專利名稱：酵母濃度(生物量濃度)的檢測方法和儀器的制作方法
技術領域：
本發明提出了對酵母濃度(生物量濃度)進行在線實時檢測的新方法并制造出了基于這種方法的儀器。本發明基于Maxwell-Wagner效應，即微生物的存在會影響或改變發酵液的電容率這一客觀事實。儀器用參照電極技術克服了發酵條件變化對測量結果的影響；電極(傳感器)直接插入發酵物中且能承受高溫蒸汽滅菌條件。本儀器的優點是不用取樣就能對發酵器中的酵母濃度進行連續的測量，而且測得的是活的酵母數。本儀器既可單獨使用，也可以與其他部件結合組成反饋控制系統。本儀器在生化制藥，食品發酵，啤酒釀造，污水檢測處理等工業領域里有很好的推廣應用前景。
近年來，現代高新生物技術有了飛速的發展，人們有目的的去培育新的菌種，以生產新的對人類有用的物質，例如抗生素，氧基酸，維生素和具有生物活性的蛋白質等。制藥(如青霉素，鏈霉素等)，釀酒(如葡萄酒，啤酒等)都要經過發酵過程。影響發酵過程的因素很多，如發酵液的成分和濃度，溶解氧含量，溫度，PH值，攪拌速度，酵母的種類，活性和濃度等等。在上述因素中，酵母濃度是最重要的工藝參數，因為在一定條件下，發酵的得率與酵母濃度密切相關[1]。因此酵母濃度的實時在線檢測，對了解和控制發酵進程，提高產品的質量具有重要的意義。但是直到現在人們還沒有研制出符合要求的儀器，這種儀器應能對生物量進行準確的在線實時檢測，而不改變或破壞原微生物系統的工作狀態。我們這里所說的實時檢測，意思是儀器的讀數應該是此時此刻的生物量濃度，而不是幾十分鐘或幾個小時之前的數值。
通過微生物的繁殖生長過程，在生物反應器中生產有用物質的過程，與在化學反應釜中通過催化作用生產化學物質的過程有很大的不同。因為在生物反應器中酵母的數目每時每刻都在發生變化。生物量濃度的檢測對任何發酵過程都是非常重要的[2]，也是科學家和工程師們非常感興趣的研究課題。但是直到今天，人們還沒有研制出滿足工業現場要求的測量儀器[3]。
生物量的傳統測量方法是高線的，主要有干重法，光密度法和亞甲基藍染色法等。
目前人們把干重法看成是一種參照方法，因為用其他方法測得的生物量一般都要與干重法測得的數值相對照。但是Jens Nielsen教授認為，把干重法作為參照方法(或基準方法)是不適宜的[3]。因為干重法是基于地球引力(重力)的方法，它有很多缺點。首先，工業發酵物中一般含有多種顆粒狀的有機物和無機物，他們跟微生物混在一起，很難把它與微生物分開。其次，活的酵母和死的酵母對測量結果都有貢獻，而我們希望得到活酵母的數目，因為只有活的酵母具有繁殖能力。雖然干重法有這些缺點，但由于找不到其他好的參照方法，所以目前人們把干重法作為參照方法。用本發明提出的方法測得的結果也與用干重法測得的結果作了對比。但是必須指出用本發明的方法和其他方法所得的結果有時更準確的表征了酵母濃度，盡管這些結果與干重法的數值有較大差異，特別是在批量發酵過程中更是如此[3]光密度法(Optical Density，即O D)是又一種參照方法。當用一定波長的光線照射發酵液時，酵母和顆粒狀懸浮物對光有反射和散射作用。反射光和散色光與生物量之間有一定的對應關系，根據這個原理可以制成生物量檢測儀。但此類儀器的讀數易受發酵流的顏色，濁度，顆粒狀懸浮物的影響，也不能排除死酵母的影響，這類儀器難以用來測量淤泥狀發酵物。此外還有基于熒光原理的儀器，此類儀器不能用來測量盤尼西林等發酵物，因為盤尼西林是熒光攜帶者[3]。
為了檢測活酵母的數目和酵母的活性，人們通常用細胞計數器或用亞甲基藍染色，然后用顯微鏡觀察計數[4]。但這種方法要做多次稀釋，會產生很大的誤差。用這種方法得到的不是此時此刻的生物量，而是幾十分鐘或幾個小時之前的數值。而有些菌體繁殖很快，在一個小時內會增加一倍以上。對于桿狀細菌或絲狀細菌，有時他們會纏在一起。在這種情況下，光密度法和亞甲基藍染色法就顯得無能為力。
