專利名稱：Pcr微陣列探針循環檢測型生物芯片的制作方法
技術領域：
本發明PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片涉及的是一種PCR與探針相結合的檢測型生物芯片的新方案，尤其是采用液體環繞式或往復式流動方式多溫度區域聚合酶鏈反應基因選擇性擴增，結合固相微探針陣列技術進行基因診斷的新型生物芯片。
生物芯片主要是指通過平面微細加工技術及超分子自組裝技術，在固體芯片表面構建的微分析單元和系統。生物芯片可把許多不同功能器件集成在一起，例如，生物樣品的預處理，遺傳物質的提取，特定基因片段的擴增，生物探針陣列以及毛細管電泳形成整體的微流體系統，以實現對化合物、蛋白質、核酸、細胞以及其它生物組分的準確、快速、大信息量的篩選或檢測。基因芯片是最重要的一類生物芯片，它集成了大量的密集排列的基因探針，能夠在短時間內分析大量的基因，使人們可迅速地讀取和分析生命的程序。
生物芯片在生物檢測、醫學檢驗、藥物篩選和基因序列分析上有著極其重要的意義。例如在生物學中，隨著分子生物學的不斷發展，特別是舉世矚目的人類基因組計劃實施以來，有關核酸、蛋白質序列和結構的數據呈指數增長。而下世紀最富挑戰性的工作就是人類基因組計劃完成后，即在后基因時代，我們如何運用大量的生物分子信息服務于人類社會，并使醫學、治療產生根本革命。在醫學中，“系統、器官、組織、細胞層次上的第二階段醫學”正在向“基因水平上的，DNA→RNA→蛋白質→蛋白質與核酸相互作用，以及它們與環境相互作用水平上的第三階段醫學”轉化。這種在分子層次上進行的基因診斷與基因治療，將根本地認識疾病產生的根源，并將有希望根本認識和治療包括癌癥在內的重大疾病。這些生物學、醫學的根本變革，一個根本的前提是基因序列的測定和分析。能否有效快速地進行基因測序與分析，將影響到人類基因組計劃的實施，從而影響生物學、醫學的進一步發展。傳統基因測序所采用的方法包括化學反應、凝膠電泳法等一系列繁雜的步驟，這些方法花費時間較長，且操作繁復，尤其在大規模測序方面費時、并且不適宜便攜化快速測序。在對傳統基因測序方法進行改進的過程中，以基因芯片為代表的生物芯片技術應運而生。生物芯片技術是將生命科學研究中所涉及的許多不連續的分析過程，如樣品制備，化學反應和分析檢測等通過采用微電子，微機械等工藝集成到芯片中，使之連續化，集成化，微型化和自動化。這一技術的成熟和應用將在下世紀的疾病診斷和治療、新藥開發、司法鑒定、食品和環境等生命科學相關領域帶來一場革命，為生物信息的獲取及分析提供強有力的手段。
PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)作為一種選擇性體外基因擴增的方法，由于在經25～35輪循環后就可使DNA擴增106倍，多年來在科研和醫學檢驗中得到廣泛應用。但由于PCR存在假陽性等缺陷，自98年6月起已被國家衛生部禁止用于臨床診斷。究其原因，其一是PCR過程中諸多實驗條件(引物的設計與選擇、材料配比、反應時間、溫度、循環周期等)造成的不穩定因素導致產生PCR的錯誤擴增。其二是，PCR過程的后續電泳檢測方法僅可判斷是不是得到特定長度的片段，而無法確定其具體序列。其三，PCR反應與檢測是兩個分立的過程，操作繁瑣且增加了污染的機會。因此，對于檢測條件和設備有限的中、小醫院，PCR的檢測的準確性受到了很大的影響。此外，當前的PCR擴增過程對于操作人員的技術水平和素質有很高的要求。
生物(基因)芯片近年來一直是國際上的一個研究熱點，并正以驚人的速度向前發展。美國等國際上已有多家公司進入生物芯片領域，研究出把PCR與DNA陣列相集成的生物芯片。這些系統通常在芯片上制備一個PCR微反應池，通過控制微反應的溫度循環，進行基因的擴增。接著將擴增后的基因引入雜交池中，與固相微陣列探針雜交，進行檢測。Affymetrix公司則把PCR微反應池進一步制備成微流體管道。但目前用于科學研究和醫學檢驗的芯片大多是一個或若干個獨立器件。盡管已有將PCR技術與芯片檢測合為一體的報導，但其特點是整個PCR過程在一個微反應池中進行，因而，需要對器件的同一部位反復地升溫降溫，這將無法對PCR結果進行動態跟蹤和實時定量分析。而且由于升溫降溫需要一定的時間，延長了工作時間。
