專利名稱：一種安全期避孕試紙及其檢測方法
技術領域：
本發明是涉及一種婦女避孕用品及其檢測方法，即一種安全期避孕試紙及其檢測方法。
排卵是發生于卵巢周期中的關鍵事件。通常，正常育齡婦女每月僅發生一次排卵。若能準確地測定該排卵期，避開在排卵期同旁，便能有效地達到避孕的目的。生殖內分泌研究的結果表明，LH(黃體生成素)能促進成熟卵子的排放和黃體的形成。因而在排卵前，血與尿中的LH值升高，達到峰值。大多數婦女(95％)在LH達到峰值后不久(LH高峰后9.5-23小時，平均16.5小時)即發生正常排卵，因而LH到達峰值的時間可作為預告排卵的精確標志。因此，正確判斷排卵時間，對于指導安全期避孕非常重要。同時，排卵的監測也是不孕癥診治的重要手段，還是人工授精、試管嬰兒等醫療技術中不可缺少的組成環節，對于那些輸卵管缺如堵塞或輸卵管成形術失敗者或不適宜做輸卵管吻合術的不育癥患者來說，試管內受精是一種有效的治療措施，而試管受精的成敗的關健則是能否在自然排卵前幾分鐘及時地取得成熟的卵母細胞。因此，準確地預報排卵時間對于確定最佳的人工授精時刻和試管內受精的成敗至關重要。排卵預測除了在人類生育、不育和節育中有廣泛的應用前途外，在珍貴哺乳動物和良種家畜培育、發展畜牧業等方面也有著極深遠的實用價值，大熊貓的繁殖就是生動的一例。由此可見，排卵預測技術有著重要的實踐意義。現有的排卵預測方法有婦女自我檢測法和臨床檢測法等下列幾種1、婦女自我檢測法此類排卵預測法大多為育齡夫婦自行掌握，它們無需借助于精密的儀器設備，比較簡便易行，因而被人們沿用至今，具體包括(1)排卵期推算法它只能預測可能的排卵日期及范圍，無法確切測知準確日期，因而它只能作為安全期避孕的一種參考，而不能用于人工授精及試管內受精。況且，人類的排卵常受生理及心理等因素的制約，在特定條件下，排卵期也未必是一個相對的常數，因而此法易發生誤差而造成失敗，其失敗率為14.4-47.0/100婦女年。(2)基礎體溫測定法該法以基礎體溫作為檢測黃體的形成，以達到測定排卵期，由于它只能間接表明排卵已經發生或是黃體已經形成，但它無法預告排卵的發生，故而此法只能回顧性指示可能發生排卵，而不能前瞻性地預告排卵的時刻，據Marshall的報道，其失敗率為6.6/100婦女年。(3)宮頸粘液觀察法它以一次月經來潮后緊接著出現的“干燥期”作為不孕期，干燥期4天后左右，有膠粘感而無伸展性粘液出現作為G型粘液，在排卵前期，宮頸粘液開始變得稀滿薄、透明、清亮而滑潤作為E型粘液，出現E型粘液的最后一天稱為“高峰日”，即排卵即將發生，高峰日以后第三天，是可能受孕的日期，排卵以后宮頸粘液復又變為粘稠、不透明，分泌量也減少，從此時開始到下次月經來潮共11天左右，此期為不孕期，此法亦適用于產褥期、哺乳期、青春期與更年期；Billings用此法指導避孕，妊娠率為0.5-2.9/100婦女年，故它比排卵期推算法和基礎體溫測定法略優，然而它還不能精確地預測排卵日期，故也不能用于人工授精及試管內受精。2、現代臨床檢測法(1)促黃體生成激素(LH)峰值的測定以LH到達峰值的時間作為預告排卵的標志。垂體前葉LH釋放的無規律性使排卵前活動的確切時間難以估計，由于需要頻繁取血標本，使LH峰值的精確測定有一定困難。(2)孕酮的測定根據排卵后血孕酮濃度的明顯升高來預測排卵，此法在采血后3小時即可獲得結果，每一天可重復多次。(3)血雌二醇測定以測定血中雌二醇值來預測排卵，由于血雌二醇值只能反映濾泡的發育和成熟程度，難以單獨作為預測排卵的標志。(4)唾液中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)的測定以測定唾液中NAG活力作為排卵預測的一種手段。(5)其它臨床觀察方法采用觀察宮頸口，分析宮頸粘液的拉絲度及羊齒狀結晶的形成，檢查陰道細胞的圓柱固縮指數，超聲波顯像檢查卵泡的大小等方法作為預測排卵的輔助手段。除上述方法外，近年來又發展了尿中生殖激素葡萄糖苷酸、電子測溫器、電解質測定等新的排卵預測法，但目前尚未大規模地用于臨床。