專利名稱:用于環境雌激素類污染物檢測的基因工程試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種境檢測技術領域：
的基因工程試劑盒及其應用方法，具體是一種用于環境雌激素類污染物檢測的基因工程試劑盒及其應用。
背景技術：
環境雌激素類污染物(Environmental htrogens，EEs)是自然或人類活動中產生的在環境中持久存在的一類化學物質，可通過直接或間接的方式在動物和人類體內蓄積、 富集，在機體內與激素受體結合，它的作用與動物內分泌激素的作用類似，會引起人類及多種生物的神經系統失調、內分泌紊亂、免疫能力下降以及生殖失常等，直接關系著人類社會與生物圈生存與繁衍的根本性安全。因此，必須對Eh作全方位的檢測，以評估其潛在的風險與危害。
目前，EEs的檢測手段主要有化學法和生物學法。化學法中應用最廣泛的一種是高效液相色譜法，它往往與其它技術相結合來檢測EEs，如固相微萃取技術-高效液相色譜法(SPME-HPLC)，高效液相色譜法-飛行時間質譜法(HPLC-ToF)以及高效液相色譜-串聯質譜聯用法(HPLC-MS/MQ等。雖然化學法測定環境激素含量準確性較高且方法較多，但其樣品前處理和測定步驟十分復雜，儀器價格昂貴，且只能局限于對目標化合物的分析方面，限制了化學法在檢測EEs的推廣與應用。生物檢測方法可以兼顧Eh之間的加和作用和協同作用。子宮生長試驗是最早建立的生物學檢測Eh活性的方法，隨后，細胞檢測Eh 的方法如人類乳腺癌細胞培養，大鼠子宮腺癌細胞培養，肝細胞卵黃素生成實驗等也有一定應用。盡管動物及細胞檢測方法可比較有效地研究雌激素類物質的代謝過程，但其模型建立難度大，操作復雜，篩選通量不大，且哺乳動物細胞的抗毒素能力較低，所以不太適于大量樣品的Eh快速檢測。相比于哺乳動物細胞，微生物具有培養操作簡單，篩選通量大， 抗毒素能力強等特點，更適于高通量樣品的快速篩查。利用分子生物學技術建立的重組酵母系統(YES) (Takamura Enya T, Ishihara J, Tahara S, et al. Analysis of estrogenic activity of food stuffs and cigarette smokecondensates using a yeast estrogen screening method. Food Chem Toxicol, 2003,41 (4) :543 550)是近年來應用較廣泛的 EEs生物檢測方法，其檢測靈敏度和特異性較好，且費用低廉。但酵母生長速度較慢，檢測周期較長，仍需進一步完善。隨著我國經濟的快速發展和Eh污染問題的日益嚴重，亟需建立更為簡便快捷、高效靈敏且經濟的高通量生物學檢測Eh的方法。
與其它微生物相比，大腸桿菌具有生長周期短，遺傳背景清楚，操作步驟簡單，改造技術成熟，培養成本低廉等優勢，是進行環境Eh生物學檢測的極佳個體，結合近年來分子生物學研究的熱點之一——蛋白質內含肽antein)，可實現高效靈敏、快捷經濟的高通量檢測。蛋白質內含肽是存在于前體蛋白質中的一段氨基酸序列，在蛋白成熟過程中可發生自我剪切，從前體蛋白中釋放出來，同時連接兩端的肽鏈，形成有活性的成熟蛋白。目前， 蛋白內含肽已應用到蛋白質工程領域的各個方面，如蛋白快速純化，蛋白互作檢測，蛋白體內外連接及環化，及蛋白質結構與活性關系研究；在醫學、制藥、傳染病學、農學等多個領域
3都有應用。由于蛋白質內含肽最早是在微生物中發現，且具有微生物易培養、易于操作、理化性質明確等性質，因此內含肽在微生物分子生物學方面的應用最為廣泛。最近，有關條件性蛋白內含肽的研究備受研究者關注，一些條件性蛋白內含肽被陸續構建成功。這些內含肽僅在特定條件下，如溫度和藥物誘導時(Rubing Liang et al. A novel strategy to create temperature-sensitive mutants withT7-expression system in Escherichia coli，J Microbiol Meth，2007，68 ( :497 506)，才能發生剪切，產生有活性的目標蛋白。 利用條件性蛋白內含肽來調控蛋白活性的方法與其它方法相比，其本底表達更低，不同條件下蛋白的表達水平與活性差異更明顯，使用范圍更廣泛。若利用雌激素敏感的蛋白內含肽，將該內含肽與顏色蛋白融合，即可實現受雌激素誘導的顏色蛋白表達，從而在分光光度計下進行快速檢測。