本發明的目的是針對目前PCR技術與芯片檢測存在不足之處提供一種PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片，這是一種控制PCR反應溶液在不同溫度區域進行環繞式或往復式流動擴增的新方案，并將PCR技術與基因微陣列探針技術合為一體，構成一個集成型生物芯片，既可簡化操作步驟，縮短PCR時間，提高效率，又可將反應體系與外界進行嚴密有效隔離，并使PCR擴增一探針雜交檢測過程一體化，將PCR循環中的變性、退火、延伸過程與微陣列探針芯片構成一個整體，可以將變性、退火、延伸和雜交四個步驟的溫度分別控制在恒定溫度，從而可避免反復的升溫降溫過程及由于溫控的誤差帶來的影響。
PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片是采取以下方案實現的PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片是將PCR循環過程與探針雜交檢測設計在一個PCR微陣列探針芯片內，PCR的變性退火、延伸與微陣列探針雜交反應的四個微反應器，構成一個往復式或環繞式循環系統，從而十分方便地跟蹤PCR各次循環的效率，上述PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片循環體系中變性、退火、延伸、雜交各自的溫度是獨立恒溫控制的，在同一芯片上集成多個可用于測量不同樣的PCR微陣列探針型芯片系統。變性、退火、延伸各微反應器可以是各種形式，如微溝槽、微管、微池等。微陣列探針可以是原位合成或通過點樣方法制備的低密度或高密度、單功能或多功能陣列式探針。退火、延伸各個微反應器可以合并成一個。PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片的反應完成后，檢測雜交信號并給出檢測結果。
本發明提出了一種控制PCR反應溶液在不同溫度區域進行環繞或往復式流動擴增的新方案，并將PCR技術與基因微陣列探針技術合為一體，構成一個集成型生物芯片，其中微陣列可以是高密度或低密度的、點樣制備或原位合成的、單功能或多功能的。既可簡化操作步驟，縮短PCR時間，提高效率，又可將反應體系與外界進行嚴密有效的隔離，并使PCR擴增-探針雜交檢測過程芯片一體化，不需進行電泳分析，而是直接檢測雜交信號并給出檢測結果。由于探針雜交具有特異性，因而可以排除電泳法無法排除假陽性的缺陷。更重要的是，將PCR循環中的變性、退火、延伸過程與微陣列探針芯片構成一個整體，可以將變性、退火、延伸和雜交四個步驟的溫度分別控制在恒定溫度，從而可避免反復的升溫降溫過程及由于溫控的誤差帶來的影響。由于采用了環繞式或往復式流動PCR擴增技術與雜交檢測一體化技術，每一組芯片單元的尺寸大大減小，從而可把幾十組或上百組芯片單元集成在一個芯片板上，可同時進行多種生物樣品的檢測。由于本發明將PCR過程與微陣列探針芯片構成一個往復式循環體系，不僅可在多次PCR循環后檢測結果，更可十分方便地跟蹤檢測PCR每一個循環的效率，從而獲得線性的PCR結果，并進行動態定量分析，真正可達到快速、準確、自動化、無污染。
本發明提出的PCR微陣列探針循環檢測型芯片可有多種設計方案，以下將結合附圖對本發明作進一步的說明。


圖1是本發明循環式PCR微陣列探針循環檢測型芯片示意圖。
圖2是本發明往復式流動PCR微陣列探針循環檢測型芯片之一主視圖。
圖3是本發明往復式流動PCR微陣列探針循環檢測型芯片之一左視圖。
圖4是本發明往復式流動PCR微陣列探針循環檢測型芯片之二示意圖。
圖5是本發明往復式流動PCR微陣列探針循環檢測型芯片之三示意圖。
下面舉例說明。
參照附圖，PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片是將PCR循環過程與探針雜交檢測設計在一個PCR微陣列探針芯片內，PCR的變性退火、延伸與微陣列探針雜交反應的四個微反應器，構成一個往復式或環繞式循環系統，從而十分方便地跟蹤PCR各次循環的效率，上述PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片循環體系中變性、退火、延伸、雜交各自的溫度是獨立恒溫控制的，在同一芯片上集成多個可用于測量不同樣的PCR微陣列探針型芯片系統。變性、退火、延伸各微反應器可以是各種形式，如微溝槽、微管、微池等。微陣列探針可以是原位合成或通過點樣方法制備的低密度或高密度、單功能或多功能陣列式探針。退火、延伸各個微反應器可以合并成一個。PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片的反應完成后，檢測雜交信號并給出檢測結果。
