專利名稱：幾丁質酶幾丁質－結合片段的制作方法
本申請是1998年3月12日申請的美國系列申請09/039,198的接續申請。
通過幾丁質酶可降解幾丁質。在植物、微生物和動物中均發現了幾丁質酶。細菌幾丁質酶為細菌生長提供了碳源。昆蟲產生幾丁質酶以便在每次蛻皮時消化其外皮。在植物中，認為幾丁質酶提供抵御寄生性真菌的保護作用。已從許多細菌(例如粘質沙雷氏菌，Jones等，EMBO J.，5467-473(1986))、植物(例如煙草，Heitz等，Mol.Gen.Genet.，245246-254(1994))和昆蟲(例如黃蜂，Krusgnandeng，生物化學雜志(J.Biol.Chem.，)26920971-20976(1994))中克隆了幾丁質酶，并根據序列相似性將其分為兩個不同的家族，命名為18家族和19家族(Henrissat和Bairoch，生物化學雜志(Biochem，J.)293781-788)。盡管18家族酶的催化區域在許多種間于很大程度上是保守的，但對于幾丁質-結合結構域而言，種間只有很有限的序列相似性。多個家族18幾丁質-結合結構域的唯一共有特征是存在多個半胱氨酸殘基。
已在哺乳動物中鑒定了與細菌、昆蟲和植物幾丁質酶有較低同源性的蛋白質(低于40％的氨基酸同一性)，例如人軟骨gp39(c-gp39)[Hakala等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)26825803-25810(1993)]，人糖蛋白YKL-40[Johansen等歐洲癌癥雜志()31A1437-1442(1995)]，來自綿羊的輸卵管特異性的雌激素誘導的蛋白質[DeSouza等，Endocrinology，1362485-2496(1995)]，牛和人；以及來自激活的小鼠巨噬細胞的分泌蛋白[Chang等，GenbankM94584]。但是，尚未報道這些蛋白質的幾丁質降解活性。這些蛋白質的功能是未知的，但是已認為它們與組織的再成型有關。Hakala等(同上文)報道在來自類風濕性關節炎患者的滑液和軟骨樣品中可檢測到C-gp39，但在正常人的所述樣品中則檢測不到。Recklies等關節炎風濕病(Arthritis Rheumatism)36(9 SUPP L.)S190(1993)報道了C-gp39蛋白在軟骨表層不同細胞種群中的位置。Johansen等(同上文)報道YKL-40血清水平的測量值是標志轉移性疾病之程度和患復發性乳腺癌患者之存活的潛在預測標記。
Escott等感染與免疫(Infect.Immun.)634770-4773(1995)說明了在人白細胞和人血清中幾丁質酶的活性。Overdijk等糖生物學(Glycobiology)4797-803(1994)描述了從人血清和大鼠肝中分離幾丁質酶(4-甲基umbelliferyl-四-N-乙酰殼四糖苷(acetylchitotetraoside)水解酶)。Renkema等生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2702198-2202(1995年2月)從高歇氏病患者的脾中制備了人殼三糖酶。其制品有幾丁質酶酶活性，該文章報道了該制品蛋白質組分的少量氨基酸序列(22個氨基末端殘基和胰蛋白酶片段的21個殘基)。人幾丁質酶的功能還是未知的，但在該文章中未說明與高歇氏病的病理生理學的關系。同一研究小組的后一篇文獻[Boot等生物化學雜志270(44)26252-26256(1995年11月)]描述了克隆編碼有幾丁質酶酶活性之產物的人巨噬細胞cDNA。由該研究小組在其1995年2月的文章中所報道的部分氨基酸序列與人巨噬細胞cDNA產物的推測氨基酸序列相配。另外參見國際專利公開WO96/40940，其中報道了編碼50kD和39kD產物的兩種不同的人殼三糖酶cDNA，這兩種產物都是完全有酶活性的。Renkema等歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)244279-285(1997)報道，人幾丁質酶開始是作為50kD蛋白質在巨噬細胞中產生的，然后部分加工成在溶酶體中積累的39kD形式，還報道了可變剪接產生編碼一種40kD幾丁質酶的人幾丁質酶特有mRNA.39kD和40kD這兩種同種型都是C末端截短的并都有完全的幾丁質酶酶活性，但很難結合幾丁質。
就在無免疫應答個體中，越來越多的真菌感染威脅生命的情況來看，現在本領域仍需要鑒定用于診斷和治療真菌感染的新物質和方法。
在SEQ ID NO1和SEQ ID NO3中列出了編碼人幾丁質酶的推測等位基因變體的兩種人cDNA核苷酸序列，包括非編碼5’和3’序列。人幾丁質酶編碼區對應于SEQ ID NO1的核苷酸2-1399或SEQ ID NO3的核苷酸27-1424，不含其信號序列的成熟分泌的人幾丁質酶蛋白質的推測編碼序列對應于SEQ ID NO1的核苷酸65-1399或SEQ IDNO3的核苷酸90-1424。在SEQ ID NO2和SEQ ID NO4中分別列出了由SEQ ID NOS1和3之DNA編碼的多肽的氨基酸序列。21個氨基末端氨基酸(SEQ ID NOS2和4的位置-21至-1)含有一信號肽，裂解該信號肽后產生成熟的人幾丁質酶蛋白質(SEQ ID NOS2和4的位置1至445)。已確定人幾丁質酶的72個C末端殘基對于幾丁質酶酶活性是不重要的。下文實施例5說明了如何生產不含人幾丁質酶72個C末端殘基的N末端片段；在氨基酸373的密碼子后導入終止密碼子產生約39kD重組幾丁質酶片段，與全長重組人幾丁質酶相比，該片段有相似的特異性幾丁質酶酶活性。在美國系列申請08/877599(1997年6月6日申請)中詳細描述了人幾丁質酶cDNA的克隆和表達，以及重組人幾丁質酶的生物學活性，所述申請是美國系列申請08/663618(1996年6月14申請)的接續申請，兩者均全文引入本文作為參考。
本發明是以如下意想不到的發現為基礎即人幾丁質酶的基本上全部幾丁質結合活性均包含在該445個氨基酸酶的99個C末端氨基酸殘基內。本發明具體提供幾丁質結合、幾丁質酶失活的多肽產物。優選的幾丁質酶片段產物含有人幾丁質酶之54個C末端氨基酸內的幾丁質-結合片段，包括由人幾丁質酶的約99個C末端氨基酸組成的片段(SEQ ID NO2的約殘基347至445)，由人幾丁質酶的約72個C末端氨基酸組成的片段(SEQ ID NO2的約殘基374至445)，由人幾丁質酶的約54個C末端氨基酸組成的片段(SEQ ID NO2的約殘基392至445)，由人幾丁質酶的約49個C末端氨基酸組成的片段(SEQID NO2的約殘基397至445)。本發明還提供了包括編碼所述多肽片段之DNA的純化的分離的多核苷酸；含所述DNA的載體，特別是其中所述DNA與表達控制DNA序列有效相連的表達載體；用所述DNA以可在人幾丁質酶片段產物的宿主細胞中進行所述表達的方式穩定轉化或轉染的宿主細胞；生產人幾丁質酶多肽片段產物的方法，包括在營養培養基中培養所述宿主細胞，然后從所述宿主細胞或所述營養培養基中分離所述多肽；由該方法生產的純化的、分離的多肽；含有與異源肽或多肽融合的所述多肽的融合蛋白，異源肽或多肽包括酶例如分泌的堿性磷酸酶(SEAP)；含所述人多肽片段產物的組合物；含有與抗真菌劑結合的人幾丁質酶多肽片段產物的組合物以及通過施用所述組合物，優選同時施用其他非幾丁質酶抗真菌劑來治療真菌感染的方法；含與可檢測標記(包括放射性同位素、熒光團、染料、電子致密化合物和酶)結合的幾丁質酶多肽片段的組合物，利用所述組合物確定樣品中是否存在幾丁質或確定幾丁質含量的方法，所述方法包括(a)將樣品與結合有可檢測標記的人幾丁質酶多肽片段產物接觸，(b)確定與幾丁質結合的標記片段產物的數量，用于診斷樣品中是否存在幾丁質的試劑盒；特異性結合人幾丁質酶的幾丁質結合、幾丁質酶失活片段的單克隆抗體，包括特異性與SEQ ID NO2中所列人幾丁質酶的54個C末端氨基酸內表位結合的抗體；優選的單克隆抗體243Q和243M，與243Q和243M競爭的抗體或者結合與243Q和243M一樣之表位的抗體。
本發明的幾丁質酶多肽片段產物包括基本上保持了幾丁質結合活性而沒有保留主要幾丁質酶酶活性的人幾丁質酶片段或其等位基因變體，所述片段的類似物，含所述片段或類似物的融合蛋白。幾丁質酶多肽片段產物用于如下文所述的治療和診斷應用。
本發明設想的“幾丁質-結合結構域”片段是由SEQ ID NO2的氨基酸殘基X至Y代表并且保留了幾丁質結合活性的其部分，其中X是從347至397的連續整數，Y是445。一個優選的片段由人幾丁質酶的99個C末端氨基酸組成(SEQ ID NO2的殘基347-445)；在實施例7中已列出了該片段，該片段保留了成熟幾丁質酶的80％的幾丁質結合活性。其他優選片段是人幾丁質酶的54個C末端氨基酸(SEQ IDNO2的殘基392-445)，和人幾丁質酶的49個C末端氨基酸(SEQ IDNO2的殘基397-445)，已在實施例7中說明所述片段保留了幾丁質結合活性。如實施例7中所說明的，含人幾丁質酶的99個C末端氨基酸的融合蛋白含有該蛋白質的幾丁質-結合結構域。用所述99個氨基酸之區域的N末端和C末端截短以及含這些截短物之融合蛋白的幾丁質結合活性來定義幾丁質-結合結構域的邊界。這些截短物包括N末端從氨基酸殘基347、374、392、395、397、400或409開始，C末端在氨基酸殘基431、443或445的片段。
類似物可含有幾丁質酶片段類似物，其中可缺失或取代一個或多個特定的(即天然編碼的)氨基酸或者其中增加一個或多個非特定的氨基酸(1)沒有丟失一種或多種幾丁質酶特異性的生物活性(包括幾丁質結合活性)或者免疫學特征；或(2)幾丁質酶的特定生物活性有殘缺。本發明設想可以對本領域已知的保守氨基酸進行取代而不會影響所述片段的生物活性。
本發明優選的DNA序列包括基因組和cDNA序列以及編碼沒有幾丁質酶酶活性的人幾丁質酶之幾丁質-結合片段的全部或部分化學合成的DNA序列，其類似物，以及含所述片段或類似物的融合蛋白。本發明設想的核苷酸序列是編碼SEQ ID NO2之位置X至Y的氨基酸序列的那些，其中X是從347-392的連續整數，Y是445。SEQ ID NO1的核苷酸1238-1399(編碼SEQ ID NO2的殘基392至445)是本發明特別優選的DNA序列。本發明還設想了該DNA序列和在標準嚴緊條件下與其非編碼鏈雜交或者可以雜交但遺傳密碼豐余并編碼幾丁質酶之幾丁質-結合片段的其他DNA序列。舉證性的嚴緊條件如下42℃，在50％甲酰胺中雜交，60℃，用0.1×SSC，0.1％SDS洗滌。本領域技術人員應理解，根據待雜交序列的長度和GC核苷酸堿基的含量可改變這些條件。本領域的準則性標準適用于確定精確的雜交條件。參見Sambrook等，9.47-9.51分子克隆(Molecular Cloning)冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1989)。
本發明多核苷酸的用途是用作雜交探針，以鑒定和分離編碼與人幾丁質酶同源之蛋白質的幾丁質結合區的非人基因組DNA和cDNA；鑒定表達所述蛋白質之幾丁質結合部分的那些細胞以及可表達所述蛋白質的生物條件。
在另一方面，本發明包括本發明DNA序列的生物復制物(即在體內或體外制造的分離的DNA序列的拷貝)。提供了自主復制重組構建體例如摻入了編碼人幾丁質酶之幾丁質結合片段的多核苷酸(包括上述任何DNA)的質粒和病毒DNA載體。優選的載體包括其中摻入的編碼幾丁質酶片段的cDNA與內源或異源表達控制序列和轉錄終止子有效相連的表達載體。所述表達載體還包括與編碼幾丁質酶的DNA序列有效相連的編碼多肽的DNA序列，可表達所述載體以產生含所需多肽的融合蛋白。
根據本發明的另一方面，用本發明的多核苷酸序列以可以在其中表達所需幾丁質酶產物的方式穩定轉化或轉染原核或真核宿主細胞。表達幾丁質酶片段產物的宿主細胞可用于各種有用的目的。所述細胞成為免疫原的有價值的來源，所述免疫原用于開發與幾丁質酶發生特異性免疫反應的抗體物質。本發明的宿主細胞用于大規模生產幾丁質酶片段產物的方法，其中使所述細胞在適宜的培養基中生長，然后例如通過免疫親和沉淀從細胞和細胞生長的培養基中分離所需的多肽。
編碼人幾丁質酶之幾丁質結合部分的DNA序列的知識使得可以對細胞進行修飾以允許或提高幾丁質結合部分的表達。通過將全部或部分異源啟動子摻入基因內的適宜位置可修飾細胞(例如通過同源重組)以提高人幾丁質酶幾丁質結合部分的表達。可將異源啟動子以將其與編碼人幾丁質酶之幾丁質結合部分的DNA序列有效相連的方式插入。參見例如PCT國際公開WO94/12650、WO92/20808和WO91/09955。可將可擴增的標記DNA和/或內含子DNA與異源啟動子DNA一起插入。