經對現有文獻資料檢索發現，公開號為CN 1624483A的中國發明專利申請說明書披露了一種檢測環境雌激素效應的試劑盒及其制備方法，該方法利用抗原抗體反應來檢測環境雌激素效應的試劑盒。它利用了包被在酶標板殺傷的鯽卵黃蛋白原多克隆抗體和酶標記鯽卵黃蛋白原單克隆抗體來反應。步驟包括制備鯽卵黃蛋白原多克隆抗體，包被于酶標板上，用BSA封閉；制備鯽卵黃蛋白原單克隆抗體，并用酶標記，將標記的抗體與等量甘油混合；將鯽卵黃蛋白原多克隆抗體與鯽卵黃蛋白原單克隆抗體共同包裝，得到為其檢測試劑盒。該試劑盒檢測方法復雜，需多步操作，時間較長；價格昂貴，成本高；抗原抗體反應假陽性較高；檢測閾值較高，一般為500 1400ng/mL;且該試劑盒的應用范圍有限，只能檢測鯽魚和相關種類的魚類的血清或血漿中含有的卵黃蛋白原。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種用于環境雌激素類污染物檢測的基因工程試劑盒及其應用，檢測過程更加簡便快捷，只需2 3小時即可獲得結果；沒有特殊的儀器要求，樣品需要量少，檢測穩定性高，檢測靈敏度可達ng/L ；在大大降低了分析成本的同時也提高了分析率。
本發明是通過以下技術方案實現的
本發明涉及一種檢測環境雌激素類污染物的基因工程試劑盒，其組分為2X104 體積份的LB培養基、1體積份的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)、20體積份的氯仿、10 體積份的十二烷基硫酸鈉溶液(SDQ、20體積份的鄰-硝基苯-β -D-半乳糖苷(ONPG)以及100體積份的碳酸鈉溶液。
所述的十二烷基硫酸鈉溶液是指質量百分數濃度為1 %的SDS的水溶液。
所述的碳酸鈉溶液是指濃度為IM的Na2CO3的水溶液。
本發明涉及上述試劑盒的檢測方法，包括如下步驟
步驟一，培養大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)DE3 (pLacZMER)；
所述的培養是指在37°C環境下采用振蕩搖床以以ISOrpm的轉速培養，培養至 OD600 為 0.6。
所述的大腸埃希氏菌DE3 (pLacZMER)為包含質粒pLacZMER的大腸桿菌，具有卡那霉素抗性，生長培養基為LB培養基，生長與培養溫度為37度；顯著特征為雌激素加入后會產生顏色反應，且強度與雌激素濃度呈正相關。[0015]步驟二，向基因工程菌株的培養物中加入IPTG并進行誘導處理；
所述的誘導處理是指在37°C環境下采用振蕩搖床以以ISOrpm的轉速培養1小時。
步驟三，向基因工程菌株的培養物中依次加入氯仿、SDS和ONPG并進行孵育處理后加入碳酸鈉溶液，再置于紫外分光光度計中檢測得到環境雌激素類污染物的含量。
所述的孵育處理是指在的環境下溫育至培養物的顏色為黃色。
所述的置于紫外分光光度計中檢測是指采用紫外分光光度計測定OD42tl和 OD55tl后根據標準曲線定量計算β-半乳糖苷酶活性=[IOOOX(OD420-OD550) X 1.75]/ [OD600 X (Τ2-Τ1) XV]，并得到環境雌激素類污染物的含量，其中Τ2和Tl分別為反應終止時間和反應起始時間，單位為分鐘；V為所取菌液體積，單位為mL，OD420和OD55tlOD6tici為光密度，OD = log(l/trans)，trans為檢測物的透光值。
與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明利用含有雌激素敏感的蛋白內含肽的基因工程菌株并結合分光光度技術，建立了一種高通量快速檢測環境雌激素效應的基因工程試劑盒與方法。利用本發明的試劑盒進行檢測，檢測過程更加簡便快捷，只需 2 3小時即可獲得結果；沒有特殊的儀器要求，樣品需要量少，檢測穩定性高，檢測靈敏度可達ng/L ；在大大降低了分析成本的同時也提高了分析率。