當超聲波通過發酵液時，基幅度被衰減，其傳播速度會有所改變，據此原理可制成生物量測量儀。但此類儀器易受發酵液成分變化，汽泡，溫度變化，粘稠度的影響[5]。
酵母的存在會影響發酵液的電特征，有些學者試圖通過阻抗(或導納)測量法測量生物量濃度和研究酵母生理狀態的變化[6]。雖然人們作了很多工作，但此法的研究還遠遠沒有達到能做實際應用的程度。因為即便在實驗室條件下，發酵液的阻抗也會出現復雜的變化。我們發現當發酵液的成分發生較大變化時，特別是發酵液中離子的濃度發生較大變化時，阻抗測量法的準確度是很差的[7]。
上述方法都是高線測量法，都要從發酵罐中抽取樣品，在取樣過程中極易帶進雜菌而使實驗半途而廢。采用高線方法的另一個缺點是，人們不能用這種方法來對發酵過程進行自動控制。
綜上所述，Jens Nielsen，B.H.Junker等世界知名學者認為，直到現在人們還沒有制造出滿足要求的在線檢測儀器，該儀器能對發酵過程中的生物量濃度進行準確的實時測量[3]。
本發明的目的是提出一種新方法，制造一種新儀器，用該儀器能對生物量濃度進行在線實時測量和控制，而不改變或破壞生物反應器的工作狀態。
本發明提出的方法和制作的儀器，主要用于對發酵液中的酵母濃度進行在線實時測量。本儀器可以單獨使用，也能與其他部件一起組成反饋控制系統，對發酵過程進行自動控制。
本發明的理論依據是Maxwell-Wagner效應(或稱為Maxwell-Wagner分布)，即發酵液的電容率對于酵母濃度和測量頻率的依賴性。
微生物的存在會影響發酵液的電特性，這個現象上個世紀末人們就認識到了[8]。本世紀初Fricke通過測量紅血細胞在聲頻和無線電頻率下的介電特性，算出了細胞膜的厚度為分子數量級[9]，而Clarke及其同事實現了一種裝置，該裝置通過測量含微生物溶液的導磁性來確定發酵液中的生物量濃度[10]。
從電學的角度來說，一切物質(包括發酵液)的電特性都可以用電導率和電容率來表征。發酵液的電導率可定義為其傳導電荷的能力；而發酵液的電容率可定義為其儲存電荷的能力。
設酵母的形狀是球形的，用r表示酵母的平均半徑(單位為m)；Cm為細胞膜單位面積的電容(單位為F/m2)；ε0是真空中的電容率(單位為F/m)，其值大約等于8.85×10-12F/m)；P是體積系數，它是所有酵母菌的體積與發酵液體積的比，P是一個遠遠小于1的數，無量綱；ε∞是發酵液在很高頻率下(相對于測量頻率而言)的相對電容率(無量綱)；εf是發酵液在測量頻率下的相對電容率(無量綱)。則在一定測量頻率范圍內(o＜f＜f∞)，發酵液的相對電容率可表示為εf＝9prcm/4ε0+ε∞(1)水的相對電容率在60到85之間，其典型值是78。隨著溫度和電導率的不同，εf會有所變化。如果測量電壓比較低，水的電容率幾乎與測量信號頻率無關。如果把水放入發酵器中，其電容率受其中溶解的氣體和非細胞物質的影響較小，當測量含有酵母的發酵液的電容率以確定生物量時，水的電容率可作為參照信號。
圖1畫出了放了啤酒酵母的麥芽汁在100KHz～10MHz頻率范圍內電容率的分布曲線。從圖中可以明顯地看出a。對于酵母濃度一定的麥芽汁，當測量頻率由低到高逐漸增加時，電容率逐漸減小，最后趨向于純麥芽汁(基質)的值。我們說發酵液的電容率具有頻率依賴性，即電容率是頻率的函數；b。如果測量信號頻率不變，發酵液中酵母的數目越多，測得的電容率越大，這就是說發酵液的電容率具有酵母濃度的依賴性或電容率是酵母濃度的函數。如果同時考慮測量頻率和酵母濃度兩個變量，則發酵液的電容率是這兩個變量的二元函數εf＝F(f，D)(2)式中f是測量信號頻率，D是酵母濃度。