上述各種方法中，凡是婦女經醫師指導后可自行常掌握的方法雖簡單易可行，但準確度不高，用它來指導避孕有時會造成的失敗。凡屬臨床觀察和實驗測定法(其中特別是血LH上升起始值和血孕酮值的測定)，雖準確度高，但方法不夠簡便，且需一定的儀器設備，一般來說只用于人工授精和試管內受精，不便用于家庭中來指導安全期避孕。近年來利用金標探針發展的免疫層析一步法已廣泛用于各種臨床診斷，免疫層析一步法是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，當該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品(尿液或血清)后，由于毛細血管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣品中已與金標抗體發生特異結合的相應的抗原將被此具有不同結合位點的抗體所識別，從而發生三明治式的特異結合。這樣，滯留于此區域的膠體金將顯示相應的紅色，即可檢測出不同含量的抗原，達到特異性的免疫診斷。目前，已有多種免疫膠體金的檢測藥盒，其成品有紙片法、包被小珠或膠片法等多種形式，其中最常用的有早孕檢測試紙、排卵檢測試紙等。這些試紙操作簡便快速，只需將試紙條的一端浸入婦女尿中，1分鐘后取出橫放，1-10分鐘后根據顏色的變化程度即可判斷是否受孕或是否排卵，因而很受開業醫師及家庭使用者的歡迎，如美國、英國、加拿大及日本等許多國家都有這類盒的生產和銷售。我國目前也有多家公司在生產和銷售金標早孕試紙，這些試紙按WHO標準可檢出尿中HCG最低量為25mIU/ml，可在懷孕7-10天內及早檢測出來，其所使用的抗黃體生成素(LH)的單克隆抗體細胞株是由美國合資公司提供的，同時所用的紙形材也購自美國，因而成本較高，價格較貴。此外，這兩種LH檢測試紙均是參照國外標準，即以尿LH＜20mIU/ml為基礎水平，大于或等于40mIU/ml為該月經周期尿中LH峰即將出現。而據國內的一些研究資料及申請人用放射免疫測定法檢測近300例正常育齡婦女晨尿的結果來看，很多婦女的尿LH峰值是低于40mIU/ml的，這樣，上述兩種試紙便無法準確地檢出這類婦女的LH峰值，導致假陰性，出現漏檢。
本發明針對上述存在問題，其目的在于提供一種價格低廉、能準確測出LH峰值的安全期避孕試紙及其檢測方法。
本發明是利用免疫層析一步法原理，將特異的抗LH單克隆抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，當該干燥的硝酸纖維素一端浸入尿液后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣品中已與另一抗LH金標抗體發生特異結合的相應的LH抗原將被膜上的抗LH抗體所識別，發生三明治式的特異結合，與此同時，滯留于此區域的膠體金將顯示相應的紅色。這樣，即可通過測定尿液中的黃體生成素(LH)的含量，來測定育齡婦女每月中的LH峰值，從而確定其相應的排卵期。它與傳統的用于測定LH的放免測定試劑盒及酶免測定試劑盒相比，LH檢測試紙具有操作簡單快速，結果易于判斷之特點，它只需將試紙條的一端浸入婦女尿樣中，1分鐘后取出橫放，5分鐘后根據顏色的變化程度即可病判斷是否排卵。
本發明具有測試準確、快速、方便、成本低廉的特點，它可廣泛應用于家庭、醫院以及其它場所，由于它可以精確地測定正常育齡婦女每個月經中期中的排卵時間，從而科學地指導“安全期”避孕，可為計劃生育之基本國策提供一種最新的產品，本產品亦可用于人工授精、試管嬰兒及不孕癥的檢測。


圖1是本發明LH試紙條的主視結構圖。
圖2是本發明LH試紙條應用于測試時顯示為陽性結果圖。
圖3是本發明LH試紙條應用于測試時顯示為陰性結果圖。
圖4是本發明圖1的俯視剖視結構圖。
以下結合附圖及實施例對本發明作詳細描述。