本發明所述的大腸埃希氏菌Escherichia coli DE3 (pLacZMER)于2010年06月 04號提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號為 CGMCCN0 3913 ；該單位的地址為北京市朝陽區北辰西路，中國科學院微生物研究所，郵編，100101。


圖1為質粒pLacZMER酶切鑒定結果圖；
圖2為菌體蛋白SDS-PAGE檢驗結果圖；
圖3體外純化的工程菌株表達蛋白在17 β -雌二醇誘導后的SDS-PAGE結果圖；
圖4DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的17 β -雌二醇后β -半乳糖苷酶活性變化圖；
圖5DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的雙酚A后β -半乳糖苷酶活性變化圖；
圖6DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的多環芳烴屈后β -半乳糖苷酶活性變化圖；
圖7DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的多環芳烴60H-屈后β -半乳糖苷酶活性變化圖。
具體實施方式
下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1
基因工程試劑盒的制備
步驟一，將人源雌激素受體α蛋白的Ser301-Thr553肽段與蛋白質內含肽 (Mycobacteriumtuberculosis recA intein)融合，構建雌激素敏感的蛋白質內含肽嵌合體；
(I)PCR擴增蛋白質內含肽(Mycobacterium tuberculosis recA intein)片段，引物為 5，-GGATCCtgtttcgactacagcacccg_3，，5，-AAGCTTgttgtgcaccatgacaccgt-3，，純化回收；將該片段和質粒pET28a分別用Bam Hi/Hind III雙酶切后，回收酶切片段；之后用T4 DNA連接酶連接兩個酶切片段，化學轉化大腸桿菌DH5a (F-endAl gin V44 thi-1 recAl relAl gyrA96 deoRnupG 0 80dlacZ ΔΜ15 Δ (lacZYA-argF) U169，hsdR17 (rK_mK+)，λ-)，鋪 LBK平板，37°C過夜培養；挑取克隆并提取質粒，測序鑒定，陽性質粒命名為pMRecA，純化回收，-20°C保存備用。
(2) PCR擴增人雌激素受體蛋白的kr301至Thr553區域，模板為 Gal4-ER-VP16 (Randal IMorse, Wadsworth Center 索取)。將人雌激素受體和 pMRecA 質粒用Bss HII酶切后連接，即為雌激素敏感的蛋白質內含肽嵌合體質粒pMER。
步驟二，將顏色蛋白β -半乳糖苷酶基因克隆到質粒的Τ7啟動子下游，構建可高水平表達顏色蛋白的質粒。測序結果證實；
以質粒 ρΜΕ6522 為模板，用引物(5，-CCTTGGGGATCCatgaccatgattcaaggcacg-3，； 5‘-CCTTGGAAGCTTttatttttgacaccagaccaactgg-3‘)擴增全長的 IacZ 基因片段，純化回收； 將該片段和質粒pET28a分別用Bam Hi/Hind III雙酶切后，回收酶切片段；之后用T4DNA 連接酶連接兩個酶切片段，化學轉化大腸桿菌DH5 α (F-endAl gin V44 thi-1 recAl relAl gyrA96 deoRnupG 0 80dlacZ ΔΜ15 Δ (lacZYA-argF) U169, hsdR17 (rK-mK+)，λ -)，鋪 LBK 平板，37°C過夜培養；挑取克隆并提取質粒，測序鑒定，陽性質粒命名為pETlacZ，純化回收，-20°C保存備用。