參照附圖1，本發明提出的環繞式PCR微陣列探針循環檢測型芯片，PCR過程的變性在T1微流體反應器中進行，退火與延伸在微反應器T2和T3中進行，T4為微陣列探針。微陣列探針可以是原位合成或通過點樣法制備的低密度或高密度、單功能或多功能的陣列式探針。V1和V2為三通閥。上述各元件(T1、T2、T3、T4、V1、V2)構成一個PCR-微陣列探針循環檢測型芯片chip-1，由多個chip-1可組成一個多chip芯片板。成為在同一芯片上集成多個可用于測量不同樣品PCR微陣列探針型芯片系統。
參照附圖2、3，本發明提出的往復式流動PCR微陣列探針檢測型芯片之一。圖2為主視圖，圖3為左視圖，在基片A上開有微溝槽1，2，3，4……n，這些微溝槽兩端分別以-微孔與相鄰微溝槽相通，基片A分為4個溫度區T1、T2、T3、T4。分別對應于PCR過程的變性、退火、延伸及雜交反應的溫度。每個微溝槽在T4區內都有微陣列探針，在基片A的反面開有與上述微溝槽垂直的四個溝槽。變性、退火、延伸、各微反應器可以是各種型式，如微溝槽、微管、微池等其中之一。1，2，3，4……n中都布有兩小塊與相應溝槽吻合又能在其中自由滑動的小鐵塊。這兩小鐵塊表面覆有一疏水有機聚合物薄膜。PCR反應溶液事先注入微溝槽中的兩小鐵塊之間，然后以一透明薄膜覆蓋密封，有微溝槽的基片A及基片A上覆蓋的透明材料構成芯片。使用時，試樣a、b、c、d……n由注射器或其它進樣器穿透薄膜注入PCR反應溶液中，然后以玻片壓緊固定。輕搖混勻后，即可開始PCR反應，首先在T1區進行變性，然后由磁鐵N帶動微溝槽中的小鐵塊連同反應體系溶液迅速移到T2區進行退火，再移到T3區進行延伸；延伸后迅速移到T1區開始第二個循環，或先移到T4區進行雜交反應后再移到T1開始第二個循環。如此繼續循環過程，直到獲得所有結果。
參照附圖4，本發明提出的往復式流動PCR微陣列探針檢測型芯片之二。與附圖2、3設計不同之處在于不是靠磁鐵帶動微溝槽內小鐵塊進而驅動PCR反應液體進行PCR循環，而是由通過控制氣體F1、F2的壓力差驅動PCR溶液1，2……n在微溝槽內往復運動，因此不需磁鐵。其余結構的原理同附圖2、3。
參照附圖5，本發明提出的往復式流動PCR-微陣列探針檢測型芯片之三，與附圖2、3不同之處在于芯片上的微溝槽1，2……n兩端不再分別與溝槽相通，而是另以微溝槽將上述1，2……n每個溝槽兩端獨立聯接起來。這樣既保持PCR體系始終處于一個壓力平衡狀態，便于磁鐵N帶動小鐵塊并驅動PCR反應液體，又彼此完全隔離，互不污染。其余設計同附圖2、3。
實施實例1(線性定量分析)參照附圖1，乙型肝炎病毒的PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片的使用。將由簡單步驟預處理所得DNA模板與PCR反應液由F1導入T1中，在94℃變性45秒，然后迅速流入T2中于45℃退火60秒，然后在T3于72℃延伸2分鐘，再經V1沿路徑1進入T4與微陣列探針雜交，檢測該PCR循環效率。然后經V2由路徑3入T1開始第二個PCR循環。如此，可得到每一個PCR循環的效率，并進行定量分析監控。30次循環后液體經V2由導出口F2導出。檢測雜交信號并給出結果。
實施實例2(不作線性定量分析)參見附圖1，乙型肝炎病毒的PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片的使用。取病人血樣(經預處理后與PCR反應液混和，由F1導入T1中，經下述流程T1(94℃，45秒)→T2(45℃，60秒)→T3(72℃，2分鐘)→V1→通道2→T1，進行30次循環后，將反應液體經V1、通道1導入T4中與微陣列探針雜交，雜交后由導出口F2導出液體，檢測雜交信號并給出結果。