本發明是利用免疫層析一步法原理，將特異的抗LH單克隆抗體和另一抗LH金標探針分別固定于硝酸纖維素膜的某一相連區帶，利用從月經過后每天浸入該膜的尿液樣品中相應LH抗原可與抗LH金標探針抗體發生特異結合后而被抗LH單克隆抗體識別，即發生三明治式的特異結合，從而通過測定尿液中的黃體生成素LH的含量，即可測定育齡婦女每月中的LH峰值，以準確確定其相應的排卵期，即滯留于此區域的金標探針將顯示相應的紅色，當有紅色顯示線出現時，便預示已進入排卵期，從紅色顯示線消失時當日連續2天測定一直無色帶顯現時，直至到下次月經來前的這段時間便是絕對的“安全期”。在底板(7)上固定有帶抗LH單克隆抗體的硝酸纖素膜層(5)，在該膜層(5)的兩端分別固定有一層吸水紙層(6)和玻璃纖維紙層(1)，并在玻璃纖維紙層(1)與硝酸纖維素膜(5)之間夾上帶有抗LH金探針的玻璃纖維素膜層(2)。從月經過后開始使用試紙檢，每天使用一條，一直測到有紅色顯示線出現，便預示進入排卵期；再測到顯示線紅色消失時，并且從這天連續2天測定一直無色帶顯現時，即可停止使用，而從這時到下次月經來前的這段時間便是絕對的“安全期”，即當測得LH＜25mIU/ml時，均無色帶顯現，LH＞25mIU/ml時均有色帶顯現，且LH的濃度越高，試紙條上的色帶也就越深。硝酸纖維素膜層(5)上設有測試線(3)和控制線(4)。本發明做了如下試驗一、靈敏度的測定用該試紙檢測含LH標準品(Sigma公司產品)0、5、10、20、25、50、100、200mIU/ml，得出最低檢測限為25mIU/ml。即LH高于25mIU/ml時均有帶，而且帶的顏色隨LH的含量增高而相應加深；低于25mIU/ml和0mIU/ml時均無帶。
二、前帶現象觀察用陰性尿液將LH分別配制成100，200，300IU/ml濃度，結果發現在100-300IU/ml濃度下，試試紙條均有紅色區帶出現，說明該試紙條的結構設置已排除了胡克現象的干擾。
三、交叉反應將糖蛋白激素促卵泡生成素(FSH)加至不含LH的尿液樣品中，使其濃度分別達到0、100、250、500IU/ml，該試紙條測定結果均為陰性，說明本測定在FSH濃度高達500IU/ml時仍與該避孕試紙條沒有交叉反應。一般正常育齡婦女月經中期尿液中FSH生理高峰值為10.57mIU/ml，因此在生理情況下，不會有因FSH過高造成的交叉反應。
四、干擾試驗下列物質加到不含有LH的尿或含LH200mIU/ml的尿中進行試驗。干擾物質包括乙酰基水楊酸，濃度均為200mg/L，雌二醇14mg/L，蛋白質20g/L，葡萄糖2g/dl，血紅蛋白250g/dl，膽紅素10g/dl，甘油三酯970mg/dl，以及改變PH5至PH9。每組試驗各做三份。所得結果為凡不含LH的樣品，不管是否含干擾物質，均為陰性結果；凡含LH200mIU/ml的樣品，不管是否含干擾物質，均為陽性結果，說明它們對LH的測定均無明顯干擾。
五、儲存穩定性將裝有試紙條及干燥包的密封鋁箔袋分別置37℃溫箱與4℃冰箱中，分別每隔2天及15天取出，每次均分別以相同的一份陽性標本和相同的陰性標本檢測。置37℃保存1個月及4℃保存7個月的測定結果與保存前的結果一致。
實施例1制備試紙條，該試紙所需的主要原材料由云南大學培養的抗LH單克隆體H8和G6細胞株所產生的相應抗體為主要來源，金標探針選用云南大學制備的3H8E3，裝配試紙條時，選取長為100mm、寬為80mm、厚為1mm的白色PVC塑料底板，通過雙面膠先在中間貼上長為100mm、寬為30mm、已固有抗LH的G6單抗的硝酸纖維素膜；再在其上段貼上長為100mm、寬為30mm的吸水紙，如濾油紙等；而在其下段則貼上長為100mm、寬為30mm的玻璃纖維紙，并在此紙的上端與硝酸纖維素膜的下端之間夾上長為100mm、寬為10mm的、已事先加有并已干固有抗H8的金標探針的玻璃纖維素膜；然后在試紙條的上下兩端再分別用不干膠進行封固，之后再將其切成80mm×2mm的試紙條即可。本產品經昆明市醫學院第一附屬醫院、云南省紅十字醫院和云南省第一人民采用該試紙對120例共1200份正常育齡婦女月經中期尿液樣品進行測定，結果表明該LH試紙與臨床驗證符合度達99.2％。