步驟三，利用反向PCR和無痕定點插入重組技術，將雌激素敏感的蛋白內含肽插入到顏色蛋白半乳糖苷酶基因中，構建雌激素敏感的基因工程菌株。酶切檢測證實基因插入無誤；蛋白質電泳檢測證實工程菌株在無雌激素存在時顏色蛋白不表達，雌激素加入后可誘導顏色蛋白的高水平表達，且蛋白表達水平與雌激素濃度成正比；β-半乳糖苷酶活性檢測證實該菌株在無雌激素存在時沒有β -半乳糖苷酶的活性，雌激素的加入可誘導出高水平的β -半乳糖苷酶活性，并與雌激素濃度成正比。
(1)以質粒 pETlacZ 為模板，用引物(5，-tgttactcgctcacatttaatgttg-3‘； 5，-acccgtcggattctccgtg-3，)線性擴增 pETlacZ，純化回收，_20°C保存備用；
(2)以質粒pMER為模板，PCR擴增Mek intein片段
(5， -GTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGA GAATCCGACGGGTtgtttcgactacagcacccg-3，， 5，-TAGCCAGCTTTCATCAACATTAAATGTGAGCGAGTAA CAgttgtgcaccatgacaccgt-3，)，兩側帶有與IacZ插入位點兩側同源的序列。
(3)將線性片段pETlacZ和ΔI-SMTR intein混合后電轉化DY329(W3110DlacU169nadA: :TnlO gal490 lcI857 D(cro-bioA))感受態細胞，通過同源重組構建lacZ-intein-ER嵌合物，鋪LBA平板，32°C過夜培養，分別挑取克隆并提取質粒，測序鑒定，陽性克隆即為重組質粒-pLacZMER，純化回收，_20°C保存備用。
(4)將重組質粒 pLacZMER 轉化大腸桿菌 DE3 (F-, ompT, hsdSB (r B-mB-)，gal dcm(DE3))菌株，即為雌激素敏感的基因工程菌株。
(5) pLacZMER質粒的酶切鑒定將構建成功的質粒pLacZMER用Bam Hi/Hind III 雙酶切，瓊脂糖電泳鑒定。如圖所示(圖1)，質粒PLacZMER長度大約為101Λ左右，質粒 pET28a的長度大約為5. 31Λ。質粒pLacZMER用Bam Hi/Hind III酶切之后產生兩條條帶， 一條帶大小與pET28a相同，大約為5. 3kb ；另一條帶大小大約為4. 71Λ，與LacZ-intein-ER 嵌合物的大小相當(LacZ為3. 51Λ，ER-intein為1.業)。根據基因測序結果可知，質粒 pLacZMER構建成功，即已將LacZ-intein-ER嵌合物裝入pET28a質粒。
圖1為質粒pLacZMER酶切鑒定。圖中，M :DNA Marker ；1 pLacZMER質粒；2 質粒 pET28a ；3 :pLacZMER 質粒用 Bam Hi/Hind III 酶切后電泳；4 =LacZ 片段；5 :ER_intein 片段。
(6)體內顏色蛋白活性測定挑取DE3 (pLacZMER)單克隆，接種于3mL LB中(含 50 μ g/mL卡那霉素)，37°C培養至OD6tltl為0. 6左右，加入終濃度為ImM的IPTG誘導Ih或同時加入終濃度為ImM的IPTG和IOyL 17 β -雌二醇標準品母液，搖培誘導lh，用聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)鑒定菌體蛋白。如圖所示(圖2)，DE3 (pLacZMER)工程菌可表達大小為198KD的蛋白；而DE3(pET28a)對照組只表達LacZ基因，蛋白大小為110KD。在加入17 β-雌二醇標準品母液誘導后，DE3 (pLacZMER)工程菌可產生兩條條帶，一條大小為 110KD，與LacZ基因表達的蛋白大小相當；另一條大小為90KD,與ER-intein蛋白大小相當。因此，DE3 (pLacZMER)工程菌株構建成功。該菌株不僅可在IPTG的誘導下高產量的表達，并且在17 β -雌二醇的誘導下，可發生intein的自我剪切，產生了完整的β _半乳糖苷酶和ER-intein兩部分；在沒有17 β -雌二醇存在的條件下，菌株蛋白無變化。
