一種檢測谷胱甘肽的熒光探針及其制備方法與使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測技術領域，具體設及一種作為谷脫甘膚巧光探針材料使用的 蒙酷亞胺-苯亞諷衍生物及其制備方法與使用方法。
【背景技術】
[0002] 谷脫甘膚佑lutathione，GSH)是由谷氨酸、半脫氨酸和甘氨酸組成的S膚分子， 是人體中含量最多的含琉基氨基酸。在生命體內，谷脫甘膚對維持細胞內氧化還原平衡、 外源物質的新陳代謝、細胞內信號轉換和基因調節等起著重要的作用。細胞內谷脫甘膚濃 度的異常將導致一系列生理疾病，例如白細胞缺失、銀屑病、肝損傷、癌癥和艾滋病等（參 見 L. A. Herzenberg, S. C. De Rosa, J. G. Dubs 等，Glutathione deficiency is associated with impaired survival in HIV disease，Proc.Natl. Acad.Sci.USA.,1997,94 ; 1967-1972)。因此，定量、實時地監測生物體內谷脫甘膚的含量一直是生物化學和化學生物 學的研究熱點。
[0003] 巧光檢測法由于其優秀的檢測靈敏度和選擇性，并能實現對生物樣品的實時、在 線檢測而受到研究者的廣泛關注。蒙酷亞胺類巧光分子因其具有良好的光穩定性、高摩爾 消光系數和量子產率等獨特優點而成為該方法最重要的巧光母體之一，在多種待測分子的 巧光檢測中得到了廣泛的應用。
[0004] 目前已開發的用于檢測谷脫甘膚的小分子巧光探針主要基于琉基與2, 4-二硝基 苯橫酷氨基或是2, 4-二硝基苯壞酷醋基之間的特異性化學反應而設計的。當存在谷脫甘 膚的條件下，探針分子中的2, 4-二硝基苯橫酷氨基或是2, 4-二硝基苯壞酷醋基能被谷脫 甘膚中的琉基取代，原2, 4-二硝基苯橫酷氨基或是2, 4-二硝基苯壞酷醋基發生離去而導 致探針分子的巧光性質發生變化，從而實現對谷脫甘膚的特異性設別。
[0005] 然而，已報道的谷脫甘膚探針大多數受到生物體內同樣含有琉基的氨基酸，如；半 脫氨酸（切steine，切S)和高半脫氨酸（Homo巧steine，化y)的干擾（參見J. Bouffard, Y. Kim, T. M. Swager 等，A Highly Selective Fluorescent Probe for Thiol Bioimaging， Org. Lett. , 2008, 10 ;37_40 ;X. -D. Jiang, J.化ang, X.化ao 等，A selective fluorescent 1:u;rn-〇n NIR probe for cysteine, Org. Biomol. Qiem. , 2012, 10 ; 1966-1968)，難 W實現其 在復雜的生物體內進行谷脫甘膚的特異性檢測。因此亟須一種新穎的、具有良好生物穩定 性的且能實現優秀特異性響應的用于生物體內谷脫甘膚檢測的巧光探針。

【發明內容】

[0006] 為了克服現有技術中的上述缺陷，本發明旨在提供一種來自蒙酷亞胺和苯亞諷的 用于檢測谷脫甘膚的巧光探針及其制備方法和使用方法。
[0007] 本發明的核屯、在于利用1，8-蒙酷亞胺構筑經典的ICT體系，并在4-位引入苯亞 諷部分，調控探針分子的ICT效應。當無谷脫甘膚的存在下，由于4-位苯亞諷的強吸電子效 應導致探針分子無巧光發射；而當存在谷脫甘膚的條件下，苯亞諷部分能被谷脫甘膚取代， 進而發生從4-位硫原子（來自谷脫甘膚）到1，8-蒙酷亞胺的分子內電子轉移，而該ICT 效應使得探針分子發射出強巧光。通過上述方案，獲得了高度谷脫甘膚特異性的"關-開" 型的巧光響應，大大提高了檢測的選擇性和靈敏度。
[000引首先，為了達到上述目的，本發明提供了一種如式（I)所示的蒙酷亞胺-苯亞諷衍 生物。
[0009]
【主權項】
1. 一種檢測谷胱甘肽的熒光探針，其特征在于：該探針為式（I)所示化合物，
式⑴中，η為O~18的原子數A1為氫，或甲基，或乙基，或異丙基，或氟；R2為甲基， 或羥基，或羧基，或磺酸基，或（三苯基）磷基，或
中的任何一種。
2. 根據權利要求1所述的一種檢測谷胱甘肽的熒光探針，其特征在于：該探針結構式 如式（II)，
3. 權利要求1所述一種檢測谷胱甘肽的熒光探針的制備方法，其特征在于，該方法包 括下列步驟： 步驟一：在惰性氣氛下，式（III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐與氨基化合物在醇中反 應得到式（IV)所示取代的4-溴-1，8-萘酰亞胺；
式（IV)中，η為O~18的原子數，R2為甲基，或羥基，或羧基，或磺酸基，或（三苯基） 磷基，或
中的任何一種； 步驟二：在惰性氣氛下，在堿存在下，式（IV)所示化合物與式（V)所示化合物在醇中反 應得到式（VI)所示取代的4-苯硫酚基-1，8-萘酰亞胺；
