專利名稱：中國庚型肝炎病毒c基因序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中國庚型肝炎病毒C基因序列及應用。
HCV及HEV的確認及其檢測方法的建立澄清了70％以上NANB肝炎的致病因子，但仍有10～20％病毒性肝炎由非甲～戊型肝炎病毒引起。GB是一位感染病毒性肝炎致死的美國外科醫生姓名首字母縮略詞。雖然在該患者血清中未發現有已知肝炎病毒感染的指標，但其血清接種絨猴實驗證明，接種絨猴均有肝炎癥狀。血清中致病因子可接種絨猴傳代，接種10代以上絨猴血清仍可感染志愿者。Simons等首次采用RDA(差異分析技術)法從感染致病因子的絨猴血清中分離出兩株類似黃病毒屬病毒的新型病毒，分別稱為庚型肝炎病毒(A)和(B)[GBV(A)和(B)]。
1.中國藥品生物制品檢定所，100050 北京2.北京醫科大學微生物系，100083北京在進一步的研究中，他們還從非甲～戊型肝炎患者血清中克隆出部分GBV(C)基因。相對于GBV(B)，GBV(C)與HCV及GBV(A)有更高的序列的同源性。
本發明目的在于提供一種中國庚型肝炎病毒C基因序列及應用，從而可以了解中國有無GBV(C)感染，研究中國GBV(C)的基因序列及其特征，建立適當的檢測方法及檢測系統，探索病毒感染的治療手段，研制預防用疫苗。
為了解庚型肝炎病毒(GBV)(C)的致病性及中國有無GBV(C)病毒感染，我們采用特異性引物RT-PCR及隨機引物擴增相結合的辦法從高危人群及非甲～戊型肝炎患者體內分離GBV(C)基因。對RT-PCR產物進行測序結果表明，中國GBV(C)與Simons等報道的序列有較高的同源性，但某些功能區核苷酸差異可達10～40％。基于中國GBV(C)的序列設計引物，可以提高RT-PCR方法的檢測率。根據中國GBV(C)推定的氨基酸序列設計多肽及采用中國GBV(C)基因重組表達的抗原，可以提高GBV(C)抗體檢測陽性率。利用中國GBV(C)基因，將使我國研制出的疫苗更有效，更安全。


圖1為核酸序列測定圖譜。
圖2為GBV(C)RNA擴增產物電泳圖譜。其中圖2a1，2，7，8欄為陰性對照3，5欄為擴增陽性產物4欄為ONA分子量標準PQEM ZF(+)DNA/HAEIII6欄為DNA分子量標準Φ×174/HaeIII其中圖2b5，6欄為擴增陽性產物4欄為DNA分子量標準Φ×174/HaeIII10欄為DNA分子量標準PGEM ZF(+)DNA/HaeIII余者為陰性對照本發明實施方案如下(1)非甲～戊型肝炎患者血清計300例，系來自全國各地并長期保存于-80℃備用；(2)單采漿站的供血者血漿計4000例，采自全國各地的單采漿血站；(3)GBV(C)特異性引物應用美國最新分子生物學計算機軟件色OLIGO 5.0輔助設計。由北京賽百盛(美國)生物工程公司合成。引物序列為外引物S15’TCG CCT ATG ACT CAG CAT CC 3’；a15’TCA ACG ACC TCC TCC ACC AC 3’；內引物S25’ATG ACT CAG CAT CCA TCC AT 3’；a25’CTC CAC CAC CAA CCC ACA GT 3’；(4)隨機引物由軍事醫學科學研究所合成。序列為
STY GCY ACK GCK ACK CHK GaG GAM CHG GKM TGR WAR TGR TAV CY＝C Or T； K＝G or T； H＝A，C or T； ＝A or CR＝A or G； V＝A or G.
