聚合酶中的共價賴氨酸修飾的數目的 方法。所述方法包括（i)在穩定修飾的pH檢測賴氨酸修飾的DNA聚合酶的質量；和（ii) 通過將賴氨酸修飾的DNA聚合酶的質量與不含賴氨酸修飾的聚合酶進行對比，計算賴氨酸 修飾的DNA聚合酶中的賴氨酸修飾的數目，其中所述賴氨酸修飾的數目是所述賴氨酸修飾 的DNA聚合酶的質量與所述不含賴氨酸修飾的聚合酶之差除以所述賴氨酸修飾的質量，由 此檢測所述DNA聚合酶中的賴氨酸修飾的數目。
[0005] 在某些實施方案中，通過DNA聚合酶與修飾試劑的反應，形成共價賴氨酸修 飾。在其它實施方案中，所述修飾試劑是二羧酸酸酐。在某些實施方案中，所述二羧酸酸 酐選自馬來酸酐、檸康酸酐、順式-烏頭酸酐、2, 3-二甲基馬來酸酐、外-順式-3, 6-橋 氧-A4-四氫鄰苯二甲酸酐和3, 4, 5, 6-四氫鄰苯二甲酸酐。在某些實施方案中，所述共 價賴氨酸修飾是檸康酰基修飾。在某些實施方案中，所述共價賴氨酸修飾是烏頭酰化的 (aconitylated)修飾。在某些實施方案中，所述共價賴氨酸修飾是2,3-二甲基馬來酰化 (2,3-dimethylmaleated)的修飾。
[0006] 在某些實施方案中，所述賴氨酸修飾的DNA聚合酶的質量是計算機可讀的質量。 在某些實施方案中，在計算機環境中構建不含賴氨酸修飾的聚合酶的質量，由此形成計算 機可讀的標準質量。在某些實施方案中，所述計算是在計算機上進行。
[0007] 在某些實施方案中，所述穩定修飾的pH是至少8。在某些實施方案中，在步驟（i) 的檢測即將開始之前和過程中，所述DNA聚合酶基本上不含有非離子去污劑。
[0008] 在某些實施方案中，所述方法進一步包括，在步驟（i)的檢測之前，用酶將賴氨酸 修飾的DNA聚合酶片段化，所述酶在所述聚合酶內的已知位點處將所述聚合酶片段化。在 某些實施方案中，所述酶是胰蛋白酶。在某些實施方案中，所述方法包括，檢測賴氨酸修飾 的DNA聚合酶的片段的質荷比，和將所述賴氨酸修飾的DNA聚合酶的片段的質量與不含賴 氨酸修飾的聚合酶的潛在片段的質量進行對比，由此確定所述聚合酶中的特定賴氨酸處的 賴氨酸修飾的位置。
[0009] 在某些實施方案中，一個或多個賴氨酸修飾會封閉酶，由此阻止一種或多種片段 的形成和/或增加得到的片段的大小。在某些實施方案中，所述方法包括，檢測賴氨酸修飾 的DNA聚合酶的片段的相對量，和任選地將所述賴氨酸修飾的DNA聚合酶的片段的相對量 與不含賴氨酸修飾的聚合酶的潛在片段的預測相對量進行對比，由此確定所述聚合酶中的 特定賴氨酸處的賴氨酸修飾的相對水平。
[0010] 在某些實施方案中，賴氨酸修飾的位置對應于Taq GOLD聚合酶的氨基酸位置 540、663或738。在某些實施方案中，賴氨酸修飾的位置對應于Taq Z05聚合酶的氨基酸位 置 542、665 或 740。
[0011] 在某些實施方案中，本文提供的方法包括，檢測在所述氨基酸位置處的修飾的相 對量，其中所述修飾的相對量是在所述位置處的修飾的賴氨酸的量除以在所述位置處的修 飾的和未修飾的賴氨酸的量的總和，由此檢測所述位置處的修飾的相對量。
【附圖說明】
[0012] 圖1?四極飛行時間質量分析儀的簡圖（得自Siuzdak, G, "The Expanding Role of Mass Spectrometry in Biotechnology"）。
[0013] 圖2. S Z05的完整分析：（A)總離子色譜圖；(B)質譜圖；(C)解卷積質量。S Z05 的理論質量是61，076. 04。通過質譜圖的解卷積得到的質量是60, 874. 91，這與在18ppm (1. llamu)內的N-端甲硫氨酸和丙氨酸殘基的丟失相符。
[0014] 圖3.使用高pH完整分析來確定10-19個檸康酰基修飾在S Z05 GOLD上的總分 布。每個峰代表S Z05的質量+指定數目的檸康酰基修飾。
[0015] 圖4.被修改成與LCMS相容的PCR主要混合物的分析。增加酶濃度，且排除鹽、 dNTP、UNG和DMS0。該主要混合物在加速貯存條件下的分析指示檸康酰基修飾在高溫下的 顯著損失。在4°C的貯存表明4個月以后凈損失2個修飾。
