專利名稱：地龍溶栓酶的制備及其鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種地龍溶栓酶的制備及其作用、作用機制和性質的鑒定方法。
蛋白酶是生物學、醫學及相關學科中廣泛應用的工具酶類和藥品制劑，也是輕工業生產中常用的催化劑。目前雖有種類繁多的蛋白酶被發現，但經中國科學院情報所國際計算機聯機檢索表明，國內外尚未見有地龍溶栓酶的研究報導。此外，目前所發現的蛋白酶，由于其化學性質不穩定，原料來源不廣泛，制備方法難度大等缺點，嚴重限制了其在工業上的廣泛應用。另一方面，由于蛋白酶類藥物可以引起人體強烈的免疫反應以及作用機制的局限性，目前由于藥物治療的酶類為數有限，而在用于溶栓治療方面的不同作用機理的兩類酶制劑中，應用較廣的只有尿激酶(U.K)一種。它的作用機理是激活人體血液中的纖溶酶原，進而溶解纖維蛋白和纖維蛋白原，達到溶栓治療的目的。但另一類，即直接溶解纖維蛋白的溶栓酶類藥物，雖然有人體中分離出的纖溶酶及其衍生物、蛇毒溶栓酶等，但由于其缺點突出，致使應用非常有限。
本發明的目的是，建一系列可為大規模生產所用的制備地龍溶栓酶及鑒定其性質、作用機制的方便有效的方法。
本發明的要點在于，以新鮮蚯蚓為原料，經細胞碎裂、硫酸氨分段鹽析、超濾膜超濾分級分離及DEAE纖維素、DEAE-Sephadex-A-25和Sephadex-G-50三種柱層析方法，可從蚯蚓體內得到聚丙烯酰胺電泳一條帶的電泳純地龍溶栓酶。采用酪蛋白或纖維蛋白為底物，酚試劑為顯色劑，721型分光光度計為測定儀器，將不同酶量與相同濃度底物作用后的樣品進行色譜分析，即可測定該酶活性。酶與底物的作用條件是PH7.4，37℃。該酶的分子量，可用SDS-聚丙烯酰胺電泳結合Sephadex-G50柱層析進行測定。測定結果，該酶的分子量為29，000道爾頓。該酶的熱穩定性較好，于25-50℃保溫三小時，酶活力基本保持不變，60℃時，活力保留65%，酶的最適溫度為57℃。溫度穩定性可比較各種溫度下的酶活力進行鑒定。該酶的最適PH為8.0，在PH4.7-11.0范圍內，酶作用穩定。PH值的影響，可比較不同PH值條件下的酶活力進行測定。其溶栓作用初步鑒定方法是，體外以動物或人血漿形成1mm2的凝塊，用生理鹽水洗滌數次(10次左右)，然后加入溶于PH7.4緩沖液中的各種濃度的酶溶液，觀察其溶解情況。溶栓作用及作用機制的定量分析方法是，用50mg/ml藥用纖維蛋白原溶液加入104/ml凝血酶制成1mm2厚纖維蛋白平板，然后將該酶溶液點于平板上，在12小時內觀察溶解面積。用與該酶作用一定時間后的純纖維蛋白原樣品，進行聚丙烯酰胺電泳和SDS-聚丙烯酰胺電泳，觀察其特異性及活性。溶栓作用的體內和半體內的鑒定方法是1、取正常人血漿，加凝血酶，用chandler′s(肯特勒斯)體外血栓形成儀制成人工血栓，在保溫(37℃)條件下，觀察溶栓情況;2、將方法1中的血栓注入兔的肺動脈中，用血管造影法，觀察其作用。抗凝血的鑒定方法是，把該酶溶液在體外，或注入家兔體內，觀察血液的凝血酶時間，白陶土部分凝血活酶時間、凝血活酶時間以及血液中的纖維蛋白(原)含量及其降解產物的含量。制備鑒定方法流程見流程表。
采用本發明，可以方便、經濟、有效地從蚯蚓體內分離和鑒定出地龍溶栓酶。該酶具有低抗原性，高穩定性及高效性的優點。
地龍溶栓酶制備及鑒定方法流程表。
權利要求
1.一種地龍溶栓酶的制備及其作用、作用機制和性質的鑒定方法，其特征在于所說的地龍溶栓酶是從蚯蚓內體分離提取的一種成份。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是以新鮮蚯蚓為原料，經細胞碎裂、硫酸銨分段鹽析、超濾膜超濾分級分離及DEAE纖維素、DEAE-Sephadex-A-25和Sephadex-G-50三種柱層析方法，可從蚯蚓體內得到聚丙烯酰胺電泳純地龍溶栓酶。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是地龍溶栓酶的活性，是采用酪蛋白或纖維蛋白為底物，酚試劑為顯色劑，721型分光光度計為測定儀器，把不同酶量與相同濃度底物作用后的樣品進行光譜分析確定的。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是該酶的分子量可用SDS-聚丙烯酰胺電泳結合Sephadex-G-50柱層析進行測定，結果證明，其分子量為29，000道爾頓，該酶的熱穩定性可比較各種溫度下的酶的活力進行鑒定，結果證明，在25-50℃保溫三小時酶的活力基本不變，其最適溫度為57℃，該酶PH的影響可比較不同PH值條件下的酶活力進行鑒定，結果表明，在PH4.7-11.0范圍內，酶作用穩定，而其最適PH值為8.0。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是該酶的作用與作用機制的鑒定方法是，體外以動或人血漿形成1mm3的凝塊，用生理鹽水洗滌數次(10次左右)然后加入溶于PH7.4緩沖液中的各種濃度的酶溶液，觀察其溶解情況，其定量分析方法是，用50mg/ml藥用纖維蛋白原溶液加10μ/ml凝血酶制成1mm2原纖維蛋白平板，然后將該酶溶液點于平板上，在12小時內觀察溶解面積，再用與該酶作用一定時間后的純纖維蛋白原樣品，進行聚丙烯酰胺電泳和SDS聚丙烯胺電泳，觀察其特異性。
全文摘要
地龍溶栓酶(ERTHWORM THROMBOLYTIC ENZYME)是一種從蚯蚓體內經硫酸銨鹽析、超濾、DEAE-纖維素、DEAE-Sephadex-A25、Sephadex-G50柱層析純化出的蛋白酶，經鑒定，該酶具有高效抗凝促纖溶作用及降解其它蛋白質的作用，該酶分子量小，化學性質穩定，鑒于以上性質，作用機制以及原料來源豐富經濟等特點，該酶可在生物學、醫學和工業生產中廣泛應用。
文檔編號G01N33/573GK1037345SQ88101579
公開日1989年11月22日 申請日期1988年4月4日 優先權日1988年4月4日
發明者牛勃, 程牛亮, 單鴻仁, 張祖詢 申請人:牛勃