一.GBV(C)RNA的檢測(試劑盒化)(一).GBV(C)RNA的提取A.方法1血清100ul溶于300ul變性溶液(4.2mol/L GIT，GIBCO，BRL；0.5％ Sarcosyl，Sigma Chemical CO；2mmol/L Tris-HCI，0.1mol/L B-巰基乙醇，25mmol/L檸檬酸緩沖液，PH8.0中，充分混勻后，室溫放置30～50分鐘。依次加入2mol/L NaAc 50ul，酚500ul，氯仿與異戊醇混合液100ul(24∶1)。混勻后靜置5～10分鐘，10,000rpm 4℃離心10分鐘。取上層水相加入等量的異丙醇。-20℃過夜后，14,000rpm離心15分鐘，真空抽干。
B.方法2血清150ul溶于200ul含0.5％SDS、0.1～1.0％玻璃粉，20ug/ml蛋白酶K的病毒裂鮮液中，68℃置一小時，每隔20分鐘混勻一次。加入0.5mol/L NaAc 60ul，水飽和酚200ul，氯仿和異戊醇混合液(49∶1)80ul。混勻后靜置5分鐘。10,000rpm 4℃離心10分鐘。取上清液190ul加入等量異丙醇，-20℃隔夜后真空抽干。
(2)反轉錄及第一次PCR在上述管中加入含0.2U/ul的AMV(Promega CO.)0.5U/ulRNA酶抑制物(RNasin，Promega CO.)，50umol/L d NTPS(Sigma)以及400Pmol/L外引物(或隨機引物)終濃度的反轉錄緩沖液20ul，加溫42℃，45分鐘。再加入含d NTPS 300 umol/L，taq DNA多聚酶0.04U/ul以及外引物(或隨機引物)300pmol/L終濃度的反應擴增液30ul，石蠟油封頂后，94℃30秒，58℃1分鐘，72℃1.5分鐘，30次循環。
(3)第二次PCR取第一次產物1ul至含內引物400pmol/L，dNTPS 300 umol/L，Taq酶0.04U/ul終濃度的反應擴增液中，94℃30秒，58℃1分鐘，72℃1.5分鐘，擴增30次循環。
(4)產物檢測1.8％的Agaroae膠在TAE緩沖液(40mmol/L Tris；20mmol/LSodium acetate，Sigma；2mmol/L EDTA；PH8.0)中100V電源1小時，溴化乙錠染色后，UV燈下觀察結果(見圖2)。
(二)核苷酸序列測定序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法直接進行CDNA的核苷酸序列測定(Promega公司fmolTMDNA Sequencing System)。測定引物首先用r-32P ATP進行末端標記。30ul測序緩沖液中含10ulcDNA模板，20pmol/L的32P標記的引物，4U Taq DNA聚合酶和2×測序緩沖液(50mmol/L Tris-HCL PH 8.8，7mmol/L MgCl2)。7.5ul反應液分別裝到4個含不同終止反應物(dd ATP，ddCTP，ddGTP，ddTTP)的反應管中，在PCR儀上反應30個循環(95℃45秒，58℃45秒，70℃90秒)。加入3ul終止液(70％甲酰胺，0.25％二甲苯素FF和溴酚蘭指示劑)，95℃3分鐘。反應物在含有8M尿素的6％聚丙烯酰胺凝膠上電泳8小時。經放射自顯影后，用直讀法在電泳膠上讀出核苷酸序列(見圖1和表1)。
