本發明屬于醫(yi)藥技(ji)術(shu)領域，涉及(ji)運(yun)用高效(xiao)液相色譜串聯三重四級桿(gan)質譜快速測定盾葉薯(shu)(shu)蕷中甲基原(yuan)薯(shu)(shu)蕷皂苷含量的方法(fa)。
背景技術：
盾(dun)(dun)(dun)葉(xie)薯(shu)蕷俗稱黃姜、火頭(tou)根(gen)，為(wei)薯(shu)蕷科(ke)（Dioscoreaceae）薯(shu)蕷屬(shu)（Dioscorea）植物盾(dun)(dun)(dun)葉(xie)薯(shu)蕷Dioscorea zingiberensis C. H. Wright的根(gen)狀莖橫生，近圓柱形。以根(gen)狀莖入藥，甘、苦(ku)、平。解毒消(xiao)腫，用(yong)(yong)于癰癤(jie)早期未(wei)破(po)潰，皮膚急性(xing)化膿性(xing)感(gan)染，軟組(zu)織損傷，蜂(feng)螫蟲咬。盾(dun)(dun)(dun)葉(xie)薯(shu)蕷根(gen)莖富含皂(zao)苷(gan)(gan)(gan)(gan)類成分，因其(qi)組(zu)分復雜，且(qie)分離過程難度較大，難以定(ding)量，目(mu)前只能(neng)以總皂(zao)苷(gan)(gan)(gan)(gan)經酸水解，得到皂(zao)苷(gan)(gan)(gan)(gan)元的含量為(wei)測定(ding)指標(biao)來控制(zhi)盾(dun)(dun)(dun)葉(xie)薯(shu)蕷的質(zhi)量。近代藥理學研究表明，盾(dun)(dun)(dun)葉(xie)薯(shu)蕷總皂(zao)苷(gan)(gan)(gan)(gan)有(you)抗(kang)腫瘤、抗(kang)血栓形成、抗(kang)過敏、抗(kang)病毒和抗(kang)休克作用(yong)(yong)。且(qie)盾(dun)(dun)(dun)葉(xie)薯(shu)蕷總皂(zao)苷(gan)(gan)(gan)(gan)中甲基(ji)原(yuan)薯(shu)蕷皂(zao)苷(gan)(gan)(gan)(gan)的含量影響其(qi)質(zhi)量和作用(yong)(yong)效(xiao)果。目(mu)前，甲基(ji)原(yuan)薯(shu)蕷皂(zao)苷(gan)(gan)(gan)(gan)的含量測定(ding)僅有(you)為(wei)HPLC法，提取方(fang)法復雜，費時，且(qie)其(qi)僅在近200nm處有(you)較弱的紫外吸收(shou)，易(yi)產生干(gan)擾。對盾(dun)(dun)(dun)葉(xie)薯(shu)蕷中甲基(ji)原(yuan)薯(shu)蕷皂(zao)苷(gan)(gan)(gan)(gan)質(zhi)譜快速定(ding)量方(fang)法尚未(wei)見報(bao)道。
本(ben)發明(ming)采用(yong)MRM方法，解決了甾體皂(zao)苷類化合物沒有(you)共軛結構(gou)，吸收波長(chang)處于紫外(wai)末(mo)端吸收，以(yi)往HPLC檢(jian)測(ce)基(ji)線不(bu)穩(wen)，靈敏度較(jiao)低，不(bu)易測(ce)定的問題。同時，盾葉(xie)薯(shu)蕷根(gen)莖(jing)中化學成分(fen)復(fu)雜，且皂(zao)苷化學結構(gou)比較(jiao)相近，極性較(jiao)大(da)(da)，HPLC法測(ce)定需(xu)采用(yong)長(chang)時間的梯(ti)度洗(xi)脫程序。本(ben)方法對待測(ce)成分(fen)的分(fen)離要求不(bu)高，因此大(da)(da)大(da)(da)縮(suo)減了洗(xi)脫時間，簡化了操作(zuo)步驟(zou)，為盾葉(xie)薯(shu)蕷的成分(fen)分(fen)析、質(zhi)量評價提供(gong)指導意(yi)義和科學基(ji)礎(chu)。
技術實現要素：