當培養基中加入酵母后，其電容率會顯著增加。當測量頻率由高到低變化時，發酵液的電容率會在培養基電容率的基礎上逐漸增加(培養基的電容率可作為參照信號或基準信號)我們把電容率隨測量頻率變化而變化的現象叫作電容率分布，電容率的頻率特性或電容率頻譜。發酵液的電容率分布可劃分為三個主要區域α-分布，β-分布和γ-分布。α-分布發生在音頻范圍內，主要是由于帶電離子在細胞膜表面作切向運動引起的。β-分布又稱為Maxwell-Wagner效應或Maxwell-Wagner分布[11]。β-分布發生在無線電頻率范圍內，主要是由于活的酵母細胞具有粒子不能透過的細胞膜引起的。γ-分布發生在比β-分布更高的頻率范圍內(甚高頻或射頻)，它主要是由于偶極子(例如水偶極子)的旋轉引起的。γ-分布不是活的微生物細胞特征的表現形式。
Maxwell-Wagner-分布，即β-分布是本發明的理論基礎，因為β-分布是具有完整細胞膜的微生物細胞特征的表現形式[12]。關于Maxwell-Wagner分布產生的機理，一般解釋為活的微生物細胞都具有完整的細胞膜，完整的細胞膜是良好的絕緣體。在一般情況下，細胞內的帶電離子很難穿過細胞膜到達細胞的外部；細胞外的帶電離子也很難滲透到細胞的內部。如果將發酵液置于電場內，在細胞膜的內，外表面上會有大小相等，符號相反的電荷堆積，每個細胞很像一個小電容器。在一定條件下，單位體積內的酵母細胞所束縛的正電荷(或負電荷)的數量與酵母數目成正比。酵母濃度越大，它們所束縛的電荷越多，發酵液的電容率越大，這就意味著我們可以通過測量發酵液的電容率來測量生物量濃度。由于細胞膜很薄，它所呈現出的細胞膜電容是很大的，單位面積上的細胞膜電容Cm一般在0.6μF/cm2～1。0μF/cm2之間。
發酵液的電容率和電導率是兩個獨立的參數，但要把它們準確地測量出來并非易事，特別是當發酵液的電容率比較高的時候更是如此。即便在高頻情況下，電極上也會存在極化電壓，電極和引線會引入分布電阻和電容[13]。發酵液成份的變化，溫度的變化等都可能引起電容率的改變。
一般說來，物質(特別是發酵液)的電容率和電導率不能直接測得，但是我們可以通過測量電容的方法來確定兩電極間發酵物的電容率。如果在發酵液中放置一對電極(實際上構成了一個電容器)，設電極的表面積為A，距離為d，則發酵液的電容率εf，電極電容C之間有如下關系εf＝dC/Aε0(3)或 εf＝KC(K＝d/Aε0)(4)上面的式子中，d/A定義為電極常數，其單位為cm-1。電極常數與電極的形狀和電極結構有關。
設有酵母時發酵液的電容率為εf1，無酵母時發酵液的電容率為εf2，則由于酵母的存在引起的電容率的變化量Δεf為Δεf＝εf1-εf2＝d(C1-C2)/Aε0＝K(C1-C2)(5)在本發明中，Δεf，即電容率的增量經過標定后，用來指示酵母濃度。上式中，C1為發酵液中存在酵母時兩電極間的電容值；C2為發酵液中不存在酵母時兩電極間的電容值。
但是在被測物質是發酵液的情況下，我們甚至不能用普通的方法和儀器來測得發酵液的電容。
設有兩個平行電極，其表面積為A，距離為d，如果把這個電極插入發酵液中，兩電極間發酵液的電特性可用一個復數導納Y來描述。設加在兩電極的電壓為V，流過電極的電流為I，則復數導納Y定義為Y＝I/V-＝G+jωc (6)G＝I/V.cos (7)ωc＝I/V.sin(8)c＝I/ωV.sin(9)為I，V之間的夾角。如果ω已知，測得了I，V，的值，就可以按照(9)式計算出C，進而計算出εfεf＝dC/Aε0＝dIsin/Aε0Vω＝K Isin/V (K＝d/Aε0ω)(10)


圖1.以酵母濃度為參變量，麥芽汁的電容率隨測量頻率的變化曲線(麥芽汁的Maxwell-Wagner分布)。
圖2.電極(傳感器)結構圖。(a)A形電極-雙四電極電極；(b)B形電極-單四電極電極。
圖3.本發明儀器的電原理圖。
圖4.用本發明的儀器檢測Saccharomyces Cerevisiae DGI342的生長全過程圖中■用光密度法的測量結果(離線測量)。◆用干重法測得的結果(離線測量)。△用本發明的儀器測得的結果(在線測量)。