幾丁質酶片段產物可從天然細胞作為分離物獲得或者用化學方法合成，但優選通過利用本發明原核或真核宿主細胞的重組方法生產。還預期哺乳動物宿主細胞的使用可提供翻譯后修飾(例如豆蔻酰化、糖基化、平截、脂化(lipidation)以及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，因此，可根據需要賦予本發明重組表達產物以最佳生物活性。
本發明還包括將幾丁質酶片段產物用于篩選特異性結合人幾丁質酶之幾丁質-結合結構域或者調節人幾丁質酶與幾丁質或人細胞外基質蛋白例如透明質酸之結合的蛋白質或其他分子(例如小分子)。用從血漿分離的幾丁質酶片段、重組幾丁質酶片段產物或者表達所述產物的細胞可以鑒定與幾丁質酶特異性結合的蛋白質或其他分子(例如小分子)。將與幾丁質酶的幾丁質-結合結構域結合的蛋白質或其他分子用于調節其活性。與幾丁質酶的幾丁質-結合結構域特異性結合的結合蛋白是由本發明構思的并包括抗體物質(例如單克隆和多克隆抗體，單鏈抗體，嵌合抗體，人源化抗體，人抗體，以及CDR-移植抗體，包括含特異性識別本發明之多肽的CDR序列的化合物)。所謂“與幾丁質酶的幾丁質-結合結構域特異性結合”指所述結合蛋白僅僅識別幾丁質酶的幾丁質-結合結構域，而沒有幾丁質酶的催化活性部分。反過來，結合蛋白用于免疫組合物以及純化幾丁質酶，并用于用已知免疫學方法檢測或定量分析體液和組織樣品中的幾丁質酶。還構思了幾丁質酶抗體物質特異性的抗個體型抗體。
與幾丁質-結合結構域特異性結合的抗體用于例如在夾心ELISA檢測中檢測或定量分析幾丁質-結合結構域的存在，并用于例如通過加入與酵母或真菌結合的幾丁質-結合結構域，然后加入幾丁質-結合結構域特異性的標記抗體來檢測或定量分析酵母或真菌的存在。檢測人血(血漿或血清)樣品中的幾丁質-結合結構域還與涉及幾丁質酶的疾病，例如高歇氏病的診斷標準指標有關。目前優選的抗體是分別由雜交瘤243Q(保藏號)和243M(保藏號)產生的單克隆抗體243Q和243M，以及與243Q和243M競爭或者與由243Q和243M識別的相同表位結合的抗體。
本發明DNA和氨基酸序列的公開所產生的科學價值是顯而易見的。由于一系列的實施例、幾丁質酶cDNA序列的知識使得有可能通過DNA/DNA雜交或者聚合酶鏈反應(PCR)分離編碼其他哺乳動物幾丁質酶的基因組DNA序列等。另外預期在本領域的標準嚴緊度條件下，用本發明DNA序列完成的DNA/DNA雜交或PCR方法使得可以分離編碼幾丁質酶的人等位基因變體的DNA，同樣具有幾丁質酶的幾丁質結合特性的其他結構相關的人蛋白質。由本發明提供的DNA序列信息使得還可以通過同源重組或“剔除試驗”策略[參見例如Kapecchi，科學(Science)2441288-1292(1989)]開發不能表達功能性幾丁質酶、過表達幾丁質酶或者表達幾丁質酶變體的動物。可將所述動物用作研究幾丁質酶的體內活性或者幾丁質酶調節劑的模型。對本發明多核苷酸進行適當標記后，可用于雜交實驗以檢測細胞合成幾丁質酶的能力。本發明的多核苷酸還是診斷方法的基礎，所述方法用于鑒定處于疾病狀態的幾丁質酶座位中的遺傳改變。本發明還提供了反義多核苷酸，所述反義多核苷酸與調節正常表達幾丁質酶之細胞的幾丁質酶表達有關。
本發明提出，可將幾丁質-結合片段產物與異源多肽融合。例如可將所述產物與免疫球蛋白的一部分，例如恒定區融合以用于治療目的。作為另一實例，可將所述產物與用作可檢測標記或標記物的多肽融合，所述多肽例如具有酶活性的多肽或者攜帶特異性可檢測表位例如myc表位或FLAG表位標記(Eastman Kodak)的多肽。
還可將幾丁質-結合片段與另一所需蛋白質融合以便有利于經與幾丁質基質的親和結合來純化所需的蛋白質。然后通過從柱上洗脫可得到所述融合蛋白或者從幾丁質-結合結構域裂解所需蛋白質，然后洗脫裂解的蛋白質。參見Chong等基因(Gene)192271-281(1997)。
本發明的人幾丁質酶片段產物還可用作幾丁質特異性試劑用于特異性地鑒定樣品中幾丁質的存在。根據本發明的該方面，將具有幾丁質結合活性的幾丁質酶片段產物與可檢測標記例如放射性同位素、熒光團、染料、電子密集的化合物或酶結合，與待測樣品接觸，定性或定量分析幾丁質的存在。本文所用“結合”指通過共價鍵相連。所述技術是熟知的并在例如美國專利5587292(該文獻引入本文作為參考)中作了說明。由此測得的幾丁質量可作為感染患者體內真菌的指標。用于該方法的兩個優選片段是由SEQ ID NO2所列人幾丁質酶氨基酸序列的氨基酸殘基392至445組成的54個氨基酸的幾丁質-結合結構域以及由SEQ ID NO2所列人幾丁質酶氨基酸序列的氨基酸殘基397至445組成的49個氨基酸的幾丁質-結合結構域。
本發明還提供了含結合幾丁質的幾丁質酶片段和成象劑的結合物，所述成象劑例如用于放射性核成象的γ-和發射正電子的放射性同位素(例如157Gd、55Mn、162Dy、52Cr、56Fe、111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr、201Tl、99Tn、90Y)；用于MRI成象的順磁金屬螯合劑，硝酰基自旋標記的化合物或其他試劑(例如Gd(III)、Eu(III)、Dy(III)、Pr(III)、Pa(IV)、Mn(II)、Cr(III)、Co(III)、Fe(III)、Cu(II)、Ni(II)、Ti(III)和V(IV)、GdDTPA/二葡甲胺[MagnevistTM]；用于X射線為基礎的成象，包括CT掃描的造影增強劑(例如含溴-或碘-的化合物)；本領域已知的其他試劑。預期所述結合物與酵母菌細胞壁的幾丁質結合，由此可用于檢測或定位哺乳動物體內的酵母菌的方法。
本發明構思了為了改善因含幾丁質寄生蟲例如真菌引起的疾病，給哺乳動物，特別是人施用含所述產物的幾丁質酶片段產物和治療劑。真菌感染(真菌病)例如念珠菌病、曲霉病、球孢子菌病、芽生菌病、巴西芽生菌病、組織胞漿菌病、隱球菌病、著色真菌病、孢子絲菌病、毛霉菌病和皮真菌病可以是急性或慢性疾病。在無免疫應答的宿主中，致病真菌引起嚴重的，常常是致命的疾病。進行過化療的癌癥患者、免疫抑制個體和HIV感染個體對由念珠菌、曲霉、卡氏肺囊蟲和其他真菌引起的真菌病敏感。兩性霉素B和氟康唑可用于治療真菌感染，但與這些藥物有關的毒性引起嚴重的副作用，從而限制了其應用。盡管可用兩性霉素治療，但全身性念珠菌病的死亡率仍高于50％。在下文實施例9-15中說明了有關真菌感染的動物模型，這些模型在現有技術中已有描述。
本發明具體構思了含幾丁質酶片段產物的組合物，該組合物用于治療對真菌感染敏感或者患有真菌感染之哺乳動物的方法。根據構思，可將幾丁質酶片段產物與其他常規抗真菌劑結合，所述抗真菌劑包括兩性霉素B和結構上相關的化合物制真菌素和多馬徽素；5-氟胞嘧啶；吡咯衍生物例如氟康唑，酮康唑，特康唑，依他康唑和噻康唑；丙烯胺-硫代氨甲酸酯類，例如發癬退，納呋替芬和特比萘芬；灰黃霉素；環吡酮胺；氯丙炔碘；十一烯酸；和苯甲酸。[參見例如Goodman&Gilman，治療的藥理學基礎(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)，第9版，McGraw-Hill(1996)]。根據本發明的該方面，幾丁質-結合片段產物作為載體將已知的殺真菌或抑制真菌的化合物靶向致病的攜帶幾丁質的真菌，由此，可能通過使真菌對所述抗真菌的作用更敏感來提高這些常規抗真菌劑的效力。發揮所需治療作用所需要的常規抗真菌劑數量的減少使得可以以較低的毒性水平使用所述藥物。用幾丁質-結合結構域片段來選擇性靶向真菌或酵母的能力使得可以施用與細胞毒性試劑結合的所述片段，所述細胞毒性試劑本身沒有抗真菌選擇性。本發明的該方面構思將結合幾丁質的幾丁質酶片段與本領域已知的包括放射性同位素(例如90Y、188Re、186Re、199Au、64Cu、67Cu、131I)、毒素和化療劑的任何細胞毒性試劑結合，從而有效地抵御酵母。用本領域已知的方法很容易鑒定適宜的細胞毒性試劑。為了達到該目的，利用人幾丁質酶幾丁質-結合結構域比使用其他種的幾丁質酶的幾丁質-結合結構域更有利，因為預期人多肽在人中是非免疫原性的。
幾丁質-結合結構域片段本身通過酵母細胞壁的破壞性交聯而具有抗真菌作用，并且可以單獨或與其他抗真菌劑一起施用。本發明構思了可特別用于該目的的多聚體幾丁質-結合結構域片段，包括已通過化學和重組生產的多肽而共價交聯的多聚體片段，所述多聚體含串聯連接的多個幾丁質-結合結構域。施用單體或多聚體幾丁質-結合結構域片段可減少發揮所需治療作用所需要的共施用的抗真菌劑的量。
因此，本發明構思了幾丁質酶片段產物在制備用于預防或治療真菌感染的藥物中的用途。
由本發明構思的治療/藥物組合物包括可與另一治療劑結合的幾丁質酶片段產物，和可藥用稀釋劑或載體，還可包括其他抗真菌劑。所標明的劑量應足以補充內源幾丁質酶活性。有關一般劑量考慮，參見(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)第19版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)。劑量可在約1μg/kg-100mg/kg體重間變化，優選約0.1-約20mg幾丁質酶/kg體重。本發明的治療組合物可經各種途徑施用，這取決于待治療的感染，所述途徑包括經皮下、肌肉內、靜脈內、肺內、經皮、局部、經口或栓給藥。
本發明還認為，在高歇氏病或在炎癥位點(例如類風濕性關節炎)過表達幾丁質酶對細胞外基質有不利影響，而且在所述疾病的發作中，幾丁質酶活性抑制劑，包括幾丁質酶片段產物本身或者由上述篩選方法鑒定的幾丁質酶-結合抑制劑通過減少細胞基質的再成形或破壞所述細胞外基質來提供治療效果。
已從巨噬細胞cDNA文庫中分離了人幾丁質酶cDNA。已知巨噬細胞與類風濕性關節炎損傷有非常密切的關系[Feldman等細胞(Cell)85307-310(1996)]，而巨噬細胞產物例如TNF-α與疾病的發展有關。已在類風濕性關節炎患者的滑膜和軟骨中檢測到與人幾丁質酶同源的蛋白質，C-gp39。盡管人幾丁質酶的天然底物可能是來自致病生物體的幾丁質，但是該酶還對形成天然細胞外基質的內源大分子有活性。例如，已表明透明質酸(一種主要的細胞外基質)含有幾丁質寡聚體的核。[Semino等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)934548-4553(1996)；Varki，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)934523-4525(1996)]。因此，在象類風濕性關節炎這樣的疾病中幾丁質酶與細胞外基質的降解有關。通過測量幾丁質酶水平和/或施用幾丁質酶的作用或者從關節炎關節分離的滑膜液中的幾丁質酶抑制作用可確定幾丁質酶的作用。通過酶檢測或用抗體可測量內源幾丁質酶的水平。在幾丁質酶處理前后，可測量滑膜液的粘度；與幾丁質酶有關的粘度降低應與內源幾丁質酶底物一致。由此幾丁質酶活性的調節可調節類風濕性關節炎中關節破壞的發展。
本發明還構思了篩選幾丁質酶活性抑制劑的方法，該方法可以在前段描述的方式使用。在1995年12月21日公開的WO95/34678中包括了用于篩選樣品以鑒定抑制幾丁質酶之試劑的方法。發明詳述在考慮了下列說明性實施例后，將能夠理解本發明的其他方面和優點。實施例1描述了從人巨噬細胞cDNA文庫中分離人幾丁質酶cDNA克隆。實施例2描述了在各種人組織中幾丁質酶基因表達的圖譜。實施例3描述了在原核細胞中重組表達人幾丁質酶基因并純化所得的酶。實施例4提供了用于在酵母中重組生產人幾丁質酶的工具。實施例5描述了在哺乳動物細胞中重組表達人幾丁質酶基因并純化所得蛋白。實施例6描述了通過肽合成或重組生產方法生產人幾丁質酶多肽類似物和片段。實施例7描述了具有幾丁質-結合活性的人幾丁質酶片段和其類似物的生產。實施例8提供了用于產生與人幾丁質酶發生特異性免疫反應的單克隆抗體的工具。實施例9描述了用于測量幾丁質酶催化活性的實驗。實施例10描述了在體外確定試驗藥物的抗真菌活性。實施例11描述了在體內小鼠模型中確定試驗藥物的抗真菌活性，實施例12至15描述了侵襲性曲霉病、傳播的念珠菌病、念珠菌眼炎和念珠菌心內膜炎的兔模型。實施例16將全長人幾丁質酶的幾丁質-結合和幾丁質水解活性與C末端平截片段的所述活性進行了比較。實施例17描述了幾丁質-結合片段與其他部分的結合。