本發明建立了HPLC-QqQ-MS法，以甘草次酸為對照，采用多級反應監測（MRM）法，測定盾葉薯蕷中甲基原薯蕷皂苷的含量。它是采用SHIMADZU GL Inertsil ODS-3 C18（150 mm×4.6 m，5μm）色譜柱，流動相：乙腈：水（70：30），等度洗脫：8min；進樣量：10μL；柱溫：40℃；流速0.5mL/min；掃描方式為多級反應監測（MRM）模式，離子源為ESI（Turbo Spray）源，負離子化方式檢測，離子源電壓為5.5kV；加熱毛細管溫度為400℃；CAD為5；簾氣為10；Gas1為45；Gas2為45；去簇電壓為-114V。用于定量分析的離子反應為m/z 1061.6→915.5（甲基原薯蕷皂苷）、m/z 469.3→425.3（外標甘草次酸）。結果：采用液質聯用法測得, 甲基原薯蕷皂苷質量濃度在9～60μg·mL-1內，線性關系良好，R2 0.9998，平均加樣回收率為90.6%。結論(lun): 所建立方法(fa)快速、簡便(bian)、準確、重現性好，可用(yong)于盾葉薯蕷提取物質量(liang)控制。
為(wei)實現上述目(mu)的，本發明公開了如下(xia)的技術內容：
一種測(ce)定盾(dun)葉(xie)(xie)薯(shu)蕷(yu)中甲基原(yuan)(yuan)薯(shu)蕷(yu)皂(zao)苷含量(liang)的方(fang)法，其(qi)特征(zheng)在于(yu)采用高(gao)效液相(xiang)色譜(pu)串聯三重四級桿(gan)質譜(pu)法，快速測(ce)定盾(dun)葉(xie)(xie)薯(shu)蕷(yu)中甲基原(yuan)(yuan)薯(shu)蕷(yu)皂(zao)苷的含量(liang)，按如(ru)下步驟進行：
（1）對照(zhao)(zhao)品(pin)、內標溶液制(zhi)備(bei)：稱(cheng)取甲(jia)(jia)基原薯(shu)蕷皂(zao)苷對照(zhao)(zhao)品(pin)及甘草(cao)次酸對照(zhao)(zhao)品(pin)各5.0mg分別置于5mL容量瓶中，加甲(jia)(jia)醇溶解并稀釋至刻度，配制(zhi)成濃度為1mg/mL的(de)儲(chu)備(bei)液，4℃保存備(bei)用；
（2）供試(shi)(shi)品溶(rong)液制(zhi)備： 取盾(dun)葉薯蕷(yu)干燥(zao)根莖粉末1g精密稱定(ding)。加入甲醇(chun)25mL, 超聲波處理(li)30min后離心。上清液過微孔(kong)濾(lv)膜, 濾(lv)液即HPLC-QqQ-MS法測定(ding)用(yong)的供試(shi)(shi)溶(rong)液；
（3）測定：
分別精密吸取步驟(zou)（1）得到的對照品溶液(ye)(ye)各10μL，步驟(zou)（2）提取的供試品溶液(ye)(ye)10μL，注(zhu)入HPLC-MS/MS聯用儀，測(ce)定(ding)。多(duo)級(ji)反應檢測(ce)模式進(jin)行掃(sao)描，鎖定(ding)甲基(ji)原薯蕷皂苷結構，用外標法計算甲基(ji)原薯蕷皂苷含量。
本發明中，更(geng)加詳細的(de)制備方(fang)法(fa)及(ji)測定方(fang)法(fa)如下：
1.儀器與試藥
1.1儀(yi)器 LC-20AD液(ye)相色譜系統(tong)(tong)，配備(bei)SIL-20AC自動進樣系統(tong)(tong)和CTO-20A柱溫箱（日本島津公(gong)司(si)）；API 4000 三重四級桿檢(jian)測器，操(cao)作軟件為(wei)Analyst 1.5.1（美國應用生物系統(tong)(tong)有(you)限(xian)公(gong)司(si)）；AL104-1C萬分之一電(dian)(dian)子天平(瑞士(shi)Mettler Tolido公(gong)司(si))；AB 135-S十萬分之一電(dian)(dian)子天平（瑞士(shi)Mettler Tolido公(gong)司(si)）；KQ－100DE型(xing)數控超聲波清洗器（昆山市超市儀(yi)器有(you)限(xian)公(gong)司(si)）； Direct-Q3純水(shui)機 (美國Millipore)。