二.特異性多肽合成(1)DCC+HOBt接肽法10mmol/L N-Boc-AA溶解在30ml干燥THF(或無水DMF)中，加入10mmol/L的HOBt，冷至0℃。加入11mmol/L新蒸DCC，0℃反應一小時。TLC跟至原料點消失，加入10mmol/L N端—游離C—端保護氨基酸，混合物于0℃攪拌反應3小時，TLC檢查反應完畢。過濾除去DCU，減壓濃縮。殘余物溶于100ml乙酸乙酯中，依次用5％NaCL水溶液，5％NaHCO3溶液，2N檸檬酸水溶液，5％NaCL水溶液各洗滌2次，無水Na2SO4干燥過夜。除去溶液后，固體在乙酸乙酯——石油醚(30～60℃)或乙酸乙酯——乙醚中重結晶得白色粉末狀固體。
(2)脫BocN-端Boc保護的合成肽，用4N HCL/EtoAC或4N HCL/dioxane溶液溶解。室溫攪拌反應1～4小時，大部分肽的鹽酸鹽以固體的形式析出，過濾純化即可。不生成固體的肽鹽酸鹽，可經減壓濃縮后，用無水乙醚研磨析晶。
(3)皂化反應將N端保護的肽酯溶于無水甲醇中，滴加1/2體積的2N KOH，室溫中攪拌反應1～2小時，TLC檢查反應完畢。加水稀釋，過濾除掉不溶物，濾液在冰上冷卻，用6N HCI酸化至PH3～4；有白色固體析出；過濾收集并用水洗至中性。然后進行重結晶得到產品。
(4)HF脫保護200mg全部保護肽段，加入反應器中，加入1ml苯甲醚和1ml硫醚，轉入5～6mlHF，冰上冷卻，攪拌反應約1小時，減壓抽真空2小時。反應混合物用乙醚(無水)多次洗滌，得白色固體粉末。然后進行柱層析純化。
(5)鉀鹽法制備氨基樹酯稱取一定量N-BOC-AA溶于少量甲醇中，加入等量的固體氫氧化鉀，不斷搖動使其全部溶解，減壓抽去甲醇和少量水，加入少許甲醇，減壓抽干。反復幾次后，置于P2O5真空干燥器內干燥過夜。得N端保護的氨基酸甲鹽固體。
氯甲基樹脂中加入相當于2倍含氯當量的N一端保護的氨基酸鉀鹽，以DMF做溶劑，80℃下緩慢攪拌反應24小時。所得氨基酸樹脂用DMF，EtOH，H2O，EtOH各洗三次，干燥后去除N一端保護基，按氨基測定法測得的氨基數值，即為樹脂含氨基酸量。
(6)茚三酮法測定樹脂氨基含量稱取1-5mg氨基酸樹脂加入小試管中，加入4滴A液，1滴B液。另取一只小試管只加A和B作空白對照，于100℃恒溫加熱10分鐘。取出試管，在冷水中冷卻中止反應。過濾，濾液收集在5ml容量瓶中，以60％乙醇水溶液稀釋，UV570nm處測吸收值。按下列公式計算樣品中氨基含量。(∑＝1.5×104，對Gly∑＝1.0×104)。
A液配制稱取新蒸苯酚40g，加熱溶于10ml無水乙醇中，得溶液I。取65mgken溶于100ml水中。再取2ml用吡啶稀釋至100ml，得溶II。將I、II混合均勻得溶液A。
B液配制1g茚三酮溶于20ml無水乙醇中得B。
(7)DCC+HOB1或HOSu接肽通法稱取相當于樹脂含氨基酸3倍量的Boc-氨基酸加入到盛有氨基樹脂的反應器中，加入等當量的HOBt(或HOSu)，再加入1∶9的DMF∶DCM混合液，振蕩溶解后加入DCC。室溫反應3小時。分別以MeOH，DMF DCM各洗滌6次，每次2分鐘，抽干。
(8)茚三酮法檢驗氨基酸縮合情況取少許約1-5mg g步氨基樹脂加入小試管內，加入4滴A及1滴B，放入100℃反應器內反應5-10分鐘，取出觀察，如顯藍色，則重復接肽一次，直至不再顯藍色，進行下一步。
(9)固相接肽脫Boc和脫Boc后的中和反應。
在盛有N-Boc-AA-樹脂的反應器中，加入TFA-DCM＝1∶2(V∶V)的溶液，室溫反應30分鐘，過濾。樹脂以DCM洗滌2次后用TEA-DCM＝1∶9(V∶V)溶液中和CF3CCO-離子，共進行三次，每次2分鐘，最后以DCM洗滌六次，抽干。
(10)HF切落樹脂及脫保護取0.5g樹脂肽加入到反應瓶中，再加入2ml苯甲醚，2ml硫醚，(如肽段中含Trp，則需加少量硫基乙醇)，轉入約8Ml HF，冰-水冷卻下(最好-5-0.℃)反應2小時，抽去HF。用無水乙醚洗滌多次，以10％HOAc-H2提取去保護肽。凍干得粗品肽。