實施實例3(線性定量分析)參見附圖2、3，多功能的多種肝炎病毒的PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片的使用。將一組預處理所得病人血清透過密封膜分別注入附圖2、3中PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片中的微溝槽1，2，3，……n中的兩小鐵塊之間的PCR溶液中，然后用玻璃板壓緊，并用夾子將玻璃板與整個芯片固定在一起，輕搖混勻。通過控制器C5用磁鐵N把樣品移到T1區(94℃)變性45秒，然后迅速移到T2(45℃)區退火60秒，然后移到T3區(72℃)延伸2分鐘，再移到T4區與微陣列探針雜交。檢測PCR循環效率。隨后移到T1區開始第二個PCR循環，如此進行循環30次。可得到每一個PCR循環的效率，并進行定量分析監控。檢測雜交信號并給出結果。
實施實例4(不作線性定量分析)。參見附圖4，高密度的乙型肝炎病毒的PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片檢測單點突變。取病人血樣(經預處理后)，1，2，……n透過薄膜注入圖2中微溝槽1，2……n中的兩個小鐵塊之間的PCR溶液中，用玻璃板壓緊，并用夾子將玻璃板與整個芯片固定在一起，再將芯片嵌入到自行設計的PCR儀中的4個加熱元件上。然后通過控制器以磁鐵N將樣品移到T1區(94℃)變性45秒，再移到T2區(45℃)退火60秒，再移到T3區(72℃)延伸2分鐘，然后迅速移到T1區，開始第二個PCR循環，30次PCR循環后，移到T4區與微陣列探針雜交。檢測雜交信號并給出結果。
實施實例5、6，分別類似于實施實例3、4，但反應液體的移動通過調控微溝槽1，2……n兩端的壓力差來控制(參見附圖4)。
實施實例7、8。操作步驟同實施實例3、4，但改用圖5所示結構的芯片。
附圖中小黑塊
為微鐵塊，陰影
為探針所在區域。
權利要求
1.一種PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片，其特征在于1)將PCR循環過程與探針雜交檢測設計在一個PCR微陣列探針芯片內，2)PCR的變性、退火、延伸與微陣列探針雜交反應的四個微反應器構成一個往復式或環繞式循環系統，從而十分方便地跟蹤PCR各次循環的效率，3)上述的PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片循環體系中變性、退火、延伸、雜交各自的溫度是獨立恒溫控制的，4)在同一芯片上集成多個可用于測量不同樣品的PCR微陣列探針型芯片系統。
2.按照權利要求1的PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片，其特征在于變性、退火、延伸各微反應器可以是微溝槽、微管、微池形式之一。
3.按照權利要求1的PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片，其特征在于所用微陣列探針可以是原位合成或通過點樣方法制備、低密度或高密度、單功能或多功能的陣列式探針。
4.按照權利要求1的PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片，其特征在于退火、延伸二個微反應器可以合并成一個。
全文摘要
本發明PCR微陣列探針循環檢測型生物芯片涉及的是一種PCR微陣列探針雜交檢測型生物芯片的新方案,尤其是采用氣體或液體往復式流動方式多溫度區域聚合酶鏈反應基因選擇性擴增,結合固相微探針陣列技術進行基因診斷的新型生物芯片。其特征在于將PCR循環過程與探針雜交檢測設計在一個PCR微陣列探針芯片內,PCR的變性、退火、延伸與微陣列探針雜交的四個微反應器構成一個往復式或環繞式循環系統,循環體系中變性、退火、延伸、雜交各自的溫度是獨立恒溫控制的。在同一芯片上集成多個PCR微陣列探針型芯片系統。
文檔編號G01N33/53GK1248702SQ9911441
公開日2000年3月29日 申請日期1999年9月3日 優先權日1999年9月3日
發明者何農躍, 陸祖宏, 朱紀軍, 劉全俊, 陳亞利 申請人:何農躍, 陸祖宏, 朱紀軍, 劉全俊, 陳亞利