實施例1幾丁質酶cDNA克隆的分離按Tjoelker等自然(Nature)，374549-552(1995)中所述，從外周血單核細胞衍生的巨噬細胞制備cDNA文庫。隨機篩選來自該文庫的克隆，從每個克隆純化質粒DNA。在自動測序儀(Model 373，Applied Biosystems，Foster City，CA)上，用引物JHSP6確定來自每個克隆的自DNA末端起約300-500個堿基的序列，所述序列與cDNA克隆位點相鄰的質粒載體pRc/CMV(Invitrogen，San Diego，CA)雜交JHSP65’-GACACT ATAGAATAGGGC-3’(SEQ ID NO5)將這些cDNA克隆的核苷酸和推測的氨基酸序列與核苷酸和肽序列數據庫中的序列進行比較以確定與已知基因的相似性。用Altschul等分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)215403-410(1990)的排列算法，通過國家生物技術信息中心的BLAST Network Service完成序列比較。克隆MO-911與數個不同的序列有顯著的同源性，所述序列包括小鼠巨噬細胞分泌蛋白YM-1前體(Genbank登錄號M94584)，人軟骨gp-39(Hakala等，同上文)，來自綿羊，牛和人的輸卵管糖蛋白(DeSouza等，同上文)，以及寄生蟲(盤尾屬，Genbank登錄號U14639)，黃蜂，(Chelonus，Genbank登錄號U10422)，植物(Nicotiana，Genbank登錄號X77111)，和細菌(沙雷氏菌屬，Genbank登錄號Z36295)的幾丁質酶；觀察到的最大同源性是與編碼具有幾丁質酶同源性但沒有確定的幾丁質酶活性之蛋白質的哺乳動物基因。對MO-911進行進一步的序列分析表明，它含有人幾丁質酶同系物的部分編碼區。
在SEQ ID NO1列出了克隆pMO-218(于1996年6月7日根據布達配斯條約保藏在美國典型培養物保藏中心12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，美國，保藏號為98077)的DNA序列，其編碼的氨基酸序列于SEQ ID NO2中列出。MO-218似乎含有人幾丁質酶cDNA的完整編碼區(SEQ ID NO1的核苷酸2 to 1399)，它含有21個氨基酸的推測的信號序列，然后是445個編碼氨基酸(SEQ ID NO2的殘基1-445)。推測的信號序列后的22個氨基酸與Renkem等(同上文)報道的純化人殼三糖酶的氨基末端序列完全匹配。Renkema等還描述了來自人殼三糖酶的胰蛋白酶片段的21個氨基酸的序列，該序列對應于MO-218的殘基157-177(SEQ ID NO2)。Boot等(同上文)報道了人殼三糖酶cDNA的克隆，該cDNA與MO-218的編碼序列基本相同。MO-218的序列不同于Boot等的序列，前者在5’末端還有14個核苷酸，并在編碼區的核苷酸330位置有個一核苷酸改變。
為了證實MO-218確實含有所述cDNA的完整編碼區，制備32P-標記的探針P-1(TGGGATCATCAGCAGGACCATGAAACCTGCCCAGGCCACAGACCGCACCAT，SEQ ID NO6)，該探針對應于MO-218的核苷酸2-52的互補序列(SEQ ID NO1)。設計P-1探針以使其與至少與MO-218一樣長的克隆在5’末端雜交。在42℃，在40％甲酰胺和雜交緩沖液(5 xSSPE，10 x Denhardt’s，100μg/ml變性的鮭精DNA和2％SDS)中將該探針與上述人巨噬細胞cDNA文庫的一部分(約30,000個克隆)雜交。洗滌濾紙并選擇雜交的3個克隆進行序列分析。將最長的克隆命名為pMO-13B(于1996年6月7日根據布達配斯條約保藏在美國典型培養物保藏中心12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，美國，保藏號為98078)。在SEQ ID NO3中列出了pMO-13B的DNA序列，在SEQ ID NO4中列出了編碼的氨基酸序列。與MO-218相比，該克隆在5’末端還含有25個核苷酸；另外，MO-13B(SEQ ID NO3)在核苷酸330(對應于MO-218，SEQ ID NO1的核苷酸305)含有一核苷酸取代，所述取代將成熟蛋白質位置80上的甘氨酸(SEQ ID NO2)變為絲氨酸(SEQ ID NO4)。
實施例2人組織中的幾丁質酶基因表達圖進行Northern印跡分析以鑒定其中表達人幾丁質酶的組織。在標準嚴緊度條件下(按照Clontech的實驗室手冊)，將多個人組織Northern印跡(Clontech，Palo Alto CA)與MO-218的完整編碼區雜交。觀察到的最大程度的雜交是肺組織(+++)和卵巢(+++)，在胸腺和胎盤中的雜交水平最低(+)。肺、卵巢及胸腺的雜交mRNA為2.0kb，與克隆的cDNA(1.6kb，或約1.8kb包括polyA尾)的大小非常匹配。雜交的胎盤mRNA相當小，約1.3kb。在脾、前列腺、睪丸、小腸、結腸、外周血白細胞、心、腦、肝、骨骼肌、腎或胰腺中未觀察到幾丁質酶雜交。幾丁質酶在肺中的表達與抵御含幾丁質病原體生物的保護作用一致，因為肺是真菌病原體進入的主要途徑。
實施例3用細菌細胞生產重組人幾丁質酶將MO-218的成熟編碼區進行加工以便在大腸桿菌中表達為C末端平截的類似物。用引物經PCR產生用于表達的DNA片段，所述引物對應于MO-218幾丁質酶cDNA的核苷酸65-88(5’-TACATCTAGAATTATGGCAAAACTGGTCTGCTACTTCACC-3’，SEQ ID NO7)，該序列前有起始密碼子甲硫氨酸密碼子和XbaI限制核酸內切酶位點，下游引物編碼MO-218的核苷酸1163-1183和之后的終止密碼子和HindIII位點(5’-AGATCTAACCTTAGGTGCCTGAAGACAAGTATGG-3’，SBQ ID NO8)。下游引物在堿基25含有一腺嘌呤，而MO-218序列在對應的核苷酸位置含有鳥嘌呤。結果，所得的DNA片段在對應于MO-218序列的核苷酸1172的位置上含有胸腺嘧啶而不是胞嘧啶，在SEQ ID NO15中列出的編碼的幾丁質酶片段也是在成熟氨基酸位置370含絲氨酸而不是MO-218編碼的脯氨酸的類似物。用XbaI和HindIII消化所得的DNA片段，然后將其克隆到質粒pAraBAD(也稱為pAraCB)。
按下列方法制備質粒pAraCB。修飾質粒pUC19以包括阿拉伯糖啟動子并在其后包括AKAP79編碼序列。用引物araC-2(SEQ ID NO9)和arab-1(SEQ ID NO10)，從鼠傷寒沙門氏菌的阿拉伯糖操縱子BAD，通過PCR將阿拉伯糖啟動子[Wilcox等基因(Gene)，34123-128(1985)；Wilcox，等基因(Gene)18157-163(1982)]和araC基因擴增為EcoRI/XbaI片段araC-2 TACAGAA TTCTTATTCACA TCCGGCCCTG SEQ ID NO9arab-1 TACATCTAGACTCCATCCAGAAAAACAGGTATGG SEQ IN NO10引物araC-2編碼araC基因產物的EcoRI位點(劃線部分)和終止密碼子(斜體字)。引物arab-1編碼推測的核糖體結合結構域(斜體字)和XbaI限制位點(劃線部分)。用這些引物，PCR產生1.2kb片段，用EcoRI和XbaI消化，然后亞克隆到用兩種同樣的酶消化的pUC19(New England Biolabs，Beverly，MA)中。將所得質粒命名為pAraCB，該質粒在5’末端側含有多接頭區(SEQ ID NO11)和XbaI限制位點(劃線的部分)，在3’末端含有HindIII位點(斜體字)。araCB多接頭SEQ ID NO11TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT用阿拉伯糖誘導含所得表達質粒(pAraMO218)的轉化體，然后在37℃生長。這些轉化體產生含39kDa蛋白質的包含體，所述蛋白質是幾丁質酶的平截形式(加工成含373而不是445個氨基酸)。該幾丁質酶片段含4個半胱氨酸殘基，而全長幾丁質酶含10個半胱氨酸殘基。從大腸桿菌培養物中分離所述包含體，在SDS-PAGE上電泳。將39kDa帶轉移到PVDF膜上，然后進行氨基末端測序。該物質的大部分(約2/3)含對應于人幾丁質酶之氨基末端的序列。其余物質對應于污染大腸桿菌蛋白，孔蛋白。來自大腸桿菌的該重組幾丁質酶制品可用于產生多克隆和單克隆抗體(下文實施例8描述的)。
當在25℃使含Ara-幾丁質酶表達質粒的轉化體生長使時，觀察不到包含體，重組產物的表達從總細胞蛋白的約10％降到1％。但是在25℃產生的物質有幾丁質酶催化活性。
實施例4用酵母細胞生產重組人幾丁質酶下文給出在酵母中重組表達人幾丁質酶并純化所得重組蛋白的舉證性方法。用PCR或者設計的接頭寡核苷酸，將人幾丁質酶的編碼區加工到在啤酒酵母中表達的載體，所述接頭寡核苷酸編碼含人幾丁質酶編碼區的分泌介導前導序列的融合多肽，所述前導序列對應于天然分子氨基末端。分泌信號肽包括例如具有功能信號肽酶裂解位點的SUC2或等同前導序列，或者前原α因子或者由具有KEX2裂解位點的前或信號肽以及原或間隔基區組成的其他復合物前導序列。通過寡核苷酸合成或PCR可得到編碼信號序列的DNA。用含α交配因子基因的1-20核苷酸的引物和與該基因的核苷酸255-235互補的引物，通過PCR可得到編碼前原α因子前導序列的DNA[Kurjan和Herskowitz，細胞(Cell)30933-943(1982)]。將前原α前導序列的編碼序列和人幾丁質編碼序列片段連接到含酵母醇脫氫酶(ADH2)啟動子的質粒中，使所述啟動子指導融合蛋白的表達。按照Rose和Broach[Meth.Enz.，185234-279，D.Goeddel，編，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1990)]的教導，所述載體還包括克隆位點下游的ADH2轉錄終止子，酵母“2微米”復制原點，可選擇標記，例如TRP1，CUP1或者LEU2(或者LEU2-d)或者其他等同基因，酵母REP1和REP2基因，大腸桿菌β內酰胺酶基因以及大腸桿菌復制原點。β內酰胺酶和TRP1基因分別使得可以在細菌和酵母內進行選擇。REP1和REP2基因編碼與質粒拷貝數復制有關的蛋白質。
或者，選擇幾丁質酶編碼區內的其他融合點。編碼區的平截物可用于提高產物的同質性，提高比活性或者改變底物特異性。
用已知方法，例如乙酸鋰處理[Stearns等，Meth.Enz.，同上文，pp.280-297]或者等同的方法，將前段中所述的DNA構建體轉化到酵母細胞中。在耗盡生長培養基中的葡萄糖后，誘導ADH2啟動子[Price等基因(Gene)55287(1987)]。前原α序列或者其他前導序列影響融合蛋白的分泌，從細胞中釋放成熟的人幾丁質酶肽。將所述信號肽前導序列通過信號肽酶加工，或者在前原α的情況下，用KEX2蛋白酶除去原區[Bitter等美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)815330-5334(1984)]。
幾丁質酶在其成熟氨基酸序列中在位置107-108(Lys-Arg)和209-210(Arg-Lys)含有兩個可以在分泌過程中通過KEX2蛋白酶剪切的二堿基序列。為了穩定和/或提高從細胞中分泌的產物的水平，可將這些序列進行突變以消除Gillis等所示的潛在蛋白水解位點[Behring Inst.Mitt.，831-7(1988)]或者通過在KEX2缺陷的宿主中表達不含二堿基修飾的幾丁質酶來使這些序列發生突變。通過篩選不含KEX2蛋白酶的突變體或者通過基因取代/基因破壞技術操作基因組KEX2座位[Orr-Weaver等美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)786354-6378(1981)]可以得到所述宿主。
可以用類似的含啟動子PRB1、GAL4、TPI或者其他適宜的攜帶各種強啟動子的片段的載體或者通過與各種前導序列融合從啤酒酵母中分泌重組幾丁質酶[Sleep等，生物/技術(Bio/Tech)842-46(1990)]。