試驗方法(1)選取年齡在18-45歲的育齡婦女，但必須是三個月內未采用甾體避孕藥具，六個月未作人工流產，一年內未生育，體檢正常的志愿婦女；(2)參加的每個受試者均要求在測試期間，按其月經周期長短，分別于指定的時間收集每天起床后的第一次小便，即晨尿，其需連續收集10天，每天收集的尿液需立即速凍于冰箱內，稍后再轉至-20℃冰箱內保存待用；(3)選用空白尿液和含有不同LH濃度(10，25，50，100，200mlU/ml)的尿液，不檢測該試紙條在空白、陰性及陽性狀態下顯色情況即從月經過后開始，每天使用一條，將帶有箭頭的試紙條的一端分別插入上述尿液，10秒鐘后取出，5分鐘后觀察結果一直測到有紅色顯示線出現，便預示已進入排卵期；再測到顯示線紅色消失時，并且從這天連續4天測定一直元色帶顯現時，即可停止使用，而從這時到下次月經來前的這段時間便是絕對的“安全期”；待這次月經過后進行下一周期的相同測試。(4)對照選用北京生物技術研究所生產的促黃體生成激素(LH)放免測定試劑盒(批號RH-035-100)進行1200份尿樣的測定，具體測定方法及計算方法依照試劑盒內所符實驗程序進行；(5)實驗結果及統計分析a.在收集得到120例共1200份尿樣品，經婦女“安全期”避孕試紙條測試及LH放免試劑盒測試后，其結果為表1表LH檢測試紙與LH放免檢測試劑盒臨床檢驗結果
<p>通過與LH放免試劑偪橙測結果進行比較，可知b.結果比較表2<
從以上臨床驗證的120例正常育齡婦女月經周期中期尿樣不看，其中經LH放射免疫試劑盒驗證發生正常排卵者共有97例，而屬無排卵周期者則有23例。這120例中，23例無排卵周期者經LH檢測試紙條測屬陰性者共23例，而97例有排卵周期者經LH檢測試紙條測試有陽性者為96例，故用LH檢測試紙條來檢驗LH以預示排卵時，其與臨床的符合率可達99.2％。
權利要求
1.一種安全期避孕試紙的檢測方法，其特征在于利用免疫層析一步法原理，將特異的抗LH單克隆抗體和另一抗LH金標探針分別固定于硝酸纖維素膜的某一相連區帶，利用從月經過后每天浸入該膜的尿液樣品中相應LH抗原可與抗LH金標探針抗體發生特異結合后而被抗LH單克隆抗體識別，即發生三明治式的特異結合，從而通過測定尿液中的黃體生成素LH的含量，即可測定育齡婦女每月中的LH峰值，以準確確定其相應的排卵期，即滯留于此區域的金標探針將顯示相應的紅色，當有紅色顯示線出現時，便預示已進入排卵期，從紅色顯示線消失時當日連續2天測定一直無色帶顯現時，直至到下次月經來前的這段時間便是絕對的“安全期”。
2.一種安全期避孕試紙，它包括底板(7)，其特征在于在底板(7)上固定有帶抗LH單克隆抗體的硝酸纖素膜層(5)，在該膜層(5)的兩端分別固定有一層吸水紙層(6)和玻璃纖維紙層(1)，并在玻璃纖維紙層(1)與硝酸纖維素膜(5)之間夾上帶有抗LH金探針的玻璃纖維素膜層(2)。
3.按權利要求1所述的安全期避孕試紙的檢測方法，其特征在于從月經過后開始使用試紙檢，每天使用一條，一直測到有紅色顯示線出現，便預示進入排卵期；再測到顯示線紅色消失時，并且從這天連續2天測定一直無色帶顯現時，即可停止使用，而從這時到下次月經來前的這段時間便是絕對的“安全期”，即當測得LH(25mIU/ml時，均無色帶顯現，LH＞25mIU/ml時均有色帶顯現，且LH的濃度越高，試紙條上的色帶也就越深。
4.按權利要求1所述的采用家用型LH單抗排卵檢測試紙檢測排卵期的方法，其特征在于硝酸纖維素膜層(5)上設有測試線(3)和控制線(4)。
全文摘要
本發明涉及一種婦女避孕用品及其檢測方法,即一種安全期避孕試紙及其檢測方法。它是將特異的抗LH單克隆抗體和另一抗LH金標探針分別固定于硝酸纖維素膜的某一相連區帶,利用浸入該膜的尿液樣品中相應LH抗原可與抗LH金標抗體發生特異結合后而被抗LH單克隆抗體識別,即發生三明治式的特異結合,而與此同時,滯留于此區域的金標探針將顯示相應的紅色,從而通過測定尿液中的黃體生成素LH的含量,即可測定育齡婦女每月中的LH峰值,以準確確定其相應的排卵期。
文檔編號G01N33/577GK1262439SQ9911466
公開日2000年8月9日 申請日期1999年2月3日 優先權日1999年2月3日
發明者馬嵐 申請人:昆明云大生物技術有限公司