(11)Sephadex柱層析純化裝柱選取合適分子量的Sephadex用H2O浸泡24小時后，再以1NHOAc反復洗滌，浸泡6小時以上后，準備裝柱。選取1.0米長的柱子(Φ＝2.8cm)，在柱內先裝入約1/3的1NHOAc，然后從上口貼器避緩慢加入Sephadex 1NHOAc水溶液，并且打開下口閥門，并逐漸加快直至全部打開。保持柱添料緩慢沉降于柱內，直至全部添滿柱子。室溫沉降6小時后以1NBOAc平衡6小時備用。
上樣將粗品肽凍干粉以最小量1NHOAc溶解(如含半胱氨酸，則加50％的DTT)，如不溶則提高HOAc濃度。離心除去不溶物，用滴管輕輕加樣于柱頂部。
過柱然后以1NHOAc為洗脫液，收集第一個主要大峰，凍干即為純品肽。
HPLC檢驗純度用反相C18柱檢驗肽純度大于90％，否則重新純化，直至采用HPLC制備純化。
結果制備得到特異性多肽片段表3的序列S1，采用類似方法重復制備得到表3的序列S2，S3，S4。
三.ELISA法檢測抗GBV(C)抗體(一)分片段證實ELISA(1)包被分別用NS3區合成多肽(S1，S2，S3，S4見表3)及C區合成多肽及表達抗原(見表4)包被；選用配對較好的抗原聯合包被Luck標板(丹麥)4℃24小時。
包被液PH9.6碳酸基緩沖液(新鮮配制)。
(2)加Blocking液400ul，4℃18小時，再放37℃2小時。Blo-cking液10％小牛血清+0.5％脫脂奶粉+0.4％明膠。
(3)用PH7.4磷酸鹽緩沖液洗滌三次后，加入1∶20稀釋后待檢血清。37℃反應30分鐘。
(4)用PH7.4磷酸鹽緩沖液洗滌三次后，加1∶3300酶標抗體稀釋液100ul(Sigma，羊抗人酶標二抗)，37℃作用15分鐘。酶標抗體稀釋液NaH2PO4.H2O 0.32gNa2HPO4.2H2O 1.17gNaCL 9.2gTWeen-20 1ml慶大霉素 0.194g羊血清 10mlEDTA 0.37g(sigma)加水至1000ml(5)洗滌三次后，加酶標底物液(OPD系統)100ul，室溫避光作用15分鐘。
(6)加入3NH2SO4中止反應，492nm波長測OD值。
(7)陰性參考血清的測這與結果判斷選擇一份與200份正常人血清ELISA結果均值相同的血清作為陰性對照。cut off值為3份陰性對照的均值+0.25(約4SD)，測定結果OD值)大于cut off值者為陽性。單片段抗體檢測值(S/C)≥0.6值，采用RIBA實驗證實。
(二)RIBA證實實驗RIBA證實實驗采用不同抗原組合的免疫斑點法。方法基本與上述相似。不同點為(1)抗原濃度提高5～10倍；(2)采用堿性磷酸酶標記二抗；(3)支持載體為醋酸纖維模。兩個片段以上抗體反應者為陽性。單一片段抗體反應者視為可疑。
(三)GBV(C)猴體感染實驗0.5ml GBV(C)RNA陽性血清接種猴體內，每隔一周抽取猴血清檢測其GBV(C)RNA及抗體。
GBV(C)RNA陽性血清感染熊猴及獼猴等，血清中可以檢測到
GBV(C)RNA陽性血清感染熊猴及獼猴等，血清中可以檢測到GBV(C)RNA。猴轉氨酶在2周后升高。熊猴、獼猴等可以作為動物模型。
四.檢測結果(1)300例非甲～戊型肝炎患者血清中，GBV(C)抗體陽性率達5.0％(15/300)，其中GBV(C)RNA陽性率達2.33％(7/300)。
(2)4000例單采血漿的GBV(C)抗體陽性率達0.43(17/4000)，其中GBV(C)RNA的陽性率為0.13％(5/4000)。