其他非啤酒酵母類適宜的表達宿主包括乳克魯維氏酵母、粟酒裂殖糖酵母、巴斯德畢赤氏酵母以及漢遜氏酵母或曲霉屬的成員。用于這些真菌的類似的重組表達系統包括這些生物體本身和其適宜的自主復制型載體[例如，Falcone等質粒(Plasmid)15248-252(1988)]或者多整合表達盒。這些系統也依賴上述的信號序列或前導序列以便介導向培養基中的分泌。
通過例如用于從細菌和哺乳動物細胞上清液中純化幾丁質酶的方法(參見實施例3和實施例5)，從酵母生長培養基中純化分泌的人幾丁質酶。
或者，在啤酒酵母細胞或類似宿主的胞質中表達重組幾丁質酶產物的成熟形式，然后從溶解的宿主細胞中純化。在純化過程中可將所述蛋白質再折疊以便得到適宜的比活性。
實施例5在哺乳動物細胞中生產重組人幾丁質酶A在COS細胞中表達分離MO-218克隆和MO-13B克隆，這兩個克隆均含有在pRc/CMV的CMV啟動子3’的全長人幾丁質酶cDNA。按如下方法制備第三個質粒，該質粒對應于在上述實施例3中在細菌細胞中表達的相同C末端片段。用寡核苷酸引物218-1(CGCAAGCTTGAGAGCTCCGTTCCGCCACATGGTGCGGTCTGTGGCGG，SBQ ID NO12)通過PCR擴增MO-218質粒，該引物含有HindIII位點和在SEQ ID NO1之MO-218幾丁質酶cDNA的核苷酸2-23，在PCR反應中還使用互補下游引物T-END(GACTCTAGACTAGGTGCCTGAAGGCAAGTATG，SEQ ID NO13)，該引物含MO-218的核苷酸1164-1183，終止密碼子和XbaI位點。將擴增的DNA通過電泳純化，用XbaI和HindIII消化，然后克隆到預先用相同的限制酶消化的pRc/CMV載體(Invitrogen，San Diego，CA)中。將所得克隆的連接物在Model 373(Applide Biosystems，FosterCity，CA)上測序，證實該克隆編碼SEQ ID NO14所列的預測的遺傳工程蛋白序列。
通過DEAE轉染方法[參見例如，Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約冷泉港實驗室(1989)]將所有三個質粒瞬時轉染到COS細胞中。在37℃3天后，按下文實施例9所述體外檢測細胞培養基的幾丁質酶活性。每種培養物均有顯著的幾丁質酶活性(600-800mU/ml/分)，同樣觀察到類似數量的各構建體。
按如下方法純化重組人幾丁質酶。用pRc/CMV-MO-13B質粒轉染COS細胞5天后，收集來自培養物的條件培養基，用等體積水稀釋。將稀釋的條件培養基加到Q-Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)上，該柱用25mM Tris，10mM氯化鈉，1mM EDTA，pH8.0預平衡。約95％的幾丁質酶活性直流，并不與柱結合。將所述Q-Sepharose直流物用1.2M硫酸銨調整，然后加到Butyl-Sepharose 4 Fast Flow柱(Pharmacia)上，該柱用25mMTris，1.2M硫酸銨，1mM EDTA，pH8.0預平衡。用在25mM Tris pH8.0中的1.2M-0M硫酸銨反向梯度洗脫蛋白質。在低鹽洗脫了對應于幾丁質酶活性峰在280nm的單吸收峰。按照用SDS-PAGE確定的，該物質的純度大于85％并含有約60％的幾丁質酶活性。然后將該蛋白質濃縮，用10000 MWCO(UltrafreeTM10K，Millipore Corp.，Bedford，.MA)緩沖交換到20mM Tris，150mM氯化鈉pH8.0中。然后按實施例9和10所述，體外檢測該制品的酶促和抗真菌活性。該重組制品的殼三糖酶活性為90nmol/分鐘/mg蛋白質。
B在CHO細胞中表達通過切割來自pRc/CMV/MO-13B的含全長幾丁質酶基因的1.77kbHindIII/XbaI片段，然后與用HindIII/XbaI-消化的pDEF1的片段相連，而將幾丁質酶基因插入pDEF11(按1997年5月1日申請的美國系列申請08/847218中實施例4的描述構建，該文獻引入本文作為參考)，得到質粒pDEF1/CTN.1。再將含1.7kb HindIII/XbaI片段的幾丁質酶基因連接到HindIII/XbaI消化的pHDEF1中，得到質粒pHDEF1/CTN.1。質粒pHDEF1與pDEF1相同，不同之處有兩點(1)在pHDEF1中，含潮霉素抗性基因的衍生于pCEP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)的2kb EheI/SalI片段代替了19bp的pDEF1的PmeI/SalI片段；(2)在pHDEF1中，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的表達受在120bp NheI/Asp718片段上的短SV40啟動子的控制，該片段代替了相應的pDEF1的212bp NheI/Asp718片段。該120bpNheI/Asp718片段用下列方法制備首先，用寡核苷酸引物94-26(5’-TGATACGGTACCGCCCCATGGCTGACTA-3’，SEQ ID NO16)和引物94-27(5’-GCAAGTTTGGCGCGAAATCG-3’，SEQ ID NO17)，用來自攜帶SV40-DHFR盒的pDC1(在1997年5月1日申請的美國系列申請08/847218的實施例4中描述的)的DNA作為模板，擴增171bp PCR片段，然后用NheI和Asp718消化該171bp PCR片段。
按1997年5月1日申請的美國系列申請08/847218的實施例5中所述，用質粒pDEF1/CTN.1轉染DHFR陰性中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系DG44。另外用質粒pHDEF1/CTN.1轉染CHO細胞系DG44，然后用下列改變的方法進行篩選。首先在含800mg/升潮霉素(Calbiochem，San Diego，CA)和次黃嘌呤和胸苷(因此制備DHFR基因非選擇性培養基)的培養基(用2-10％透析的FBS補充的DMEM/F-12)中僅篩選潮霉素抗性的細胞。篩選出潮霉素抗性的轉染體后，再通過使其在不含次黃嘌呤和胸苷的培養基中生長來篩選表達DHFR基因的細胞。接著，在先含10nM，然后20nM，最后50nM氨甲喋呤的培養基中篩選DHFR陽性和潮霉素抗性CHO細胞，這樣篩選出高水平表達幾丁質酶的細胞。
按如下方法純化pHDEF1/CTN.1轉染的含過表達重組人幾丁質酶的CHO細胞上清液(rH-幾丁質酶)。在陰離子交換色譜的制備過程中，用20mM Tris，pH7.0(緩沖液A)以1∶3稀釋所述上清液。將用Q-Sepharose Fast Flow樹脂(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)裝的陰離子交換柱用緩沖液A平衡，然后每1升樹脂負載15升稀釋的上清液。從Q-Sepharose收集直流的rH-幾丁質酶，然后在陽離子交換色譜的制備中，用5％聚乙二醇(PEG)400(Mallinckrodt Baker，Inc.，Phillipsburg，NJ)，30mM醋酸鈉，pH4.3調整。將用CM-Sepharose Fast Flow樹脂(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)裝的陽離子交換柱用30mM醋酸鈉，5％PEG 400，pH4.3(緩沖液B)平衡。將rH-幾丁質酶樣品以1mg/mL樹脂負載到CM-Sepharose柱上，用40mM Tris，5％PEG，pH7.5(緩沖液C)從柱上洗脫rH-幾丁質酶。然后通過加入硫酸銨達到1.5M來制備rH-幾丁質酶樣品用于疏水相互作用色譜。將用Macro-Prep Methyl H1C Support(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)裝的柱用含1.5M硫酸銨的20mMTris，5％PEG，pH7.5(緩沖液D)平衡。將rH-幾丁質酶樣品以1mg/mL樹脂負載到Macro-Prep Methyl柱上。用含1.1M硫酸銨的緩沖液D洗滌該柱，然后用含0.2M硫酸銨的緩沖液D洗脫rH-幾丁質酶。通過膜過濾，將純化的洗脫液交換到150mM氯化鈉，20mM Tris，pH7.0(緩沖液B)中。
實施例6人幾丁質酶類似物和片段的生產用前文實施例中所述的重組技術制備人幾丁質酶多肽類似物或片段。更具體地講，用熟知的技術，例如定點誘變和聚合酶鏈反應對編碼人幾丁質酶的多核苷酸進行修飾以使其編碼所需的多肽類似物。通過例如缺失所述多寡核苷酸編碼序列的適當部分可制備C末端和N末端缺失。主要參見Sambrook等，同上文，第15章。重組表達修飾的多核苷酸，然后按前文實施例所述純化重組多肽類似物或片段。
通過與其他幾丁質酶的同源性和取代天然人幾丁質酶氨基酸殘基的丙氨酸可鑒定對人幾丁質酶活性重要的殘基。半胱氨酸通常對蛋白質的功能完整性是很重要的，因為它們可以形成二硫鍵，從而限制二級結構。為了確定是否人幾丁質酶中的任何半胱氨酸對于酶活性均很重要，逐個將每個半胱氨酸突變成絲氨酸。
按上文實施例3和5所述，通過在氨基酸373的密碼子后導入終止密碼子來制備成熟人幾丁質酶蛋白質的39kDa C末端平截片段。該39kDa片段沒有成熟蛋白質的72個C末端氨基酸殘基，包括6個半胱氨酸，但是與全長重組人幾丁質酶相比，保留了相似的特異性酶活性。該結果表明，酶活性不需要失去的72個C末端殘基，包括6個半胱氨酸。
另外，通過用核酸外切酶III將實施例3所述的平截人幾丁質酶編碼序列的3’末端消化不同的時間，然后將變短的編碼序列在所有3個閱讀框架中與質粒DNA編碼終止密碼子相連，可制備C末端缺失產物。用類似的方法，通過消化編碼序列的5’末端，然后將消化的片段連接到含啟動子序列和啟動子位點上游緊接著的起始甲硫氨酸的質粒制備N末端缺失產物。還可將這些N-末端缺失類似物或片段表達為融合蛋白。
或者，用本領域已知的技術，通過全部或部分化學肽合成方法來制備人幾丁質酶多肽類似物。[參見，例如在Clark-Lewis等生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，26623128-34(1991)中的IL-8的合成；在Clark-Lewis等科學(Science)231134-139(1986)中的IL-3的合成；以及Dawson等科學(Science)266776-779(1994)中的連接合成]。所述合成方法還可以選擇性地導入新的、非天然氨基酸和其他化學修飾。
通過本領域已知的技術，例如在下文實施例9和15中描述的技術可檢測人幾丁質酶多肽類似物的生物活性，包括酶、抗真菌和細胞外基質再成型活性。
實施例7人幾丁質酶幾丁質-結合片段和其類似物的生產A SEAP融合蛋白的產生通過產生含人幾丁質酶N末端平截部分的融合蛋白，然后檢測這些產物的幾丁質-結合活性來確定人幾丁質酶幾丁質-結合結構域的位置。首先，按如下方法產生與人幾丁質酶的C末端99個氨基酸融合(在嵌合蛋白的C末端)的含全長分泌的堿性磷酸酶(SEAP)蛋白(在嵌合蛋白的N末端)[Berger等基因(Gene)661-10(1988)]的嵌合蛋白。以SEAP組分作為所述嵌合蛋白的可示蹤標記物。
用在5’末端導入一HindIII位點并在3’末端導入一多克隆區的引物SEAP Start(SEQ ID NO18)和SEAP Stop(SEQ ID NO19)，經聚合酶鏈反應(PCR)從pSEAP2-對照質粒(Clontech，Palo Alto，CA)擴增SEAP DNA。用100ng模板DNA，1μg各引物，0.125mM各dNTP，10mM Tris-HCl，pH8.4，50mM MgCl2和2.5單位Taq聚合酶，完成PCR，在94℃的開始變性步驟反應4分鐘，然后30個循環的擴增在94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃2分鐘。將該PCR-產生的cDNA克隆到pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)的HindIII和ApaI位點以產生稱為pcDNA-SEAP的載體。在相同的條件下，用下列表1中所列的引物通過PCR產生編碼人幾丁質酶的C末端99個氨基酸的DNA(參見347-445)，在5’和3’末端導入EcoRI和XbaI位點。將該PCR-產生的幾丁質酶DNA序列克隆到pcDNA-SEAP之多克隆區的EcoRI和XbaI位點。
