檢測磺胺類藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及水產品檢測的技術領域，尤其設及一種檢測橫胺類藥物的膠體金免疫 層析試紙條及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 橫胺類藥物（SAs)是具有對氨基苯橫酷胺該一母核結構的一類藥物的總稱，多被 用來預防和治療感染性疾病。橫胺類藥物的發展至今已有70多年的歷史，先后合成的橫胺 類藥物多達8500種，其中，藥物毒性作用小、治療效果好的有幾十種，臨床上常用的則有20 多種，如SD、SMZ、SM,等。橫胺類藥物是最早用于抗感染的合成藥，具有廣泛的抗菌作用， 能很好的抑制大多數的革蘭氏菌，也可W較好的抑制沙口氏菌、大腸桿菌和某些放線菌、衣 原體等病菌。雖然1940年W后，新出現的各種抗生素逐漸取代了橫胺類藥物的使用，但該 類藥物W其抗菌作用廣泛、性質穩定、價格便宜等優點，仍被廣泛的用于畜牧和水產養殖業 中，來預防和治療細菌感染性疾病，或被用作動物飼料添加劑，使動物飼料的利用率更高， 同時也加快動物的生長速度。
[0003] 橫胺類藥物可W通過各種途徑進入動物體內，長期使用或使用不當時，藥物會在 動物體內殘留并累積，當轉移到肉、蛋、乳等食品中時，會對人體健康造成危害，主要表現為 細菌的耐藥性、過敏反應、對人體器官的毒性作用。橫胺類藥物殘留損害泌尿系統，導致腎 損傷，藥物的抗原性可W刺激體內抗體的形成，造成過敏反應，主要表現為皮疹、藥熱、光敏 性皮炎等癥狀，當產生剝脫性皮炎、多形性紅斑時，可導致多器官衰竭而死亡。長時間攝入 含有橫胺藥物超標的食品，會使骨髓白細胞的生長受到抑制，引起再生障礙性貧血、溶血性 貧血、血小板減少癥。當細菌對某一橫胺藥物形成耐藥性W后，對其他的橫胺藥也容易形成 交叉的耐藥性，長時間食用含有殘留的橫胺藥物的食物后，殘留的藥物除對人體產生毒副 作用外，也容易產生耐藥菌株，使藥物失去治療疾病的價值。
[0004] 目前，常用于檢測橫胺藥物殘留量的方法主要包括；理化分析法、微生物學檢測法 和免疫分析檢測法。常見的理化分析檢測法有高效液相色譜法、色譜-質譜聯用技術、薄層 色譜法、毛細管電泳法等，該些檢測方法靈敏度高，檢測結果可靠，常作為確證方法檢測藥 物殘留，但設備昂貴，樣品前處理過程復雜，對操作人員要求高，耗時較長，不適合批量樣品 的快速檢測。微生物學檢測法不需要專業昂貴的儀器，但操作耗時長，特異性、敏感性差，容 易受其他藥物的干擾，在定量上尚不成熟，檢測結果有時不能滿足國家最高殘留限量的要 求，不能滿足現代檢測的需要。隨著免疫學和免疫技術的飛速發展，免疫分析法迅速發展起 來，成為檢測藥物殘留的一種新型方法。免疫分析法主要是利用抗原、抗體的特異性結合來 檢測藥物、蛋白質、激素、微生物等各種物質，主要分為；放射性免疫法、酶聯免疫吸附法、免 疫傳感器法、膠體金免疫層析技術等。膠體金免疫層析技術是一種新型的免疫標記技術，是 在免疫層析的基礎上建立起來的，W膠體金為示蹤物與抗原、抗體特異性反應相結合的一 種檢測技術。該檢測方法結果判讀簡單，不需要專業的操作人員，檢測時間短，攜帶方便，特 別適合大批量樣品的藥物殘留的快速篩查。
[0005] 在現有技術中，利用膠體金免疫法檢測橫胺類藥物殘留的研究也有不少，但大都 是針對單個橫胺藥物殘留檢測法的研究。王浩等研制了檢測SM,的膠體金免疫試紙條，適 用于檢測牛奶樣品，最低檢測限；25113/111以馮梁采用膠體金免疫層析技術，建立了檢測SM2 殘留的方法，研制的試紙條對SM2標準液的檢出限達到了 5ng/mU豬尿樣品的檢出限；50 ng/mU用市售的化ISA試劑盒檢測的48份豬尿樣品，試紙條法與ELISA法檢測的陽性結 果符合率可達96. 9%。鄒新海成功研制了檢測SMZ的膠體金免疫試紙條，優化了實驗條件， 最終試紙條的檢出限；100ng/mU與其他藥物無交叉性反應，在牛奶樣品中的加標回收率 為92. 49(^112. 6%。李奎等建立了快速檢測橫胺類藥物殘留的免疫膠體金法，適用于檢測 雞蛋和雞肉樣品，對SMM、SMD、SDM、SD四種橫胺藥物的檢出限均為lOng/mU樣品回收率為 44. 8%~60. 9%。而臨床、養殖中常用的橫胺藥物有二十多種，在實際應用中，研究檢測某一種 橫胺藥物殘留的方法有很大局限性，多殘留檢測的方法更具有實際研究的價值。