圖5.光密度法和電容率法測量結果的對比。
本發明的內容及實現本發明的最好方式1.本發明的內容本發明以Maxwell-Wagner效應為依據，通過測量發酵液在無線電頻率下的電容率分布實現了酵母濃度的實時在線檢測。本發明使用參照電極技術，克服了發酵液成份變化，離子種類和濃度變化對測量結果的影響。為了克服電極極化對測量結果的影響，本發明采用了四電極技術。本發明的電極直接插入發酵罐中，電極能用高溫蒸汽滅菌；電極壽命長且不感染發酵物。本發明不需要采樣就能對發酵液中的酵母濃度進行連續地測量，避免了采樣可能對發酵液造成的感染。用本發明測得的是活的酵母數。本發明不但能用來測量酵母菌，還能用來測量細菌，植物細胞和動物細胞，也適用于測量桿狀細菌和絲狀細菌。本發明的測量范圍寬。本發明不但可用來測量酵母濃度的變化，還可用來研究酵母生理狀態的變化。
2.下面我們將結合附圖，說明實現本發明的最好方式和采用的有關技術。整個儀器可劃分為電極(傳感器)和主機兩部分，下面分別加以說明。
(1)電極(傳感器)描述前已述及，發酵液中加入酵母后其電容率會有所增加，但要想把由于酵母的存在所引起的電容率的增加量準確地測量出來是很困難的，因為有很多因素會影響發酵液的電容率。發酵液電容率的變化可歸結為以下原因a.發酵液成分(例如葡萄糖濃度，酒精濃度，溶解氧濃度等)的改變。b.由于微生物的新陳代謝作用，pH值調節所引起的離子種類和濃度的變化。C.溫度，攪拌速度等的變化。D.酵母濃度的變化。在一般情況下，由于溫度傳感器，速度傳感器技術比較成熟，所以對于多數發酵設備，溫度和攪拌速度都實現了自動控制。再者，即便這兩個參數對測量結果有影響，也可以進行補償或較正，因為溫度和攪拌速度對測量結果的影響有一定的規律。經驗說明這兩個量對測量結果的影響較小。我們主要來考慮a，b兩個因素。
在有些情況下，由發酵液成分和離子濃度的改變所引起的電容率的變化比由于酵母數目的增加所引起的發酵液電容率的變化還要大，特別是當酵母濃度較低而發酵液的電導率又比較高的時候更是如此。
用Maxwell-Wagner-分布測量生物量濃度的關鍵，是同時測量有酵母的發酵液的電容率和無酵母的發酵液的電容率并加以對比。因為這樣可得到僅由酵母濃度變化所導致的電容率增量Δεf。
為體現上述指導思想，本發明設計制作了兩種型號的電極(傳感器)A型電極-雙四電極電極和B型電極-單四電極電極，如圖2所示。下面分別加以介紹。
I.A型電極(雙四電極電極)A型電極的結構如圖2(a)所示。該電極由上，下兩個電極組成，每一個電極都是一個四電極電極。上面的電極稱為參照電極，它由工業白金和耐高溫的工程塑料制成。四個小電極排成一列。中間的兩個小電極叫電壓電極，兩邊的兩個叫電流電極。參照電極封在過濾罩內。過濾罩用過濾薄膜制作(其小孔直徑在0.2μm-10μm之間選擇，視被測量的微生物的大小而定)。水.葡萄糖.離子等可以穿過過濾罩，但酵母等卻不能進入過濾罩內。為了提高罩內，外介質的交換速度，參照電極上方留有小細管，將蠕動泵與此小細管連接，可加速罩內，外介質的循環。參照電極為我們提供了一個“自適應的參照信號”，該信號跟蹤發酵液成分的變化。當主機電路與參照電極相連接時，儀器得到的是無酵母的介質的電容率。
下電極叫“信號電極”，它也是一個四電極電極并與參照電極有相同的結構，但在他周圍沒有過濾罩，它的四個電極直接與含有酵母的發酵液接觸。當此電極與主機電路相連時，儀器得到的是含有酵母的發酵液的電容率。
參照電極和信號電極是在微處理器的控制下，輪流地接到主機上去的。電極通過電纜線與主機電路相連。電極直接插入發酵罐中并可以在現場與介質一起蒸汽滅菌，電極對發酵物無污染和感染作用。