圖 2 為菌體蛋白 SDS-PAGE 檢驗結果。M =Marker ；1 JPTG 誘導的 DE3 (pLacZMER) 工程菌；2 :IPTG誘導DE3(pET28a)3 :IPTG和17 β -雌二醇共同誘導的DE3 (pLacZMER)工程菌。
(7)純化蛋白體外活性誘導鑒定挑取DE3 (pLacZMER)單克隆，接種于3mL LB中 (含50 μ g/mL卡那霉素)，37°C過夜培養。次日取出ImL培養物接種到ILLB中(含50 μ g/ mL卡那霉素)，當OD6tltl達到0. 6時加入ImM IPTG，18°C過夜誘導。IPTG誘導產生的蛋白經過Ni-NTA親和純化(見附)后，在體外加入17 β-雌二醇誘導lh，SDS-PAGE鑒定。如圖所示(圖3) ,Ni-NTA親和純化產生的蛋白大小大約為198KD，與體內表達的蛋白大小一致；在 17 β -雌二醇的誘導下，產生了兩條明顯的條帶，一條大小約為110KD，與LacZ基因表達的蛋白大小相當；另一條大小約為90KD，與計算所得的ER-intein表達的蛋白大小相當。證實了工程菌株在17 β -雌二醇的誘導下可發生intein的自我剪切，產生了完整的β _半乳糖苷酶和ER-intein兩部分。
圖3體外純化的工程菌株表達蛋白在17 β -雌二醇誘導后的SDS-PAGE結果。左側泳道為marker，中間泳道為未加入17 β -雌二醇，右側泳道為加入17 β -雌二醇的結果。
Ni-NTA親和純化蛋白流程。將IL細胞培養液，室溫，8，OOOrpm離心IOmin收集細胞。將所產生的菌體懸浮于30mL裂解緩沖液QOmM Tris-HCl, 300mM NaCl PH 8.0,10% glycerol, 5mM β -ME,20mM imidazole, ImM PMSF)。超聲波破碎菌體(功率 700W，超聲如， 間歇6s，共超聲裂解100次)。12，OOOrpm離心60分鐘除去裂解液中所有不溶性顆粒，回收上清液。將上清加樣到裂解緩沖液徹底平衡過的2. 5mL Ni-NTA樹脂上。用50mL洗滌液以 8mL/h速度洗柱后，用5mL洗脫液以同樣的速度洗脫；分管收集洗脫液；收集液即為目標蛋白。
(8) β-半乳糖苷酶活性檢測。以無水乙醇作為溶劑配制17β-雌二醇標準品母液，使其終濃度為lmg/mL。之后用無水乙醇逐級稀釋成不同濃度的17β-雌二醇標準品溶液(1 X IO"1,1 X IO"2,1 X IO"3,1 X IO"4,1 X IO"5,1 X IO"6,1 X IO"7,1 X IO"8,1 X IO"9, 1 X l(Tlclmg/mL)。接種 DE3 (pLacZMER)單菌落于 50mL LBK 液體培養基中，37°C搖培到 OD6tltl 約為0. 6時，加入終濃度為ImM的IPTG。分別取ImL菌液，加入不同濃度的17 β -雌二醇標準品溶液10 μ L，及溶劑空白組(ImL菌液中加入IOyL乙醇)和培養基空白組(ImL菌液中加入10 μ L LB培養基)。搖培誘導lh。測定半乳糖苷酶活性，計算半乳糖苷酶活性倍數，每個樣品至少重復五次。如圖4所示，菌株在無雌激素存在時無β-半乳糖苷酶的活性，雌激素加入后可檢測到高水平的半乳糖苷酶活性，并與雌激素濃度成正比。 β-半乳糖苷酶的活性倍數隨17 β-雌二醇標準品濃度的降低而降低，呈S形相關；其最低檢測限可達到ng級，線性范圍在ng/L和100mg/L之間。
圖4DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的17 β -雌二醇后β -半乳糖苷酶活性變化。橫坐標為17 β-雌二醇的濃度，縱坐標為β-半乳糖苷酶活性變化倍數。β-半乳糖苷酶的活性倍數隨17 β -雌二醇標準品濃度的降低而降低，呈S形相關，最低檢測限為 lng/L0