[0006] 有鑒于此，本發明人研究和設計了一種檢測橫胺類藥物的膠體金免疫層析試紙條 及其制備方法，本案由此產生。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高、操作簡便，檢測快速、準確并適 合現場使用的專口用于檢測橫胺類藥物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，W便對多 種橫胺類藥物進行同時檢測。
[000引為實現上述目的，本發明解決其技術問題的技術方案是： 一種檢測橫胺類藥物的膠體金免疫層析試紙條，包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維素包被 膜、吸水墊及PVC底板，所述樣品墊、所述結合墊、所述硝酸纖維素包被膜及所述吸水墊依 次搭接在所述PVC底板上，所述結合墊包被設有橫胺類單克隆抗體-膠體金標記物；所述硝 酸纖維素包被膜上設有檢測線和質控線，所述檢測線包被有橫胺類藥物抗原，所述質控線 包被有羊抗鼠IgG。
[0009] 一種檢測橫胺類藥物的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括W下步驟： 步驟一、膠體金的制備：取1個250mL燒杯，加入100mL0.01%氯金酸溶液，于恒溫磁 力攬拌器上使用溫度檔350 °C對其進行加熱，轉速為3(K)r/min，加熱至沸騰狀態后，沸騰 時的實際溫度為100 °C，向燒杯中快速加入500化1%巧樣酸=鋼溶液，燒杯中的溶液變 為紅色后再加熱10min,直至溶液透亮，冷卻至室溫，4°C密封保存，即制得膠體金； 步驟二、金標抗體的制備及純化；取調好抑為7. 4的所述膠體金1mL于1. 5mL離屯、 管中，向離屯、管中加入31?也/ml的橫胺類藥物單克隆抗體，用禍旋儀禍旋10min后靜置20 min;向離屯、管中加入100化10%BSA溶液，用禍旋儀禍旋lOmin，靜置10min,制得金標抗 體，即橫胺類藥物單克隆抗體-膠體金標記物； 同時，將制得的金標抗體溶液于4°C2500r/min，離屯、10min,去除下層沉淀，將上清 液轉到另一離屯、管中，于4°C9000r/min，離屯、30min,去除上清液，將沉淀用膠體金稀釋 溶液稀釋至原體積的1/20,于4 °C保存備用； 步驟S、試紙條的組裝；（1)將硝酸纖維素包被膜，即NC膜，和吸水墊分別貼于PVC底 板上，吸水墊壓住NC膜上方1-2mm; (2)將粘貼好NC膜和吸水墊的PVC底板在切條機上切 割成4mm寬的試紙條；（3)將樣品墊和結合墊切成4mm寬的條，同時將結合墊浸泡金標抗 體溶液中，并于37°C烘干，制得金標墊；（4)烘干后的金標墊剪成1cm長的小塊并貼于PVC底板上，金標墊壓住NC膜下方1-2mm，同時用樣品墊壓住金標墊下方1-2mm，根據試紙條 長度修剪樣品墊；（5)在結合墊和吸收墊之間的NC膜上依次包被橫胺類藥物抗原和羊抗鼠 IgG，分別作為檢測線和控制線，采用BioDot劃膜儀進行包被劃線，具體參數為平臺移動速 度40mm/s，單位噴量：檢測線為0. 8yL/cm，質控線為1. 0yL/cm，使得橫胺類藥物抗原包被 濃度為0. 05mg/mL;羊抗鼠IgG包被濃度為0. 8mg/mL。
[0010] 作為實施例的優選方式，在所述步驟=(3)中，還包括對樣品墊和金標墊進行前處 理的步驟，即將樣品墊與金標結合墊用切條機分別切成4mm寬的長條，用含有5%的庶糖、 5%BSA和終體積濃