(3)GBV(C)NS3區的266個堿基，四種核苷酸的構成比例為A占21.05％；T占22.93％；G占30.45％；C占25.56％。與Simons，J.N等報道的序列比較，同源性達89.47％(見表1)，核心區某一段堿基的同源性為90.45％。
(4)應用Simons，J.N.等報道的序列設計引物，非甲～戊型肝炎患者血清GBV(C)RNA的檢測陽性率為1.0％(3/300)；4000例單采血漿中GBV(C)RNA的陽性率為0.08％(3/4000)。利用中國人GBV(C)基因序列設計引物，可以提高中國GBV(C)C RNA檢測的陽性率。
(5)應用Simons，J.N.等報道的核苷酸推定的氨基酸序列合成多肽，300例非甲～戊型肝炎患者抗體檢測率為2.33％(7/300)；4000例單采血漿GBV(C)抗體檢測陽性率為0.2％(8/4000)。利用中國GBV(C)氨基酸序列設計的多肽抗原及表達抗原，可以提高GBV(C)抗體的檢測率。
本發明的效果如下(1)證實中國存在GBV(C)感染，填補國內空白。
(2)克隆出部分中國GBV(C)基因，并進行序列測定，有利于對GBV(C)分子生物學的研究。
(3)利用中國GBV(C)NS3區及核心區基因設計引物，可提高RT-PCR法檢測率。
(4)建立GBV(C)合成肽抗原檢測GBV(C)抗體的方法，將對GBV(C)感染的臨床診斷，預后觀察及流行病學調查有重要意義。
(5)利用中國GBV(C)基因重組表達抗原，可以顯著提高GBV(C)抗體檢測陽性率。
(6)GBV(C)的動物模型，將為病毒疫苗、治療藥物的研制提供必要手段。
表1中國株GBV-C部分核苷酸與氨基酸序列。
M T Q H P S I I E T KChT1 ATGACTCAGCATCCATCCATAATTGAGACAAAAChT2 ................................GL D V G E I P F Y G HChT1 CTGGACGTGGGTGAGATCCCCTTTTATGGGCACChT2................................TG I P L E R M R T G RChT1 GGTATCCCCCTTGAGCGGATGAGGACTGGTAGGChT2 ................................
H L V F V H S K A E CChT1 CATCTCGTATTCTGCCACTCAAAGGCGGAGTGCChT2 ................................
E R L A G Q F S S R GChT1 GAGAGCTTGGCGGGCCAGTTCTCCTCTCGGGGGChT2 ................................
V N A I A Y Y R G K DChT1 GTCAATGCCATCGCCTATTATAGGGGCAAGGACChT2 ................................
S S I I K D G D L V VChT1 AGTTCCATCATCAAAGACGGAGACCTGGTGGTTChT2 ................................
C A T D A L S T G Y TChT1 TGTGCGACAGACGCGCTCTCTACGGGGTACACTChT2 ................................
G N F D S V T D C G LChT1 GGGAACTTCGATTCTGTCACCGACTGTGGGTTG
ChT2 ................................