II.B型電極(單四電極電極)B型電極的結構如圖2(b)所示。電極由工業白金和耐高溫的工程塑料制造。它有四個小電極，這四個小電極排成一行，中間的兩個叫電壓電極，兩邊的兩個叫電流電極。B型電極沒有過濾罩，四個小電極直接與發酵液接觸。
有些發酵液(例如麥芽汁等)的電導率較低，發酵又比較緩慢。在這種情況下發酵液的電導率和發酵液成分的變化對電容率影響較小，在此情況下可以使用B型電極，這樣既降低了成本，又有足夠的精度。當用B型電極時，儀器把接種前培養基的電容率作為參照信號去計算Δεf。
(2).主機電路介紹實現上述設計意圖的裝置如圖3所示。圖中3是正弦波產生器，4是隔離變壓器，5是模擬電子開關。由信號產生器產生的正弦波電壓，通過隔離變壓器和模擬開關加到電流電極A.D(或A′，D′)上。圖中的IC1.IC2是兩個具有高輸入阻抗，高共模抑制比的集成運算放大器。電壓電極B，C(或B′，C′)兩端電壓通過模擬開關5加到集成運放IC1上。IC1的輸出給出了兩電壓電極B，C(或B′，C′)上瞬時電壓的數值。圖中的IC3，IC4是兩個運算放大器。IC1的輸出經過IC3進一步放大后加到檢測器IC5。IC5的輸出給出了兩電壓電極B，C(或B′，C′)間電壓幅值的大小V。
流過發酵液的電流通過電阻R取出，這個信號被送到集成運算放大器IC2的輸入端。IC2的輸出給出了流過發酵液的瞬時電流的數值。IC2的輸出經過IC4作進一步放大后加到檢測器IC6的輸入端。IC6的輸出給出了流過發酵液的電流的大小I。
圖中的IC7是相位檢測電路，IC3，IC4的輸出送到IC7的輸入端。IC7的輸出給出了電流信號和電壓信號之間相位差。
圖中6是模擬開關，IC8是采樣保持電路，IC10是微型計算機。在計算機的控制下模擬開關將IC5，IC6，IC7的輸出周期地送到采樣保持電路IC8。A/D轉換器IC9將采樣保持電路IC8送來的模擬信號變成數字信號，此信號被送到微型計算機IC10。根據采集到的I，V，的值，微型計算機計算出發酵液的電容率。
參照電極和信號電極是輪流地接到主機電路上去的。當參照電極與主機電路相連結時，計算機給出不含酵母的發酵液的電容率εf1；當信號電極與主機電路相連時，計算機算出含有酵母的發酵液的電容率εf2，Δεf＝(εf1-εf2)是僅由酵母存在而引起的電容率的變化量。在本發明中，Δεf經過標定后用來指示酵母濃度。
如前所述，當發酵液的電導率較低且發酵過程比較緩慢時，可以使用B型電極(單四電極電極)，這時儀器把接種前培養基的電容率作為參照信號。
圖3中9是顯示器，10是打印機。計算機將測得的酵母濃度送到顯示器顯示或打印機打印。
與現有技術相比，本發明的方法和儀器具有如下優點1.本發明在Maxwell-Wagner效應的基礎上，通過測量發酵液在無線電頻率下的電容率分布實現了生物量濃度的在線實時測量。儀器給出的是此時此刻的酵母濃度而不是幾十分鐘或幾個小時之前的數值，而用干重法，光密度法等離線方法測得的是過去某個時刻的數值。
2.本發明使用了參照電極技術，克服了發酵條件變化(特別是發酵液成分變化)對測量結果的影響，提高了儀器的精度。
3.本發明制作的電極直接插入發酵罐中，電極滿足高溫蒸汽滅菌條件。電極的壽命長，對發酵液無感染和污染。
4.與離線法不同，本發明不需要采樣就能對發酵液中的生物量進行測量，從而避免了采樣過程可能對發酵罐造成的感染。
5.本發明測得的是活的菌體數。不但能用來測量酵母菌，還能用來測量植物細胞和動物細胞(如血細胞)；不但能用來測量園形或橢圓形細菌，還能用來測量桿狀細菌和絲狀細菌。
6.本儀器的測量范圍大，最高可達200mg/ml干重。
7.本儀器不但能測量生物量的變化，還能用來研究酵母生理狀態的變化。
8.本裝置既可單獨使用，也可以與其他部件一起組成反饋控制系統，實現對發酵過程的自動控制。
因此我們相信，本發明提出的方法和制作的儀器在科學研究和工業發酵領域里會有廣泛的應用，具有良好的推廣應用前景。