β -半乳糖苷酶活性測定方法lmL培養物在室溫6，OOOrpm離心aiiin收集細胞， ImL滅菌蒸餾水重懸，重復洗滌1次(將培養基徹底洗去，避免其干擾)，用ImL預冷的滅菌蒸餾水重懸。取500 μ L菌液補加滅菌蒸餾水到lmL，測定0D6(1(1。另取500 μ L菌液補加滅菌蒸餾水到ImL,再加入100 μ L氯仿、50 μ L 0. 1% SDS, 28°C水浴振蕩5s，加入0. 2mL 4mg/ mL的0NPG，準確計時(T1)。溫育直到黃色出現，加入0. 5mL IM的Na2CO3終止反應，準確記錄終止反應時間(T2)。測定OD42tl和0D55(1。計算β-半乳糖苷酶活性。
β -半乳糖苷酶活性計量單位
Miller Units = [1000X (OD42ci-OD550) X 1· 75]/[0D_X (T2—T1) XV]，其中:V 為所取菌液體積(mL)，Tl、T2以min記。
β -半乳糖苷酶活性倍數
(樣品 Miller Units-溶劑空白組Miller Units) / 培養基空白組Miller Units。
步驟六，將雌激素敏感的基因工程菌株、培養基、誘導劑、裂解劑1、裂解劑2、顯色劑和終止劑包裝即得到試劑盒，試劑盒包括雌激素敏感的基因工程菌株，培養基，誘導劑， 裂解劑1，裂解劑2，顯色劑和終止劑。
實施例2
基因工程試劑盒對多種環境雌激素效應水平的檢測
利用實施例1中得到的試劑盒，對不同環境雌激素樣品和從污水處理廠獲得的污水樣品進行測定，分析樣品的雌激素效應水平。[0062]配制17β-雌二醇、雙酚A、屈和6-0H-屈的不同濃度(1 X 10—1，1 X 10_2，1 X 10_3， 1 X IO"4,1 X 10_5，1 X 10_6，1 X 10_7，1 X 10_8，1 X 10_9，1 X 10_lclmg/mL)的樣品，低溫保存。將從污水處理廠獲得污水污泥樣品用濾紙過濾，以固相萃取方法獲得待測樣品。測定樣品時，將雌激素敏感的基因工程菌株接種到ImL液體培養基中，37°C搖培到0D_約為0. 6時，加入誘導劑1PL(1 1000稀釋)及不同濃度的樣品溶液10 μ L0 37°C搖培誘導1小時。室溫 6，OOOrpm離心^iiin收集細胞，ImL滅菌蒸餾水洗滌后用ImL滅菌蒸餾水重懸。取500 μ L 菌液補加滅菌蒸餾水到lmL，紫外分光光度計上測定0D_。另取500 μ L菌液補加滅菌蒸餾水到ImL,再加入100 μ L裂解劑1、50 μ L裂解劑2，28°C水浴振蕩5s，加入0. 2mL顯色劑， 準確計時(T1)。溫育直到黃色出現，加入0. 5mL終止劑終止反應，準確記錄終止反應時間(T2)。紫外分光光度計測定00_和0055(|。根據標準曲線定量計算半乳糖苷酶活性 =[1000X (OD42tl-OD55tl) XL 75]/[0D_X (Τ2-Τ1) XV]。結果如圖 5-7 和表 1 所示。
圖5DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的雙酚A后β -半乳糖苷酶活性變化。 橫坐標為雙酚A濃度，縱坐標為半乳糖苷酶活性變化倍數。半乳糖苷酶的活性倍數隨雙酚A標準品濃度的降低而降低，呈S形相關，最低檢測限為lng/L。
圖6DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的多環芳烴屈后β -半乳糖苷酶活性變化。橫坐標為多環芳烴屈濃度，縱坐標為半乳糖苷酶活性變化倍數。半乳糖苷酶的活性倍數增長隨屈的濃度降低而逐漸減少，趨勢基本呈S形，最低檢測閾值為lOOng/L。
圖7DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的多環芳烴60H-屈后β -半乳糖苷酶活性變化。橫坐標為多環芳烴60Η-屈濃度，縱坐標為β-半乳糖苷酶活性變化倍數。β-半乳糖苷酶活性倍數增長隨60Η-屈濃度降低而逐漸減少，趨勢基本呈S形，最低檢測閾值為 1 μ g/Lo
表1來源于污水處理廠的污水污泥樣品中麝香類化合物GC/MS含量測定與菌株法測定的雌激素活性比對。兩者趨勢一致，即麝香類化合物含量越多，其半乳糖苷酶活性倍數越高。
表1污水處理不同階段污水與污泥樣品中麝香類化合物的含量及雌激素活性