1.2試藥 對照品(pin)甲(jia)基原(yuan)薯(shu)蕷皂苷（批號：130205） 購(gou)于四(si)川省(sheng)維(wei)克奇生物科技有(you)限公(gong)司(si) 純(chun)度>98% 對照品(pin)甘草次酸（批號：Z110723）購(gou)于上海(hai)源葉(xie)生物科技有(you)限公(gong)司(si) 純(chun)度>98%
乙腈(jing)、甲醇為(wei)（色譜純，TEDIA） 超純水經Milli-Q系統純化制備。
2.方法與結果
2.1色(se)譜(pu)及質(zhi)譜(pu)條件 色(se)譜(pu)柱：SHIMADZU GL Inertsil ODS-3 C18柱（日本島津公司產(chan)品，規格：150 mm×4.6 mm，柱內(nei)徑：5μm）。流(liu)動相：乙腈：水（70：30），等度洗(xi)脫：8min。進樣量：10μL；柱溫：40℃；流(liu)速0.5mL/min。掃描方式(shi)為(wei)多級反(fan)應監(jian)測（MRM）模式(shi)，離(li)子源(yuan)為(wei)ESI(Turbo Spray)源(yuan)，負離(li)子化方式(shi)檢(jian)測，離(li)子源(yuan)電壓為(wei)5.5kV；加熱毛細管溫度為(wei)400℃；CAD為(wei)5；簾氣為(wei)10；Gas1為(wei)45；Gas2為(wei)45；去簇電壓為(wei)-114V。待測成分和外標離(li)子對(dui)質(zhi)量數(shu)及碰撞能量優化結(jie)果見表1。
表1 甲基原薯(shu)蕷皂苷及外標的MRM參數(shu)
2.2溶液的制備
2.2.1對照品(pin)溶(rong)液(ye)的制備(bei)：差量法精(jing)密稱(cheng)取甲基原薯蕷皂苷對照品(pin)及甘草次酸對照品(pin)各5.0mg分別(bie)置于5mL容量瓶中(zhong)，加甲醇溶(rong)解并稀(xi)釋至(zhi)刻度(du)，配制成濃度(du)為1mg/mL的儲備(bei)液(ye)，4℃保存備(bei)用；
2.2.2供試品溶液的制備：取盾葉薯蕷干燥根莖粉末1g精密稱定。加入甲醇25mL, 42kHz超聲波處理30min, 5000r·min-1離心5min。上清液(ye)過0.45μm微孔(kong)濾(lv)膜濾(lv)過, 濾(lv)液(ye)即為(wei)HPLC-MS/MS法測(ce)定用的供試溶液(ye)；
2.3方法學考察
2.3.1線性范圍考察 精密吸取甲基原薯蕷皂苷對照品溶液，置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至各濃度（分別為9.0，18.0，30.0，36.0μg·mL-1)。精密吸取各個濃度10μL, 依次進樣,以進樣濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biao), 待(dai)測(ce)品色譜峰(feng)面積與外標(biao)峰(feng)面積比值為縱坐標(biao), 繪制(zhi)標(biao)準(zhun)曲(qu)線, 甲基原薯蕷皂苷回歸方程見表2。
表2 甲基原薯蕷皂苷(gan)的(de)線(xian)性考察
結果表明，甲基原薯蕷皂苷回歸方程線性關系良好，線性范圍為9～60μg·mL-1。
2.3.2定量限和檢測(ce)限的測(ce)定 取2.2.1項下甲基原薯蕷皂(zao)苷對照品溶液1 mL，逐級稀釋，并依次(ci)進樣10 μL，以S/N=3求得各個(ge)組(zu)分的檢測(ce)限，以S/N=10求得各個(ge)組(zu)分的定量限，結果見(jian)見(jian)表2。
2.3.3 精密度試驗 取2.2.2項(xiang)下樣(yang)品，連續進樣(yang)6次，測定峰面積平均值，計算(suan)精密度RSD值。