應用實例用本發明的方法和儀器，跟蹤測量Saccharomyces Cerevisiae DGI 342 CBS介質中的生長過程。
1.實驗場所丹麥技術大學工業微生物研究中心(Center for Process Biotechnology，Technical Universityof Denmark，Building 223，DK-2800 Lyngby，Denmark)。
2.實驗所用材料(1)實驗所用菌株為Saccharomyces Cerevisiae DGI 342。酵母取自該實驗中心的菌種儲藏庫。原始酵母在標準的CBS介質[14]中在28℃的條件下培養20小時，然后在2500rpm下離心10分鐘，分離出來的酵母放入新的CBS介質中，用滅過菌的蒸餾水進行酵母濃度調節。(2)實驗所用介質為CBS介質[14]。它主要由Saline Solution，trace metal solution，antifoam，glucose等組成。
3.實驗方法(1)在接種前，電極和介質在122℃的蒸汽中滅菌40分鐘。滅菌后介質的pH值調至5.0。為了避免glucose和ammonium發生Maillard反應，glucose是單獨滅菌的。滅菌后冷卻至40℃再把它加入CBS介質。維生素是經過過濾除菌后加入的。
(2)發酵條件批量發酵是在標準的5L發酵器內進行的，內盛4L介質.攪拌速度為700rpm，通氣量為2L/分.發酵溫度控制在30℃；通過加入NaOH或H2SO4，發酵液的pH值自動地控制在5.0左右。
(3)酵母濃度的離線測量a.干重的測量(Dry cell weight)。將樣品用0.45μ的過濾紙過濾，用蒸餾水沖洗，然后放入微波爐中干燥20分鐘，再放入干燥器中干燥20分鐘，在電子天平上稱量，連做三次，取平均值(14)。b.光密度的測量(Optical Density)測量用日本產的帶微電腦的光密度計，將樣品作適當稀釋，確保讀數小于0.3，測量波長為525nm。
(4)酵母濃度的在線測量用本發明的儀器，當發酵液的溫度穩定在30℃，儀器上電40分鐘后將儀器調零，將酵母接種到發酵器中，初始酵母濃度為0.1mg/ml，大約相當于106個酵母/毫升。
4.實驗結果及討論圖4畫出了Saccharomyces Cerevisiae DGI 342在CBS介質中的生長曲線。圖中，■用光密度法測得的結果；◆用干重法測得的結果；▲用本發明的方法測得的結果。圖中曲線具有典型的酵母生長曲線的特征它具有滯后期，指數生長期和平衡期三個階段。用本發明的儀器對酵母濃度進行在線測量，所得結果與用離線方法測得結果是比較接近的。
從圖中可以看出，發酵進行大約52小時后進入平衡期，在此階段內用本發明測得的結果要比用干重法和光密度法所得的結果低一些。這一現象與我們所說的“用本方法測得的是活的酵母濃度”相吻合，這是本儀器的一個優點。這一現象的出現與酵母生理狀態密切相關。在平衡期由于營養物的缺乏，酵母繁殖變得緩慢，有些細胞開始衰老或死亡，致使其體積收縮，細胞膜的絕緣程度下降或喪失，導致了所束縛的電荷的減少。所以本儀器可用來研究酵母生理狀態的變化。
5.結論我們用相同的介質，相同類型的酵母，相同的發酵罐和發酵條件進行了多次實驗，所得的生長曲線基本相同，表明測量結果的再現性很好。我們在丹麥嘉士博啤酒研究所用啤酒酵母和麥芽汁做實驗，也得到了良好的結果。一個理想的酵母濃度在線實時檢測裝置應滿足以下基本要求[3](1)能對酵母濃度進行在線實時檢測，即儀器測得的是此時此刻的生物量濃度而不是過去某一時刻的數值，傳感器直接插入發酵物中而不需要采樣。
(2)長時間工作的穩定性和可靠性(在中間實驗廠，要求能連續可靠地運行20天以上)。
(3)傳感器可在工作現場高溫滅菌，傳感器不感染和污染發酵物。
(4)讀數受顆粒狀懸浮物和死酵母的影響要小。