通過在含0.5mg/ml DEAE葡聚糖，0.1mM氯喹和10μg質粒DNA的Dulbecco’s改性Eagle培養基(DMEM)中培養1.5小時而將編碼所述嵌合體的構建體瞬時轉染到COS7細胞中。然后用在磷酸緩沖鹽的10％DMSO將細胞處理45秒，用無血清培養基洗滌，然后在用1mML-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和10％胎牛血清補充的DMEM中培養。4天后，按Flanagan和Leder細胞(Cell)63185-194(1990)所述檢測培養基的SEAP活性。SEAP活性是容易檢測的。在4℃，將含所述融合蛋白的培養基與不溶性幾丁質(Sigma，St.Louis，MO)一起保溫1小時，80％以上的SEAP活性與幾丁質一起沉淀。該結果表明，在人幾丁質酶C末端的99個氨基酸內包含了完整的幾丁質-結合結構域。
通過PCR產生編碼其他幾丁質-結合結構域平截產物的DNA，并將所述DNA按上述表達為與SEAP蛋白質的融合產物。檢測這些融合蛋白的幾丁質結合活性，在下列表1中給出了結果。
表1
B半胱氨酸突變類似物的產生為了確定人幾丁質酶99個C末端氨基酸內的6個半胱氨酸中的任何一個或幾個是否對于結合幾丁質是重要的，制備幾丁質酶片段類似物，其中將每個半胱氨酸逐個突變為絲氨酸。用下列表2中所列的引物產生將6個半胱氨酸中的每一個逐個突變為絲氨酸的6個PCR產物，然后將其按上述與SEAP cDNA融合。按上述檢測通過瞬時轉染的COS細胞產生的嵌合蛋白的幾丁質-結合活性。這些試驗的結果說明，6個半胱氨酸中的每一個對于幾丁質-結合活性都是必需的。
表2
通過實施例6中所述的重組技術或者完全或部分化學合成方法可制備其他幾丁質-結合片段和其片段類似物。
C 幾丁質-結合片段在酵母中的表達在啤酒酵母中以高水平表達由SEQ ID NO2的殘基392-445組成的幾丁質-結合結構域片段。設計表達構建體α-FLAG-CBD，其中將對應于SEQ ID NO2的殘基392-445的核苷酸與編碼啤酒酵母α因子前原序列[Brake等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)814642-4646(1984)]之序列的3’末端和FLAG表位標記(Eastman Kodak)融合。為了達到該目的，用全長人幾丁質酶DNA為模板使用引物CBDαFLAG(有義；SEQ ID NO33)和Hu Chit Stop 5(反義；SEQ ID NO34)進行PCR。CBDαFLAG引物序列在FLAG標記編碼區的上游含有Asp718限制內切酶位點，所述編碼區與編碼幾丁質-結合結構域片段392-445的前8個氨基酸的序列在框架中。Hu ChitStop 5引物序列編碼幾丁質-結合結構域片段的7個C末端氨基酸，該結構域片段接有與6個組氨酸殘基相連的Gly-Ala-Gly，所述6個組氨酸殘基在位于翻譯終止密碼子前的3個氨基酸片段之前。包括所述His6序列以便有利于通過金屬親和色譜[按Nilsson等，Prot.Expr.Purification 111-16(1997)所述]純化被表達的產物。在終止密碼子的緊鄰3’包含有NotI限制核酸內切酶位點。
用Asp718和NotI消化用這些引物產生的PCR產物，然后克隆到質粒pAYE/VEC之表達盒內的相應位點，所述質粒通過修飾pAYE674[Delta Biotechnology Limited；Sleep等，生物/技術(Bio/Technology)9183-187(1991)]，增加限制位點以便有利于將表達盒摻入pSAC/VEC(下文描述的)中而產生的。在所得的稱為pAYE/AF/CBD的構建體內的表達盒由編碼啤酒酵母α因子前-原序列的核苷酸與幾丁質-結合結構域片段框內融合組成。合成后，將所述融合蛋白靶向膜，在膜中，通過KEX2蛋白酶的作用從α因子前原序列中釋放成熟的FLAG-幾丁質-結合結構域片段-His6肽。α因子前原CBD融合產物的轉錄是在強啟動子PRB1和ADH1的轉錄終止序列的控制下。
通過用SfiI和PacI消化從pAYE/AF/CBD中切割所述表達盒，然后克隆到pSAC/VEC的相應位點，pSAC/VEC是通過修飾分解載體pSAC35(Delta Biotechnology Limited；Sleep等，同上文)以摻入一多克隆位點而產生的。該穿梭載體pSAC35含有帶有LEU2d可選擇標記的完整2微米質粒和位于pUC-衍生的大腸桿菌復制原點側的兩個重復序列和β內酰胺酶抗性標記。主要按照Ito等細菌學雜志()153163-168(1983)所述，將所得的pSAC2/AF/CBD質粒轉化到啤酒酵母宿主菌株IE41(cir°leu2 pep4URA3 L261；Sleep等，同上文)中，然后通過在亮氨酸缺陷型培養基上生長進行篩選。將pSAC2/AF/CBD導入宿主菌株后，所述重復序列進行單交換重組，消除pUC序列。該載體是自主復制的，高度穩定的，而且已表明，當其宿主在選擇性或者非選擇性培養基中生長時，該載體可分泌高水平產物(Sleep等，同上文)。
克隆篩選后，在30℃，2毫升選擇性培養基中，使4個酵母克隆生長16小時。將培養物隨后轉移到18毫升YEPD培養基中，在30℃再生長48小時。收集培養基并通過SDS-PAGE評估是否存在表達的重組蛋白。凝膠表明從所有4個克隆中都分泌重組幾丁質-結合結構域片段392-445，但從空載體對照中不分泌。通過在Western印跡上其與按實施例8所述產生的幾丁質-結合結構域-特異性單克隆抗體的反應性，將分泌的蛋白質陽性鑒定為幾丁質-結合結構域片段。
分泌的幾丁質-結合結構域片段在酵母培養基中是高度富集的，但不純。完成初步的小規模金屬親和純化以得到純物質。將2毫升Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmacia)加到12毫升滴注柱(BioRad)中。將10毫升50mM NiSO4加到Chelating Sepharose上以便用鎳使其帶電。用10毫升蒸餾水洗滌后，用10毫升緩沖液A(20mM Tris，pH8，0.5M NaCl)平衡帶電的柱。負載前，通過加入TrispH8達到20mM的終濃度而將來自克隆34A之培養基的pH調整到8。使14毫升培養基通過該柱，然后用10毫升緩沖液A洗滌。隨后通過含10(2毫升)，50(2毫升)或者100mM(3毫升)咪唑的緩沖液A的連續應用洗脫重組蛋白。用SDS-PAGE分析純化過程中各10微升的餾份。凝膠分析表明100mM咪唑可洗脫基本上純的重組幾丁質-結合結構域片段392-445。將100mM咪唑洗脫的餾份2和3合并；發現所述合并物含有約0.4mg/ml純化蛋白質。
為了評估重組蛋白的功能，在4℃將1mg粉末幾丁質與25微升純化的幾丁質-結合結構域片段392-445一起保溫1小時。保溫后，離心除去不溶的幾丁質，通過SDS-PAGE將上清液中剩余的蛋白質的量與無幾丁質對照培養基的量進行比較。在用幾丁質處理的培養基中，觀察到重組蛋白減少約50％。這表明至少一種重組蛋白的顯著餾份保留了結合幾丁質的能力。
設計第二個酵母表達構建體以表達不含FLAG表位和His6標記的由SEQ ID NO2的殘基392-445組成的幾丁質-結合結構域片段。按上述組裝所述構建體，不同之處在于，用于擴增幾丁質-結合結構域-編碼區的PCR引物是CBDα(有義；SEQ ID NO38)和Hu Chit Stop 4(反義；SEQ ID NO39)。按上述轉化并篩選細胞。
在30℃10毫升含2％葡萄糖的SC-leu-ura培養基(Bio101，Vista，CA)中使表達重組幾丁質-結合結構域的轉化的酵母克隆生長過夜。將1毫升該培養物接種到100毫升相同的培養基中，然后在30℃振蕩培養。19小時后，將65毫升培養物接種到在3升發酵罐中的1.2升YB2V培養基
內。在30℃，pH5.5完成發酵，以1200rpm攪動，空氣流速為3L/分鐘。用磷酸和氫氧化銨控制pH。在前13個小時批量條件下操作發酵罐，此后，開始按時補加(time feedaddition)。將補料培養基YF6V.1[50％葡萄糖，0.02％ FeCl3，1g/L檸檬酸鈉，50g/L酪蛋白氨基酸，2.9g/L KH2PO4，5g/L(NH4)2SO4，15.2mM MgSO4，0.001％硫胺素，痕量金屬和維生素]以3.6ml/小時的恒定速率加到發酵罐中，經4小時，然后以5小時加倍時間將補料速率指數增加到9.38ml/小時。共發酵93小時后，離心收集細胞。在4℃，5000xg將1.6升培養液離心40分鐘。棄去細胞沉淀，然后通過預過濾器和0.2μM濾器過濾上清液。
使來自發酵的培養基通過幾丁質珠柱來純化重組幾丁質-結合結構域。用50毫升柱(Amicon)，用250毫升1％SDS預洗滌，然后用250毫升緩沖液A(20mM Tris，pH8，500mM氯化鈉)以2ml/分鐘的流速平衡來制備25毫升床體積的幾丁質珠(New England Biolabs)。使澄清的培養基以1ml/分鐘的流速通過幾丁質珠柱。用250毫升緩沖液A洗滌后，用50％乙腈，0.1％三氟乙酸從珠上洗脫蛋白質，并收集4毫升餾份。通過真空離心從洗脫液中蒸發乙腈。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質定量分析洗脫餾份表明，在3個連續餾份中回收了94％的純化幾丁質-結合結構域。從130毫升發酵培養基中共得到109mg幾丁質-結合結構域。用MALDI質譜(Perseptive Biosystems)分析純化的蛋白質表明，有一分子量為5911.9的峰，對應于5909.8的預測質譜的值。在其功能完整性的檢測中，與250微升幾丁質珠混合的20微克純化的幾丁質-結合結構域產生＞95％與所述珠結合的肽。
實施例8人幾丁質酶的單克隆抗體的制備用下列兩種方法(多攻擊或單次注射免疫)產生人幾丁質酶的單克隆抗體。在第一種方法中，通過定期注射按實施例3-6任一方法得到的重組人幾丁質酶(例如用弗氏完全佐劑乳化的10-20微克)來免疫小鼠。給予小鼠最后預融合的在PBS中的人幾丁質酶加強注射液，4天后，殺死小鼠，取出其脾。將脾放在10毫升無血清RPMI 1640，通過研磨浸在無血清RPMI 1640中的兩個玻璃顯微鏡玻片的霜凍末端的脾來形成單細胞上清液，用2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(RPMI)(Gibco，Canada)。通過無菌70目Nitex細胞濾過器(Becton Dickinson，Parsippany，NewJersey)過濾細胞懸浮液，然后以200xg離心5分鐘洗滌兩次，然后將沉淀重懸于20毫升無血清RPMI。用類似的方法，制備來自3個首次用于實驗的Balb/c小鼠取的脾細胞，并用作對照。將融合前3天保持在含11％胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI中的于對數生長期的NS-1骨髓瘤細胞以200xg離心5分鐘，按前段所述將沉淀洗滌兩次。
將1×108脾細胞與2.0×107NS-1細胞合并，離心，然后抽吸上清液。通過輕拍試管，使細胞沉淀離開原位，在1分鐘的過程中加入1毫升37℃ PEG 1500(在75mM Hepes，pH8.0中50％)(BoehringerMannheim)，同時攪拌，然后在7分鐘內加入7毫升無血清RPMI。再加入8毫升RPMI，將細胞以200xg離心10分鐘。棄去上清液后，將沉淀重懸在含15％FBS，100μM次黃嘌呤，0.4μM氨基蝶呤，16μM胸苷(HAT)(Gibco)，25單位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106脾細胞/ml的200毫升RPMI，然后鋪在10康寧平底96孔組織培養皿(Corning，Corning New York)中。