樣品來源厭氧池污泥缺氧池污泥回流污泥進水一沉池水合成麝香類化合物濃度 (pg/L) (GC/MS)12095901.30.8P-半乳糖苷酶的活性倍數3.02.72.40.10.02
9
權利要求
1.一種檢測環境雌激素類污染物的基因工程試劑盒，其特征在于，其組分為2X104體積份的LB培養基、1體積份的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷、20體積份的氯仿、10體積份的十二烷基硫酸鈉溶液、20體積份的鄰-硝基苯- β -D-半乳糖苷以及100體積份的碳酸鈉溶液；培養大腸埃希氏菌至0D_為0.6。
2.根據權利要求
1所述的檢測環境雌激素類污染物的基因工程試劑盒，其特征是，所述的十二烷基硫酸鈉溶液是指質量百分數濃度為的十二烷基硫酸鈉的水溶液。
3.根據權利要求
1所述的檢測環境雌激素類污染物的基因工程試劑盒，其特征是，所述的碳酸鈉溶液是指濃度為IM的Na2CO3的水溶液。
4.一種根據上述任一權利要求
所述基因工程試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，培養大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DE3 (pLacZMER)；步驟二，向基因工程菌株的培養物中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷并進行誘導處理；步驟三，向基因工程菌株的培養物中依次加入氯仿、十二烷基硫酸鈉和鄰-硝基苯-β -D-半乳糖苷并進行孵育處理后加入碳酸鈉溶液，再置于紫外分光光度計中檢測得到環境雌激素類污染物的含量。
5.根據權利要求
4所述的檢測方法，其特征是，所述的培養是指在37°C環境下采用振蕩搖床以ISOrpm的轉速培養，培養至0D_為0.6。
6.根據權利要求
4所述的檢測方法，其特征是，所述的大腸埃希氏菌DE3(pLacZMER)為包含質粒pLacZMER的大腸桿菌，具有卡那霉素抗性，生長培養基為LB培養基，生長與培養溫度為37度；顯著特征為雌激素加入后會產生顏色反應，且強度與雌激素濃度呈正相關。
7.根據權利要求
4所述的檢測方法，其特征是，所述的誘導處理是指在37°C環境下采用振蕩搖床以ISOrpm的轉速培養1小時。
8.根據權利要求
4所述的檢測方法，其特征是，所述的孵育處理是指在的環境下溫育至培養物的顏色為黃色。
9.根據權利要求
4所定述的檢測方法，其特征是，所述的置于紫外分光光度計中檢測是指采用紫外分光光度計測定OD42tl和OD55tl后根據標準曲線定量計算β -半乳糖苷酶活性=[1000Χ (OD420-OD550) X 1. 75]/[OD600 X (Τ2-Τ1) XV]，并得到環境雌激素類污染物的含量，其中Τ2和Tl分別為反應終止時間和反應起始時間，單位為分鐘；V為所取菌液體積， 單位為mL，OD420, OD550和OD6tltl為光密度，OD = log(l/trans)，trans為檢測物的透光值。
專利摘要
一種境檢測技術領域：
的用于環境雌激素類污染物檢測的基因工程試劑盒及其應用，該試劑盒組分含量為2×104體積份的LB培養基、1體積份的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20體積份的氯仿、10體積份的十二烷基硫酸鈉溶液、20體積份的鄰-硝基苯-β-D-半乳糖苷以及100體積份的碳酸鈉溶液。本發明檢測過程更加簡便快捷，只需2～3小時即可獲得結果；沒有特殊的儀器要求，樣品需要量少，檢測穩定性高，檢測靈敏度可達ng/L；在大大降低了分析成本的同時也提高了分析率。
文檔編號C12R1/19GKCN101975776 B發布類型授權 專利申請號CN 201010516783
公開日2012年6月27日 申請日期2010年10月22日
發明者劉建華, 梁如冰 申請人:上海交通大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (2),