V V EChT1 GTGGTGGAGChT2 ..........
表2中國株GBV(C)核苷酸序列與Simons等報道的GBV(C)序列比較。
SiM T Q H P S I I E T KSiATGACTCAGCATCCATCCATAATTGAGACAAAGChT1 .................................ASiL D V G E I P F Y G HSiCTGGACGTTGGTGAGATCCCCTTTTATGGGCATChT1 T.......G.......................CSiG I P L E R I R T G RSiGGTATCCCCCTCGAGCGTATGAGGACTGGTCGCChT1 ............T.....G............A.GSiH L V F C H S K A E CSiCACCTTGTATTCTGCCATTCCAAGGCGGAGTGCChT1 ..T..C...........C..A............
SiE R L A G Q F S A R GSiGAGAGATTGGCCGGCCAGTTCTCCGCGCGGGGGChT1 .....C.C...G............T.T....
SiV N AI A Y Y R G K DSiGTTAATGCCATCGCCTATTATAGGGGTAAGGACChT1 ...C.......................C.....
SiS S I I K D G D L V VSiAGTTCCATCATCAAAGACGGAGACCTGGTGGTTChT1 .....T.............T.......C....
SiC A T D A L S T G Y TSiTGTGCGACAGACGCGCTCTCTACCGGGTACACAChT1 .........G.....A........G........T
SiG N F D S V T D C G LSiGGAAACTTCGATTCTGTCACCGACTGTGGGTTGChT1 ...G..........C....T.............
SiV V ESiGTGGTGGAGChT1 ..........表3.特異性多肽合成法合成的多肽片段序列S1ERMRTGRHLVFCHSKAECER序列S2...RTGRAIAYYRGK序列S3...IETKLDVGEI序列S4...DGDLVVCATDALS表4C區合成多肽及表達抗原序列(C抗原)GVRRVRRVDKDQWGPGGRGCDPGRGKDPHRCPSRGGGCCMGPPSSAAAYSRAAAYSRGSPRTLRVRAGGISFP IMAVLLLLLVVEAGAPATHACSAKGQYXLSAKGQYXLTNCCALEDIGFCLEEGCLVALGCTICTDRCWPLYQAGLAVGLAARPGKSAAQLVGELGSLYGPLSVSAYVAGG
權利要求
1.中國庚型肝炎病毒C的基因序列，其DNA序列為表1中列出的檢苷酸序列(表1附后)。
2.一種多肽序列，它含有表1中所述氨基酸序列。
3.一種檢測庚型肝炎病毒C核酸的試驗盒，包括(1)采用特異性引物將RNA轉錄成C DNA；(2)利用PCR的方法，用GBV(C)特異性引物擴增病毒核酸；(3)取第一次產物進行第二次擴增；(4)將最終擴增產物在含溴化乙錠的瓊脂中電泳；(5)利用分子量標準判斷產物的特異性，以檢測GBV(C)RNA。
4.一種檢測抗庚型肝炎病毒(C)抗體的方法，其特征在于①用表3所示多肽及表4所示多肽分別包被酶標板；②加封閉液；③洗滌后加入待檢血清，37℃反應30分鐘；④洗滌六次后，加入酶標抗體應用液，37℃反應15分鐘；⑤洗滌六次后，加酶標底物液，作用15分鐘；⑥加入H2SO4中止反應，492nm測OD值。
5.GBV(C)熊猴及獼猴的感染方法及模型，其特征在于用含GBV(C)的血清(漿)經靜脈感染動物；被感染動物血清中出現病毒之癥及抗體反應。
全文摘要
本發明公開了中國GBV(C)的基因序列及合成的NS
文檔編號G01N33/576GK1165861SQ9610504
公開日1997年11月26日 申請日期1996年5月22日 優先權日1996年5月22日
發明者汪興太, 莊輝, 李河民, 祁自柏 申請人:中國藥品生物制品檢定所