在融合后2，4和6天，從融合平板的孔中取出100微升培養基，用新鮮培養基代替。在第8天，按下列方法通過ELISA篩選融合，檢測其中是否存在與人幾丁質酶結合的小鼠IgG。用25mM Tris，pH7.5稀釋的100ng/孔人幾丁質酶在37℃將Immulon 4平板(Dynatech，Cambridge)涂覆2小時。抽吸涂覆溶液，加入200μl/孔封閉液[用CMF-PBS稀釋的0.5％魚皮明膠(Sigma)]，然后在37℃保溫30分鐘。用含0.05％Tween 20(PBST)的PBS將平板洗滌3次，然后加入50微升培養上清液。在37℃保溫30分鐘后，按上述洗滌，加入用PBST以1∶3500稀釋的50微升辣根過氧化物酶結合的山羊抗小鼠IgG(fc)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)。按上述將平板保溫，用PBST洗滌4次，加入100微升底物，底物由在100mM檸檬酸，pH4.5中的1mg/ml鄰-苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml30％H2O2組成。5分鐘后，加入50微升15％硫酸終止顏色反應。在平板讀數儀(Dynatech)上讀取A490。通過稀釋到96孔平板中將所選的融合孔克隆兩次，5天后，肉眼記錄每孔菌落數。用Isostrip系統(Boehringer Mannheim，IN)將雜交瘤生產的單克隆抗體同型化。
或者，主要按照Spitz酶學方法(Methods Enzymol.)12133-41(1986)完成利用單次注射的脾內免疫。將動物的脾暴露，然后注射按照實施例3-6任一所述方法得到的重組人幾丁質酶(例如以約0.02％-0.04％的濃度在PBS中10-20微克，含有或不含鋁佐劑)，此后將脾放回腹腔，用縫線縫合動物。3天后，殺死小鼠，然后取出脾。制備脾細胞懸浮液，用3％胎牛血清(FCS)補充的RPMI1640洗滌兩次，然后重懸在25毫升相同的培養基中。收集指數生長期的骨髓瘤細胞(NS-O)，洗滌一次，以3∶1或2∶1(脾細胞∶骨髓瘤細胞)加到在50毫升試管中的脾細胞懸浮液中。將混合物以約450xg(1500rpm)沉淀，抽吸上清液，輕拍試管弄松沉淀。通過在1分鐘內加入1毫升聚乙二醇(PEG)1500，同時恒定攪拌，在室溫完成融合。將混合物再保溫1分鐘，然后在1分鐘內加入1毫升熱RPMI(30-37℃)，然后在3分鐘內加入5毫升RPMI，再在另一3分鐘內加入10毫升RPMI。將細胞懸浮液離心，然后重懸在約200毫升HAT選擇培養基中，所述培養基由用100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，20％FCS，100μM次黃嘌呤，0.4μM氨基喋呤和16μM胸苷補充的RPMI 1640組成。將1毫升細胞懸浮液分散在組織培養皿中，然后在37℃在含5％二氧化碳-95％空氣的濕潤環境中保溫8-10天。將上清液抽吸，按照細胞生長情況，每隔2-3天用1毫升HAT培養基/孔給細胞補充營養。篩選匯合孔上清液的特異性抗體，然后克隆陽性孔。
用上述方法，產生與人幾丁質酶有反應性的數種單克隆抗體。為了融合243，在0天，將5只6-12周齡的Balb/c小鼠預先取血，然后通過皮下注射10-20微克按實施例5所述制備的重組人幾丁質酶進行免疫，幾丁質酶在弗氏完全佐劑中乳化。在第21、42和60天，用在不完全弗氏佐劑中的50微克同樣的重組人幾丁質酶給每只小鼠加強注射。在第216天至219天，每天給小鼠#2483再注射20微克重組人幾丁質酶。在第220天，無菌去除小鼠#2483的脾，然后按上述處理。簡而言之，通過研磨浸在無血清RPMI 1640中的兩個玻璃顯微鏡玻片的霜凍末端的脾來形成單細胞上清液，培養基中的補加有2mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(RPMI)(Gibco，Canada)。通過無菌細胞濾過器(Becton Dickinson，Parsippany，New Jersey)過濾細胞懸浮液，然后以200xg離心5分鐘洗滌兩次，然后將沉淀重懸于20毫升無血清RPMI。用類似的方法制備從首次用于實驗的Balb/c小鼠中取的胸腺細胞。
將融合前3天保持在含10％胎牛血清(FCS)(HycloneLaboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI中的于對數生長期的NS-1骨髓瘤細胞以200xg離心5分鐘，按前段所述將沉淀洗滌兩次，然后重懸在10毫升無血清RPMI中。
將脾細胞與NS-1細胞以5∶1的比例合并，以200xg離心，然后抽吸上清液。通過輕拍試管，使細胞沉淀離開原位，在1分鐘的過程中加入1毫升37℃PEG 1500(在75mM Hepes，pH8.0中50％)(Boehringer Mannheim)，同時攪拌，然后在7分鐘內加入14毫升無血清RPMI。再加入16毫升RPMI，將細胞以200xg離心10分鐘。棄去上清液后，將沉淀重懸在含15％ FBS，100μM次黃嘌呤，0.4μM氨基蝶呤，16μM胸苷(HAT)(Gibco)，25單位/ml IL-6(BoehringerMannheim)和1.5×106胸腺細胞/ml的200毫升RPMI，然后以200微升/孔鋪在10個康寧平底96孔組織培養皿(Corning，Corning NewYork)中。在用20號針(Becton Dickinson)從每個孔中抽吸約100微升進行篩選前，給平板中的細胞補充營養3-5次，加入100微升/孔上述平板培養基，該平板培養基含10單位/ml IL-6，但沒有胸腺細胞。
用ELISA，在免疫原(全長人幾丁質酶)上對來自融合產物243的上清液進行初步篩選，然后用山羊抗小鼠IgG(fc)辣根過氧化物酶結合物進行檢測。為了確保純系性(clonality)，通過用不含氨基喋呤的培養基有限稀釋，將從各融合產物篩選的陽性孔亞克隆4次。完成細胞系243K、243M和243Q的克隆。
用Isostrip試劑盒(Boehringer Mannheim)或者利用同種型特異性試劑(Zymed Laboratories，South San Francisco，CA)的ELISA，確定來自兩個細胞系之單克隆抗體的同種型。所有抗體均是IgG1同種型。
為了檢測這些抗體是否都具有針對幾丁質-結合結構域的特異性，用每個抗體檢測含全長幾丁質酶、C末端平截的幾丁質酶(氨基酸1-373)以及酵母中產生的重組幾丁質-結合結構域的Western印跡。3個抗體243K、243M和243Q與全長幾丁質酶和幾丁質-結合結構域結合，但不與C末端平截物結合。
檢測所有3種抗體的所有組合用于夾心ELISA的應用性。用125微升2μg/ml的第一抗體包被Nunc-Immuno Module平板，然后在4℃保溫過夜。然后用300微升/孔封閉液(5％Teleostean明膠，在CMF-PBS中的0.05％Proclin 300)代替抗體溶液。在室溫保溫30分鐘后，用在0mno稀釋劑((1％Teleostean明膠，0.05％Tween20在CMF-PBS中的0.05％Proclin 300)中的20ng/ml重組幾丁質-結合結構域代替封閉液，然后在37℃保溫30分鐘。用洗滌緩沖液(145mM氯化鈉，1.5％Tween 20)將孔洗滌5次，然后加入0.25μg/ml生物素化第二抗體。在37℃保溫30分鐘后，將孔再洗滌5次，用100微升鏈霉抗生物素-結合的辣根過氧化物酶(Pierce)處理，然后在37℃保溫30分鐘。再洗滌5次后，向孔中加入100微升底物(用二甲亞砜以1∶100稀釋到100mM醋酸鈉三羥化物中的0.01g/ml四甲基聯苯胺，pH5.5，0.015％H2O2)，然后在黑暗中在室溫保溫。30分鐘后，加入100微升1N硫酸終止反應，確定在450和630nm波長的吸收值。該方法鑒定出243Q(第一抗體)和243M(第二抗體)為相對于所有其他組合可傳遞最大信號的組合。生產抗體243Q的雜交瘤243Q被保藏于美國典型培養物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，保藏號為＿＿＿＿。生產抗體243M的雜交瘤243M被保藏于美國典型培養物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，保藏號為＿＿＿＿。
實施例9重組幾丁質酶的催化活性用在McUlvain緩沖液(Hollak等同上文)中的產熒光底物4-甲基umbell iferyl-β-D-N，N’，N”-三乙酰基殼三糖(4-MU-殼三糖，SigmaChemical，St.Louis，MO)測量殼三糖酶(幾丁質酶)活性。將10微升實施例5A中所述的重組產物樣品與10微升牛血清白蛋白(10mg/ml)，15微升產熒光底物(2.71mM)和65微升緩沖液(0.1M檸檬酸，0.2M磷酸鈉，pH5.2)以100微升的總體積混合。在37℃，將反應進行15分鐘，然后加入2毫升0.3M甘氨酸/NaOH緩沖液(pH10.6)終止反應。用熒光測量儀(SLM-AMINCO Instruments，Inc.，Rochester，NY)在450nm監測熒光裂解產物，4-甲基傘形酮。為了得到標準曲線，將數個底物濃度與過量細菌幾丁質酶混合以確保底物被完全裂解。然后已知量的4-MU與熒光測量儀的熒光信號相關聯，然后用線性回歸確定標準曲線。用實驗中稀釋的純化重組幾丁質酶產生的信號代表反應過程中由所述酶裂解的底物的nmol量。然后該數除以蛋白質的濃度以得到nmol/分鐘/mg蛋白質(用A280和計算的摩爾消光系數確定的)。
確定出在實施例5A COS細胞中產生的重組人幾丁質酶的殼三糖酶活性是90nmol/分鐘/mg蛋白質。還可以用該方法檢測本發明任何人幾丁質酶片段產物的幾丁質酶酶活性。
實施例10幾丁質酶片段產物的體外抗真菌活性可以檢測已與本發明的人幾丁質酶產物結合的常規抗真菌劑在體外已知真菌生長的作用。兩種真菌白色假絲酵母和煙曲霉對于無免疫應答的患者來說是炎癥的病原體。在37℃，使念珠菌和曲霉在RPMI生長培養基中生長到約10000-50000菌落形成單位(CFU)/ml。將系列稀釋的試驗藥物加到培養物中，在24小時，通過培養物的濁度評估真菌的生長。
還可用瓊脂擴散實驗，按照國家委員會關于臨床實驗室標準的肉湯檢測，以及按照Selitrennikoff，Antimicrob.AgentsChemother.，23757-765(1983)的細胞壁抑制實驗評估試驗藥物的抗真菌活性。
在瓊脂擴散實驗中，將約1×106細胞/ml白色假絲酵母(ATCCno.90028)接種到1.5％瓊脂(用2-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)，pH7.0緩沖的RPMI 1640培養基)中。將含一定量例如50微克試驗藥物或對照的平皿放在瓊脂上，然后測量生長抑制區。
在肉湯實驗中，將一定量例如50微克/ml試驗藥物或者對照與一定濃度的試驗真菌一起加到用MOPS，pH7.0緩沖的RPMI 1640培養基中。將樣品在35℃培養48小時，同時以120rpm振蕩，然后通過測量懸浮液的濁度評估生長情況。適宜濃度的試驗真菌包括2.5×104細胞/ml白色假絲酵母(ATCC no.90028)；5×104細胞/ml白色假絲酵母聚烯抗性(ATCC no.38247)；1×104細胞/ml煙曲霉(ATCC no.16424)；1×104細胞/ml粗糙鏈孢霉(ATCC no.18889)和1×104細胞/ml啤酒酵母(ATCC no.26108)。
基本按照Selitrennikoff，同上文所述，將1.5×105原生質體/ml接種到瓊脂(Vogel’s Medium N，7.5％山梨醇，1.5％蔗糖，10微克ml煙酰胺和1％瓊脂)中，然后在25℃培養72小時，完成os-1全細胞檢測，該檢測可鑒定真菌細胞壁生物合成抑制劑。在將含一定量例如50微克試驗藥物或對照的平皿放在瓊脂培養基上后，監測培養物的生長和形態改變。os-1細胞是當在37℃的特定條件下培養時，生長為沒有細胞壁的原生質體，但在溫度變為約22℃的適宜條件下再生出細胞壁的粗糙鏈孢霉的突變株。抑制生長的樣品被認為是真菌生長抑制劑，抑制細胞壁再生，但不殺死細胞的樣品被認為是細胞壁特異性抑制劑。
實施例11重組幾丁質酶在小鼠體內的抗真菌活性按下列方法確定重組人幾丁質酶在小鼠中的藥物動力學。給6-8周齡的雌性Balb/c小鼠通過在尾靜脈中進行靜脈內注射施用0.5mg/kg，5.0mg/kg和50mg/kg的重組人幾丁質酶。對于每個劑量，在注射后0.01，0.25，1，8和24小時后定時取血(每個劑量，每個時間點使用2只動物)。然后監測血清樣品的幾丁質酶活性和濃度。在下表3中列出了結果。
表3