式（VI)中，η為O~18的原子數況為氫，或甲基，或乙基，或異丙基，或氟；R2為甲基， 或羥基，或羧基，或磺酸基，或（三苯基）磷基，或
中的任何一種； 步驟三：在惰性氣氛下，式（VI)所示化合物與間氯過氧苯甲酸在有機溶劑中反應即得 式（I)所示化合物。
4. 根據權利要求3所述的一種檢測谷胱甘肽的熒光探針的制備方法，其特征在于： 步驟一中所述氨基化合物具體為正丁胺；式（III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述 氨基化合物的摩爾比為1~50:1，；所述醇為甲醇、乙醇，正丙醇、異丙醇、正丁醇或乙二醇 單甲醚；所述反應溫度為50~120度，反應時間為1~20小時； 步驟二中所述醇為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇單甲醚或二乙二醇單甲醚；式（IV) 所示4-溴-1，8-萘酰亞胺和式（V)所示苯硫酚化合物的摩爾比為1~10:1 ;所述堿為有 機堿或無機堿；所述有機堿為三乙胺、吡啶或二異丙基乙基胺中；所述無機堿為碳酸鉀、碳 酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀；反應溫度為〇~140度；反應時間為1~ 48小時； 步驟⑶中所述間氯過氧苯甲酸與式（VI)所示取代的4-苯硫酚基-1，8-萘酰亞胺的 摩爾比為0. 5~1. 5:1 ;所述有機溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙腈、DMF、DMSO或1，2-二氯乙烷； 反應溫度為〇~100度；反應時間為1~24小時。
5. 根據權利要求3或4所述的一種檢測谷胱甘肽的熒光探針的制備方法，其特征在 于： 步驟一中，式（III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩爾比為10 :1 ; 所述醇為乙醇；所述反應溫度為80度；反應時間為5小時； 步驟二中所述醇乙二醇單甲醚；式（IV)所示4-溴-1，8-萘酰亞胺和式（V)所示苯硫 酚化合物的摩爾比為5 :1 ;反應溫度為為100度；反應時間24小時； 步驟三中，間氯過氧苯甲酸與式（VI)所示取代的4-苯硫酚基-1，8-萘酰亞胺的摩爾 比1 :1 ;所述有機溶劑為二氯甲烷；反應溫度為25度；反應時間為5小時。
6. -種檢測谷胱甘肽的熒光探針的使用方法；其特征在于，該方法具體包括以下步 驟： 步驟1 :向不同濃度谷胱甘肽的緩沖溶液中加入相同濃度的式（I)所示化合物，配置至 少3種不同谷胱甘肽含量的含有式（I)所示化合物的標準溶液； 所示緩沖溶液以是磷酸鹽緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液、HEPES緩沖溶液、硼酸-硼酸 鈉緩沖溶液中的任何一種， 所示標準溶液的pH值為6~11，具體以是7. 2 ; 所示標準溶液中式（I)所示化合物的濃度為InM~10 μΜ ; 所示標準溶液中谷胱甘肽的含量為〇. InM~ImM ; 步驟2 :分別測定所述標準溶液的熒光發射光譜，激發波長為366nm，以谷胱甘肽濃度 為橫坐標，以I482為縱坐標，建立標準曲線； I482表示所述標準溶液在波長為482nm處的熒光發射峰強度值； 步驟3 :向待測樣品中加入式（I)所示化合物，控制其濃度與所述標準溶液中式（I)所 示化合物的濃度相等；測定其在激發波長為366nm的激發光下的熒光發射譜，即根據標準 曲線計算得出待測樣品的谷胱甘肽含量； 上述步驟：2或步驟3中熒光強度在熒光儀上進行檢測。
7. 根據權利要求6所述的一種檢測谷胱甘肽的熒光探針的使用方法；其特征在于：步 驟1中的緩沖溶液是磷酸鹽緩沖溶液。
【專利摘要】本發明公開了一種檢測谷胱甘肽的熒光探針及其制備方法與使用方法。本發明利用1,8-萘酰亞胺構筑經典的ICT體系，并在4-位引入苯亞砜部分，調控探針分子的ICT效應。當無谷胱甘肽的存在下，由于4-位苯亞砜的強吸電子效應導致探針分子無熒光發射；而當存在谷胱甘肽的條件下，苯亞砜部分能被谷胱甘肽取代，進而發生從4-位硫原子（來自谷胱甘肽）到1,8-萘酰亞胺的分子內電子轉移，而該ICT效應使得探針分子發射出強熒光。本發明能夠實現對細胞內谷胱甘肽的檢測，具有操作簡便，成本低廉，響應靈敏，易于推廣和應用等優點。
【IPC分類】C07D221-14, G01N21-64, C09K11-06
【公開號】CN104673278
【申請號】CN201510083494
【發明人】韓益豐, 楊成玉
【申請人】浙江理工大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月15日