2.3.4 重復性 稱(cheng)取(qu)盾(dun)葉薯蕷(yu)藥材粉末6份，按2.2.2項下(xia)方(fang)法制備供試(shi)品溶液，測定峰(feng)面積(ji)，計算含量平均(jun)值(zhi)及(ji)RSD值(zhi)。
2.3.5 穩定(ding)性 取(qu)2.2.2項下制得的供試品溶液，置4℃冰箱存放。分別于0，6，12，18，24 h進樣分析，測定(ding)峰面積，計算穩定(ding)性RSD值。
2.3.6 加(jia)樣(yang)回收率(lv)考察 精密稱取盾葉薯蕷(yu)藥(yao)材粉末6份，加(jia)入對照品甲基薯蕷(yu)皂(zao)苷1.7mg，按(an)2.2.2項下方法制備溶(rong)液，進樣(yang)分析，計算回收率(lv)為(wei)90.6%，RSD為(wei)2.3%。
4. 樣品(pin)測(ce)定(ding)(ding) 按(an)1.2項下對(dui)樣品(pin)進行含(han)量測(ce)定(ding)(ding)，MRM質(zhi)譜圖(tu)見(jian)圖(tu)1。按(an)外標法計算甲基原(yuan)薯蕷皂(zao)苷的含(han)量，結果見(jian)表3。
表3 甲(jia)基薯蕷皂苷含量測定
3. 流動相(xiang)及質譜檢測方法(fa)的確定
3.1 皂苷類成分極性偏大，因此(ci)(ci)本實驗(yan)考察了甲醇－水(shui)、乙腈－水(shui)、甲醇－酸水(shui)和乙腈－酸水(shui)不(bu)同的溶(rong)劑系統(tong)，以(yi)及60%，70%，80%，90%四(si)種比例(li)等度洗脫 及梯度洗脫。結果(guo)表明(ming)80%乙腈－水(shui)系統(tong)的分離效果(guo)較(jiao)好，使(shi)得峰(feng)形良好，且出峰(feng)時間(jian)適(shi)中，相對于梯度洗脫更穩定、簡(jian)便(bian)。因此(ci)(ci)本實驗(yan)選(xuan)擇梯80%乙腈－水(shui)系統(tong)度洗脫方式。
3.2 本(ben)實驗采(cai)用(yong)MRM方法(fa)，解決了(le)甾體皂苷類化合物沒有共(gong)軛結構，吸(xi)收(shou)波長處于紫(zi)外末端吸(xi)收(shou)，以(yi)往HPLC檢測(ce)基線(xian)不(bu)穩，靈敏度(du)較低，不(bu)易測(ce)定的(de)(de)問題。同時(shi)，盾葉(xie)薯蕷(yu)根(gen)莖中(zhong)化學(xue)成(cheng)分(fen)復雜，且皂苷化學(xue)結構比較相(xiang)近，極性較大(da)(da)，HPLC法(fa)測(ce)定需采(cai)用(yong)長時(shi)間(jian)的(de)(de)梯度(du)洗脫(tuo)程序(xu)。本(ben)方法(fa)對待測(ce)成(cheng)分(fen)的(de)(de)分(fen)離要求不(bu)高(gao)，因此大(da)(da)大(da)(da)縮減了(le)洗脫(tuo)時(shi)間(jian)，簡化了(le)操作步(bu)驟，為盾葉(xie)薯蕷(yu)的(de)(de)成(cheng)分(fen)分(fen)析、質量評價提供指導意義和科學(xue)基礎。
本發(fa)明(ming)公開的測定盾葉薯蕷(yu)中甲(jia)基原薯蕷(yu)皂苷含(han)量方法的優點在(zai)于：
（1）經摸索建立了薯蕷皂苷(gan)的高效液相色譜串聯三重四(si)級桿質譜（HPLC-QqQ-MS）測(ce)定(ding)法。研究表明(ming)，選用此(ci)方法，解(jie)決了甾體皂苷(gan)類化合(he)物(wu)沒(mei)有(you)共軛結構(gou)，吸收波長處于紫外(wai)末端吸收，以往HPLC檢測(ce)基線不(bu)(bu)穩，靈敏(min)度較(jiao)低，不(bu)(bu)易(yi)測(ce)定(ding)的問(wen)題。
（2）經方法(fa)(fa)學考察證明，本方法(fa)(fa)操作簡便、準確，重現性好，可(ke)用于盾葉薯蕷的(de)成分分析及質量評價(jia)。