AUC在曲線下到無窮時間的面積Vss分布的穩定狀態體積cL清除率
MTR總身體平均滯留時間Cmax峰值血清濃度可用同樣的方法評估本發明的幾丁質酶片段產物或者含所述幾丁質酶片段產物的藥物的藥物動力學。
已開發了數個動物模型用于檢測抗真菌化合物的效力[參見Louie等，感染與免疫(Infect.Immun.)622761-2772，1994；Kinsman等抗微生物劑和化療(Antimicrobial Agents andChemotherapy)371243-1246，1993；Nakajima等抗微生物劑和化療(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)391517-1521，1995；Tonetti等歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)251559-1565(1995)；Denning和Stevens，抗微生物劑和化療(Antimicrob.Agents Chemother.)351329-1333(1991)；另參見Stevens，J.Mycol.，Med.，6(suppl.I)7-10(1996)]。簡而言之，用真菌感染動物宿主，給所述動物施用不同劑量的試驗藥物，過一段時間測量其存活。用常規抗真菌劑或者與幾丁質酶片段產物結合的同樣的試劑完成比較實驗以確定所述試劑與幾丁質-結合片段產物的結合是否提高其抗真菌效力。具體地講，通過10×106CFU白色假絲酵母的腹膜內或者靜脈內攻擊使小鼠患急性全身性念珠菌病。在攻擊前或者在攻擊后1-5小時施用治療劑，5天后確定存活小鼠的數量。另外，可將小鼠殺死，確定具體器官例如腦、腎、肺、肝和脾中的真菌數。或者，用較低劑量的真菌例如曲霉(8-10×106CFU)或者念珠菌(1×106CFU)攻擊小鼠，其中在更久的時間點，例如45天測量存活的小鼠數。通過連續治療一周或更長的時間，例如11天，然后跟蹤動物達數周，例如18天至一個月可評估試驗藥物的長期殺真菌/抑制真菌活性。有效的抗真菌劑可提高動物的長期存活并減少血液和器官中的真菌數。
實施例12在侵染性曲霉病兔模型中幾丁質酶的體內活性用侵染性曲霉病的免疫抑制兔模型評估含幾丁質酶片段產物的治療劑的效力，該模型用于評估各種抗真菌治療已達十多年。參見例如，Andriole等，臨床傳染病(Clin.Infect.Dis.)。14(Suppl.1)S134-S138(1992)。主要按照Patterson等，抗微生物劑化療(Antimicrob. Agents Chemother.)372307-2310(1993)或者George等，傳染病雜志(J.Infect.Dis.)，168692-698(1993)所述完成該研究。簡而言之，在第1天，給兔靜脈內施用環磷酰胺(200mg)以減少其血小板，然后在實驗過程中每天皮下施用曲安奈德(10mg)。在第2天，在免疫抑制24小時后，將動物用約105(致死攻擊)或約105(亞致死攻擊)煙曲霉分生孢子進行靜脈內攻擊。在攻擊24小時后或攻擊48小時前(預防性的)，開始用試驗藥物進行抗真菌治療并持續5至6天或直至動物死亡。常規抗真菌劑的示范劑量為1.5或0.5mg/kg/天靜脈內給藥兩性霉素B，60或120mg/kg/天口服給藥氟康唑和100mg/kg/天口服給藥5-氟胞嘧啶。對照兔不用抗真菌劑治療。
在尸檢或死亡時，對肝、脾、腎、肺和腦進行半定量真菌培養和組織病理學檢查。還對心臟、尿和血進行培養。間隔取血并檢測白細胞計數并用ELISA檢測分析循環中的曲霉碳水化合物抗原。按三種效應評估用試驗藥物治療的效果死亡率的降低、來自靶器官的曲霉微生物數量(真菌負荷)的減少以及循環曲霉抗原水平的降低。有效的抗真菌劑可以降低死亡率和/或真菌負荷。
或者，可以按照Cbilvers等，Mycopathologia，108163-71(1989)的描述，用該模型評估肺曲霉病，其中，將免疫抑制的兔用煙曲霉分生狍子通過氣管內滴注進行攻擊，然后在攻擊后的第1、2、4、7和10天進行支氣管肺泡灌洗；對灌洗液進行真菌培養、幾丁質檢測、白細胞計數以及組織病理學分析以確定肺內的感染負荷。有效的抗真菌劑可以減少肺內的感染負荷或炎癥。
實施例13在彌散性念珠菌病兔模型中幾丁質酶的體內活性按照Rouse等，抗微生物劑化療(Antimicrob.AgentsChemother.)，3656-58(1992)的描述在彌散性念珠菌病兔模型中評估含幾丁質酶片段產物的治療劑的效力。將新西蘭白兔用約3×106白色假絲酵母芽生孢子進行全身性感染。在用念珠菌攻擊后48小時(或在攻擊前預防)開始用試驗藥物進行抗真菌治療并持續例如4天。處死存活的動物，對帶有附著了贅生物的主動脈瓣、肺、腎和脾進行真菌培養。對這些以及其他的器官如肝、腦和心臟同樣進行真菌培養和組織病理學檢查。還進行了尿和血的培養。確定抗真菌治療對死亡率和循環或組織真菌負荷的效力。
Bayer等，抗微生物劑化療(Antimicrob.Agents Chemother.)，19179-184(1981)描述了用約5×108CFU白色假絲酵母腹膜內接種的兔模型。在腹膜內接種后4天，從各動物獲取鹽水腹膜吸出物并培養，將真菌培養吸出物呈陽性的動物隨機分成對照或治療組。攻擊7天后開始用試驗藥物進行抗真菌治療。用檢眼鏡間接檢查法對所有兔子的眼睛進行評估，因為彌散性念珠菌病可以引起念珠菌眼內炎。在開始治療7、11和14天后處死動物并檢查其腹部是否有腹膜炎和腹內膿腫形成的跡象。用肉眼觀察眼睛的損傷。將來自腹膜膿腫、其他所有可見膿腫、腎、肝、脾和眼結構的組織樣品稱重，在腦心灌注肉湯中勻漿化、系列稀釋然后培養以確定每克組織的CFU。還將腎和腹膜膿腫在10％中性甲醛中固定并進行組織病理學檢查。將切片用高碘酸-Schiff試劑染色以確定真菌負荷和真菌形態。評估藥物改善存活率和減少真菌負荷的效力。
實施例14在真菌眼內炎兔模型中幾丁質酶的體內活性按照Park等，抗真菌劑化療(Antimicrob.Agents Chemother.)39958-963(1995)的描述在念珠菌眼內炎兔模型中評估含幾丁質酶片段產物的治療劑的效力。簡而言之，將2-2.5kg新西蘭白化兔用約1000CFU的白色假絲酵母玻璃體內接種感染。接種5天后通過檢眼鏡間接檢查確定所述兔感染了眼內炎，并根據視網膜和脈絡膜脈管系統的部分或大于50％的完全變暗而將眼內炎定義為中度至嚴重玻璃體模糊。玻璃體的濁度按大小分級，可通過基底照相術將基底外觀分級并記錄。然后用試驗藥物給兔治療2-4周。常規抗真菌劑的示范劑量為80mg/kg/天的口服氟康唑，每隔12小時100mg/kg口服5-氟胞嘧啶。
在治療2和4周，通過間接檢眼鏡檢查、定量真菌培養和組織病理學檢查評估治療效果。對于定量真菌培養，將眼割下并稱重，將各樣品稱重的部分勻漿，然后在布魯氏桿菌瓊脂-5％馬血平板上，在35℃5-10％CO2中培養48小時。還可將勻漿的樣品在鋪板前用無菌鹽水稀釋10-或100倍。以從測量的樣品部分產生的生長為基礎，用肉眼計數菌落和總CFU。根據總眼內真菌負荷的減少來評估治療效果。對于組織病理學檢查，取出代表性的眼，用福爾馬林固定，包埋入塑料，然后切成5微米的切片。將所述切片用蘇木精-曙紅或者Gomori’s烏洛托品銀染料染色，然后用光學顯微鏡進行炎癥、纖維組織和真菌檢查。評估抗真菌劑對降低死亡率、減少真菌負荷或者降低與真菌感染有關的炎癥的作用。
或者，主要按照Jain等，Doc.OphthDlmol.，69227-235(1988)所述使用曲霉眼炎兔模型。簡而言之，給新西蘭白兔的一只眼中接種約40個煙曲霉的孢子。其對側眼(對照)接受同樣量的無菌接種物。用試驗藥物治療后，可評估兔眼的臨床外觀、視網膜電圖波形、檢眼鏡間接檢查、定量真菌培養和組織病理學檢查。臨床上明顯的眼內炎主要是在接種后3-7天內發生。
實施例15幾丁質酶在真菌心內膜炎兔模型中的體內活性主要按照Witt和Bayer，抗微生物劑化療(Antimicrob.AgentsChemother.)，352481-2485(1991)所述用念珠菌心內膜炎兔模型評估含幾丁質酶片段產物的治療劑的效力。另外可參見Longman等，傳染病綜述(Rev.Infect.Dis.)，12(Suppl.3)S294-298(1990)。通過經主動脈瓣放置一無菌聚乙烯導管(內徑，0.86mm)，使新西蘭白兔產生無菌血栓形成心內膜炎，所述導管在研究期間保持在原處。然后在插管48小時后，通過靜脈內注射約2×107白色假絲酵母芽生孢子建立傳染性心內膜炎。或者，還使用近平滑假絲酵母。在真菌攻擊前24小時或者之后24-60小時開始用試驗藥物進行抗真菌治療。治療持續9-12天。常規抗真菌劑的舉證性劑量為1mg/kg/天靜脈內兩性霉素B，50mg/kg/天或者100mg/kg/天靜脈內或者腹膜內氟康唑。不給對照兔施用抗真菌劑。在處死時，取出心，確定所述導管的位置。去除來自各動物的心贅生物，合并，稱重，然后用1毫升無菌鹽水勻漿。將所述勻漿物系列稀釋，然后在35℃，酵母鉀葡萄糖瓊脂上定量培養48小時。以平均贅生物重量為基礎，認為培養陰性贅生物含不到2log10CFU/克。
實施例16人幾丁質酶片段的幾丁質-結合活性和幾丁質水解活性A.幾丁質-結合結構域對于幾丁質酶與幾丁質的結合是必需的將全長幾丁質酶(445個氨基酸)的幾丁質-結合和殼三糖酶活性與上述實施例5中所述的C末端平截片段(氨基酸1-373)的活性進行比較。按下列方法制備全長幾丁質酶和幾丁質酶片段。將實施例5中所述全長幾丁質酶(MO-13B)和373氨基酸C末端平截片段的表達構建體轉染到COS細胞中。24小時后，用不含胎牛血清的培養基代替培養基[Dulbecco’s改性Eagle培養基(Gibco)+10％胎牛血清+1mM L-谷酰胺+100U/ml青霉素+100微克/ml鏈霉素]。將細胞再培養3天，此后，收集培養基，并檢查水解和幾丁質-結合活性。
按實施例9所述確定的殼三糖酶活性的水平與從表達全長幾丁質酶(57.6nmol/ml/分鐘)的培養基和表達C末端平截片段(57.8nmol/ml/分鐘)的培養基中的活性幾乎相同。這與實施例6中報道的結果一致。用于確定殼三糖酶活性(按實施例9)的底物是三乙酰基殼三糖，三個殘基的可溶性寡糖。
為了比較幾丁質-結合活性，用研缽和杵將蟹殼幾丁質(Sigma)磨成細粉，用平衡緩沖液(20μM Tris.pH8，500μM NaCl)洗滌3次，然后重懸為100mg/ml。將100微升幾丁質懸浮液加到1毫升轉染的COS細胞培養基中，在4℃，將混合物培養4小時，同時用連續立式圓筒混合機混合。培養后，通過離心(5分鐘，12000xg)沉淀幾丁質。用Laemmli緩沖液和50mM二硫蘇糖醇(DTT)補充等體積上清液，煮沸，通過12％聚丙烯酰胺凝膠(Novex)電泳。隨后用幾丁質酶-特異性單克隆抗體(260A)通過Western印跡分析凝膠表明在上清液中沒有全長幾丁質酶，即所有全長幾丁質酶均已于幾丁質結合并已與幾丁質一起沉淀。相反，在上清液中C末端平截片段(氨基酸1-373)的量沒有辨別得出的的減少，這表明所述平截物未與幾丁質結合。
這些觀察結果表明人幾丁質酶的72個C末端氨基酸對于幾丁質-結合活性是必需的，但對于三乙酰基殼三糖的水解不是必需的。
B.幾丁質-結合結構域對于幾丁質而不是三乙酰基殼三糖的水解是必需的上述用于實施例16A中用于確定殼三糖酶活性的底物是可溶的，三殘基寡糖。但是，天然幾丁質是長鏈不溶性多糖。因此，有可能能夠水解小類似物的酶不能水解幾丁質。為了比較全長幾丁質酶(445個氨基酸)與C末端平截片段(1-373個氨基酸)的幾丁質分解活性，將蟹殼幾丁質摻入到瓊脂糖凝膠中。在固化凝膠中打孔，加入全長幾丁質酶或平截物。保溫后，孔周圍的澄清區表明幾丁質水解的程度。
按下列方法完成試驗。將0.4％幾丁質懸浮液和1.5％瓊脂糖在20μM磷酸鈉pH6中煮沸，倒入10厘米平皿中，達到2毫米的厚度，使其固化。瓊脂糖/幾丁質基質中的切出直徑3毫米的孔。向孔中加樣前，在30000分子量截斷過濾裝置(Millipore)上，將來自轉染的COS細胞之培養基中的重組蛋白濃縮70倍。將等量全長和C末端平截重組蛋白加入到相鄰孔中。第3個孔加入來自模擬轉染的COS細胞的濃縮培養基。需要重復每個孔的等量負荷以便產生可用肉眼觀察的澄清區。在負載有來自產生全長幾丁質酶的COS細胞的濃縮培養基的孔周圍，觀察到距孔達3毫米的澄清區。在含平截物的培養基或模擬轉染細胞培養基的孔周圍沒有觀察到澄清區。
這些結果表明人幾丁質酶的C末端72個氨基酸對于幾丁質的水解是必需的。