[0016] 圖5.含有檸康酰基修飾百分比的、Taq GOLD和Z05 GOLD中的賴氨酸殘基的圖 譜。
[0017] 圖6. Taq GOLD和Z05 GOLD的DNA聚合酶結構域中的賴氨酸殘基的對比。Z05 GOLD具有5個額外賴氨酸的凈值，它們都在某種程度上被修飾。在Taq中的K540、K663和 K738和在Z05中的它們的等同物都被嚴重修飾。缺少外切核酸酶結構域的Taq的分子模型 (前視圖）指示，它們處于關鍵位置。
【具體實施方式】
[0018] I?定義 在本文中使用的縮寫具有它們在化學和生物學領域中的常規含義。
[0019] "聚合酶"表示執行模板指導的多核苷酸合成的酶。DNA聚合酶可以僅向新形成的 鏈的3'末端添加游離核苷酸。這導致新形成的鏈在5'-3'方向的延伸。沒有已知的DNA 聚合酶能夠開始新鏈（從頭）。DNA聚合酶可以僅向預先存在的3'-OH基團添加核苷酸，且 因此需要引物，它可以在所述引物處添加第一個核苷酸。引物可以包含例如RNA和/或DNA 堿基以及非天然存在的堿基。新形成的鏈（子鏈）的方向性與DNA聚合酶沿著模板鏈移動 的方向相反。聚合酶的非限制性例子包括原核DNA聚合酶（例如Pol I、Pol II、Pol III、 Pol IV和Pol V)、真核DNA聚合酶、端粒末端轉移酶、逆轉錄酶和RNA聚合酶。逆轉錄酶是 從RNA模板合成DNA的、RNA依賴性的DNA聚合酶。逆轉錄酶家族含有DNA聚合酶功能性 和RNA酶H功能性，其降解與DNA發生堿基配對的RNA。RNA聚合酶是在基因轉錄過程中使 用DNA作為模板合成RNA的酶。RNA聚合酶在RNA轉錄物的3'末端處聚合核糖核苷酸。
[0020] 術語"熱穩定聚合酶"是指對熱穩定的酶，其是耐熱的，當經受升高的溫度并持續 影響雙鏈核酸變性所必需的時間時，其保留足夠的活性以影響隨后的多核苷酸延伸反應， 并且沒有變得不可逆變性的（失活的）。核酸變性所需的加熱條件是本領域熟知的，在例 如美國專利號4, 683, 202、4, 683, 195和4, 965, 188中舉例說明。如本文所述，熱穩定聚 合酶適于在溫度循環變化的反應如聚合酶鏈式反應（"PCR"）中使用。用于本文目的的 不可逆變性指酶活性的永久且完全的損失。對于熱穩定聚合酶，酶活性是指以適當的方 式催化核苷酸的組合以形成與模板核酸鏈互補的多核苷酸延伸產物。來自嗜熱菌的熱穩 定DNA聚合酶包括，例如來自海棲熱袍菌（TXerazo toga azari )、水生棲熱菌（ a識嗜熱棲熱菌（黃棲熱菌（Z7an/6〇、絲狀棲 熱菌（、棲熱菌屬種（species) spsl7、棲熱菌屬種（ species) Z05、熱堅芽抱桿菌caJt/otenax)、那不勒斯棲 熱袍菌（和非洲棲熱腔菌（TXeiTffosijOAo 的 DNA 聚合 酶。
[0021] 本文中提供的"化學修飾的DNA聚合酶"表示具有至少一個共價地連接的修飾的 DNA聚合酶，所述修飾使得所述DNA聚合酶至少基本上無活性。在某些實施方案中，所述共 價修飾僅連接至DNA聚合酶的特定種類的氨基酸（例如，僅連接至賴氨酸，或僅連接至精氨 酸，等）。在某些實施方案中，所述修飾僅發生在氨基酸的已知集合處（例如，僅在賴氨酸和 精氨酸上等）。在某些實施方案中，所述修飾可以僅發生在聚合酶中的特定位點處（例如， 在特定子序列處）。在某些實施方案中，所述修飾連接至DNA聚合酶的賴氨酸。在所述修飾 連接至賴氨酸的情況下，所述DNA聚合酶被稱作"賴氨酸修飾的" DNA聚合酶。
[0022] 術語"化學修飾的"和"可逆滅活的"在全文中互換使用，且與那些術語的平常普 通用法保持一致。因而，本文中提供的術語"可逆地無活性的"或"可逆地滅活的"表示所 有或幾乎所有DNA聚合酶活性的可逆損失。所述修飾是"可逆的"，因為所述修飾可以在某 些條件（例如，熱）下除去以產生基本上有活性的酶。
[0023] 本文中提供的術語"修飾試劑"表示能夠與DNA聚合酶的氨基酸反應從而形成共 價氨基酸（例如賴氨酸修飾）的化學化合物。
[0024] "穩定修飾的pH"是使DNA聚合酶的化學修飾（例如共價賴氨酸修飾）保持基本 上穩定（連接至聚合酶）的pH。例如，在液相色譜法（LC)分離和隨后對修飾的聚合酶的四 極飛行時間質譜法（Q