(5)發酵條件發生變化時(如發酵液成分，pH值，溶解氧濃度，溫度，攪拌速度，通氣量等發生變化時)儀器的讀數基本上不受影響。
本發明提出的方法和儀器滿足了以上要求，傳感器直接插入發酵液中并滿足蒸氣滅菌條件；傳感器不感染發酵液；當介質成分，pH值，溶解氧濃度，溫度等發生變化時，儀器的讀數變化很小。因此我們相信，本發明在科學研究和工業發酵領域里會有廣泛應用，本儀器的使用定會產生很好的經濟效益和社會效益。
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權利要求
1.本發明以Maxwell-Wagner效應為基礎，通過測量發酵液在無線電頻率下的電容率分布，實現了酵母濃度的在線實時檢測。本發明使用參照電極技術，克服了發酵液成分變化。離子種類和濃度改變對測量結果的影響。為了消除電極極化對測量結果的影響，本發明采用了四電極技術。本發明的電極直接插入發酵罐中，電極能夠用高溫蒸汽滅菌，電極壽命長且不感染和污染發酵物。本發明不經采樣就能對發酵液中的酵母濃度進行連續的測量，避免了采樣可能對發酵物造成的感染。本發明測得的是活酵母數。本發明不但可用來測量酵母菌，還可用來測量細菌。植物細胞和動物細胞(如血細胞)，也適用于測量桿狀細菌和絲狀細菌。用本發明不但能測量酵母濃度的變化，還可用來研究酵母生理狀態的變化。本儀器既可以單獨使用，也可以與其他部件一起構成反饋控制系統，實現對發酵過程的自動控制。本發明所提出的以Maxwell-Wagner效應為基礎，通過測量發酵液在無線電頻率范圍內(100KHZ-10MHZ)，發酵液的電容率(即介電系數)的變化來測量生物量濃度(包括酵母濃度。細菌濃度。植物細胞和動物細胞濃度)的方法。通過在發酵液中放置一對電極，然后測量這對電極間的電容來確定電容率的方法。通過測量流過電極的電流I，兩電極間的電壓V以及I、V間相位差來計算C的方法。
2.本發明所完成的，能夠實現用電容率測量法測量生物量濃度的儀器，儀器的原理，設計和結構。
3.為了克服發酵液成分變化對測量結果的影響，本發明設計制作了A型電極，即雙四電極電極。A型電極由上，下兩個電極組成。上電極被封在由酵母不能透過的過濾膜做成的小室內，作為參照電極。參照電極提供了自適應的參照信號。下電極周圍沒有過濾罩，叫做信號電極。A型電極的結構，形狀，材料，制作技術及方法。用蠕動泵提高參照電極過濾罩內，外介質交換速度的方法。
4.B型電極(單四電極電極)的形狀，結構，材料及設計制作方法。
5.為了克服電極極化對測量結果的影響，本發明設計了四電極電極。四電極電極的結構.形狀.材料及制作技術。
6.主機電路采用的如下技術通過模擬開關和隔離變壓器把交流信號加到電流電極上的方法和電路；產生正弦波的方法和電路；將電壓電極上的電壓取出并加以放大的方法和電路；將流過電極的電流取出并加以放大的方法和電路。
7.主機電路使用的如下技術電壓電極上電壓幅度的檢測方法和電路；電流電極中電流幅度的檢測方法和電路。電流，電壓間相位差的檢測方法和電路。
8.主機電路采用的如下技術；在計算機的控制下，將參照電極和信號電極通過模擬開關輪流地接到主機電路上去的方法和電路。
全文摘要
本發明以Maxwell-Wagner效應為基礎,通過測量發酵液在無線電頻率范圍內的電容率分布,實現了對酵母濃度的在線實時檢測。儀器用參照電極技術克服了發酵條件變化對測量結果的影響。電極直接插入發酵液中并能用蒸汽滅菌,電極壽命長且不感染和污染發酵物。儀器測得的是活酵母的濃度。本儀器既可單獨使用,也能與其他部件組成反饋控制系統,實現對發酵過程的自動控制。
文檔編號G01N27/22GK1260486SQ9911208
公開日2000年7月19日 申請日期1999年2月23日 優先權日1999年2月23日
發明者王勁松, 王貽俊 申請人:王勁松