實施例17通過與其他試劑結合的重組幾丁質-結合結構域的化學修飾為了檢測幾丁質-結合結構域是否能夠作為小分子藥物的載體，將由人幾丁質酶氨基酸392-445組成的幾丁質-結合結構域與生物素或者羅丹明按下列方法化學結合。
按照制造商的方法用Pierce EZ-link Sulfo-NHS-BiotinyJation試劑盒(Pierce)完成生物素化。預期NHS鍵針對在幾丁質-結合結構域上的游離氨，而游離氨被發現位于N末端的賴氨酸402和440。與預期一致，MALDI質譜表明有三種生物素化產物，其質量分別對應于每個肽一個、兩個或三個生物素分子。大部分(＞60％)是三生物素化的。
用琥珀酰亞胺基(succinimidyl)鍵(Molecular Probes)，將羅丹明與幾丁質-結合結構域的N末端相連。
生物素-或者羅丹明-標記的肽與幾丁質的結合同非標記肽的結合特性是沒有區別的。這表明幾丁質-結合結構域能夠耐受一些化學修飾而不會損害其幾丁質-結合活性。
預期本領域技術人員可以對上述本發明進行許多修飾和改變。因此，僅有后附的權利要求書可構成所述限制。
序列表<110>(發明人)Gray，Patrick W.
(發明人)Tjoelker，Larry W.
ICOS CORPORATION<120>幾丁質酶幾丁質結合片段<130>27866/35407<140><141><150>09/039，198<151>1998-03-12<160>39<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1636<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(2)..(1399)<220><221>成熟肽<222>(65)..(1399)<400>1c atg gtg cgg tct gtg gcc tgg gca ggt ttc atg gtc ctg ctg atg atc 49Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met Ile-20 -15 -10cca tgg ggc tct gct gca aaa ctg gtc tgc tac ttc acc aac tgg gcc 97Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala-5 -1 1 5 10cag tac aga cag ggg gag gct cgc ttc ctg ccc aag gac ttg gac ccc 145Gln Tyr Arg Gln Gly Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro15 20 25agc ctt tgc acc cac ctc atc tac gcc ttc gct ggc atg acc aac cac 193Ser Leu Cys Thr His Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His30 35 40cag ctg agc acc act gag tgg aat gac gag act ctc tac cag gag ttc 241Gln Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe45 50 55aat ggc ctg aag aag atg aat ccc aag ctg aag acc ctg tta gcc atc 289Asn Gly Leu Lys Lys Met 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Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly-20 -15ttc atg gtc ctg ctg atg atc cca tgg ggc tct gct gca aaa ctg gtc101Phe Met Val Leu Leu Met Ile Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val-10 -5 -1 1tgc tac ttc acc aac tgg gcc cag tac aga cag ggg gag gct cgc ttc149Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gln Tyr Arg Gln Gly Glu Ala Arg Phe5 10 15 20ctg ccc aag gac ttg gac ccc agc ctt tgc acc cac ctc atc tac gcc197Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro Ser Leu Cys Thr His Leu Ile Tyr Ala25 30 35ttc gct ggc atg acc aac cac cag ctg agc acc act gag tgg aat gac245Phe Ala Gly Met Thr Asn His Gln Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp40 45 50gag act ctc tac cag gag ttc aat ggc ctg aag aag atg aat ccc aag293Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys55 60 65ctg aag acc ctg tta gcc atc gga ggc tgg aat ttc agc act cag aag341Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile Gly Gly Trp Asn Phe Ser Thr Gln Lys70 75 80ttc aca gat atg gta gcc acg gcc aac aac cgt cag acc ttt gtc aac389Phe Thr Asp Met Val Ala Thr Ala Asn Asn Arg Gln Thr Phe Val Asn85 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29<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>10tacatctaga ctccatccag aaaaacaggt atgg 34<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>11tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30<210>12<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>12cgcaagcttg agagctccgt tccgccacat ggtgcggtct gtggcctggg 50<210>13<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>13gactctagac taggtgcctg aaggcaagta tg 32<210>14<211>373<212>PRT<213>人<400>14Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gln Tyr Arg Gln Gly1 5 10 15Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro Ser Leu Cys Thr His20 25 30Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His Gln Leu Ser Thr Thr35 40 45Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe Asn Gly Leu Lys Lys50 55 60Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile Gly Gly Trp Asn Phe65 70 75 80Gly Thr Gln Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr Ala Asn Asn Arg Gln85 90 95Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg Lys Tyr Ser Phe Asp100 105 110Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro 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1.幾丁質-結合的，幾丁質酶失活的多肽，含有SEQ ID NO2所列人幾丁質酶的54個C末端氨基酸的幾丁質-結合片段。
2.權利要求1的多肽，選自下列多肽含有SEQ ID NO2的氨基酸殘基347-445之序列的多肽，含有SEQ ID NO2的氨基酸殘基374-445之序列的多肽，含有SEQ ID NO2的氨基酸殘基392-445之序列的多肽，含有SEQ ID NO2的氨基酸殘基395-445之序列的多肽以及含有SEQ ID NO2的氨基酸殘基397-445之序列的多肽。
3.選自含有SEQ ID NO2氨基酸殘基X-Y的序列的多肽的多肽，其中X是從347-397的連續整數，Y是445。
4.含有權利要求3多肽的幾丁質-結合的、幾丁質酶失活多肽。
5.含有與異源多肽融合的權利要求1多肽的融合蛋白。
6.權利要求5的融合蛋白，其中所述異源多肽是酶。
7.含權利要求1多肽和生理學可接受稀釋劑的組合物。
8.權利要求7的組合物，還含有非幾丁質酶抗真菌劑。
9.含與抗真菌劑結合的權利要求1或4多肽的組合物。
10.治療真菌感染的方法，包括給患有真菌感染的個體施用權利要求7-9的任一組合物。
11.權利要求10的方法還包括給所述個體施用非幾丁質酶抗真菌劑。
12.含有與可檢測標記結合的權利要求1或4多肽的組合物。
13.權利要求12的組合物，其中所述可檢測標記選自放射性同位素、熒光團、染料、電子致密化合物和酶。
14.檢測樣品中幾丁質存在的方法，包括(a)將所述樣品與權利要求12的組合物接觸和(b)確定與幾丁質結合的標記的多肽的量。
15.診斷樣品中幾丁質存在的試劑盒，含有權利要求12的組合物。
16.編碼權利要求1多肽的純化的分離的多核苷酸。
17.權利要求16的多核苷酸，其為DNA。
18.含權利要求17的DNA的載體。
19.用權利要求17的DNA以使其在宿主細胞中表達由所述DNA編碼的多肽的方式穩定轉化或轉染的宿主細胞。
20.生產含人幾丁質酶片段的多肽的方法，包括在營養培養基中培養權利要求19的宿主細胞，然后從所述宿主細胞或所述營養培養基中分離所述多肽。
21.用權利要求20的方法生產的純化的分離的多肽。
22.與SEQ ID NO2所列人幾丁質酶的54個C末端氨基酸內表位特異性結合的單克隆抗體。
23.權利要求22的單克隆抗體，其與由保藏的雜交瘤ATCC No.＿＿，產生的單克隆抗體243Q競爭結合人幾丁質酶的幾丁質-結合、幾丁質酶失活片段。
24.權利要求22的單克隆抗體，其與由保藏的雜交瘤ATCC No.＿＿，產生的單克隆抗體243M競爭結合人幾丁質酶的幾丁質-結合、幾丁質酶失活片段。
全文摘要
本發明提供了人幾丁質酶的幾丁質－結合片段、片段類似物、編碼所述片段和類似物的純化和分離的多核苷酸序列,以及用于重組生產人幾丁質片段產物的物質和方法,所述片段產物預期可用于檢測幾丁質,結合幾丁質并治療真菌感染或者開發用于治療所述疾病的產物。
文檔編號G01N33/53GK1357046SQ99805990
公開日2002年7月3日 申請日期1999年3月12日 優先權日1998年3月12日
發明者P·W·格雷, L·W·祖克爾 申請人:艾科斯有限公司