本發明屬于農業技術領域，尤其涉及一種用于評價液體熏蒸劑對蚯蚓急性毒性的方法及裝置。

背景技術：

近年來，由于我國保護地栽培的迅速發展和連年重茬種植，土傳病害問題越來越重，農作物產量和品質受到嚴重影響。土壤熏蒸劑因其防病徹底且增產顯著而備受種植者歡迎，用量逐年上升。土壤熏蒸劑作為具有強揮發性且毒性較高的一類特殊農藥，其環境毒理登記試驗的操作非常困難，目前缺乏一種準確可靠且操作安全、方便的評價方法。

盡管經濟合作發展組織(OECD)、美國國家環境保護局(USEPA)和我國環境保護部專門為了規范環境毒理評價試驗，都對常規農藥進行蚯蚓急性毒性的提供了標準方法，但由于上述方法中建議的試驗裝置為玻璃燒杯而具有強烈揮發性熏蒸劑會在試驗過程中出現大量逃逸，從而引起試驗結果的不準確，同時會對試驗操作人員形成很大的安全威脅。同時，上述方法中建議的土壤含水量為人工干土重的35％左右(即達到飽和含水量或者說相對含水量為100％)，如果直接將上述玻璃裝置燒杯換成一個密閉的玻璃容器進行試驗，空白對照處理的蚯蚓也會短期出現大量死亡，從而導致試驗失敗。目前，亟需摸索試驗出一種專門適用于評價具有強烈揮發性熏蒸劑對蚯蚓急性毒性的準確可靠且操作安全的方法。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種用于室內評價液體土壤熏蒸劑對蚯蚓急性毒性的方法及裝置，本發明的方法及裝置，評價結果準確可靠，而且重復性高；同時本發明方法及裝置具有對試驗操作人員安全、操作簡便快捷而且成本低廉等優點。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種用于評價液體熏蒸劑對蚯蚓急性毒性的方法，包括以下步驟：

1)將自然土壤置于熏蒸裝置中；

2)調節溫度和光照強度，將多個蚯蚓放在步驟1)的自然土壤的表面；

3)待蚯蚓全部鉆入自然土壤中后，將液體熏蒸劑加入到自然土壤中；將熏蒸裝置密封，之后進行熏蒸處理；

4)調查蚯蚓的死亡情況，并計算蚯蚓的死亡率，根據蚯蚓的死亡率來評價熏蒸劑對蚯蚓急性毒性。

本發明的有益效果是：本發明所述的方法具有評價結果準確可靠，而且重復性高；將熏蒸裝置密封，有利于保證熏蒸的效果更加準確，同時避免熏蒸劑從熏蒸裝置逸出對試驗操作人員的健康產生威脅。本發明的方法對試驗操作人員安全、操作簡便快捷而且成本低廉等優點。在步驟2)中是將蚯蚓放在自然土壤的表面，這樣設置可以檢查挑選蚯蚓的活潑和健康程度。如果放于自然土壤表面的蚯蚓在適宜光照和溫度條件(例如：400Lx-800Lx，18-22℃)下可以在15分鐘內鉆入自然土壤中，說明蚯蚓生長健康；如果15分鐘內沒有鉆入自然土壤中，說明蚯蚓不活潑或生長不良，需要更換新的健康蚯蚓重新放入。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，步驟1)中，所述自然土壤的含水量為該自然土壤飽和含水量的30％-80％，優選40％-60％，最佳為50％。

自然土壤這里指的是5年內未施用過化肥或農藥的非耕地土壤。土層深度為0-30cm，剔除大的石塊或雜物后，過篩5mm后備用。

采用上述方案的有益效果是：自然土壤的含水量(即自然土壤的濕度)過大或過低均不利于蚯蚓在密閉環境中的存活。從而會影響檢測結果的準確性。合適的自然土壤的含水量，可以保證蚯蚓可以自然存活4周(即4w)以上。盡可能的排除外生存條件對蚯蚓致死的影響。試驗應調節自然土壤的相對含水量至30.0％-80.0％，在40.0％-60.0％范圍內更好，最佳為50.0％。

進一步，步驟1)中，按照下述的比例加入自然土壤：每0.3L-5L容積的熏蒸裝置加入自然土壤的重量為100g-4000g。

采用上述方案的有益效果是：采用上述的比例，一方面有利于保證蚯蚓在空白對照自然土壤中正常存活,另一方面確保熏蒸劑發揮最佳的熏蒸效果,如果自然土壤過多，容易導致密閉容器中空氣不足,從而導致蚯蚓非正常死亡問題，如果熏蒸裝置容積過大，容易導致熏蒸劑施藥不勻,從而導致室內熏蒸過程中藥劑擴散不勻問題。

進一步，步驟2)中，按照下述的比例加入蚯蚓：每0.3L-5L容積的熏蒸裝置加入5-30條蚯蚓。

采用上述方案的有益效果是：采用上述的比例，有利于蚯蚓在合適的密度下生存，如果熏蒸裝置容積過大，容易導致熏蒸劑施藥不勻,從而導致室內熏蒸過程中藥劑擴散不勻問題；如果蚯蚓數量過多，容易導致蚯蚓因生存空間不足相互競爭引發非正常死亡問題。

進一步，步驟2)中，溫度為18℃-22℃。

采用上述方案的有益效果是：采用上述的溫度，可以避免蚯蚓因培養溫度的不合適失水死亡，從而使檢測結果更加準確。

進一步，步驟2)中，光照強度為400Lx-800Lx。

采用上述方案的有益效果是：采用上述的光照強度，可以避免蚯蚓因光照強度的不合適導致意外死亡，從而使檢測結果更加準確。

進一步，步驟3)中，熏蒸處理的時間為3-21天。

采用上述方案的有益效果是：合適的熏蒸處理的時間有利于提高檢測結果的準確性；如果時間過長，蚯蚓因養分不夠或其他條件死亡，使檢測的蚯蚓的死亡率偏高；如果時間過短，熏蒸劑還沒有來的及發揮作用，使檢測的蚯蚓的死亡率偏低。

進一步，根據死亡率判斷熏蒸劑的急性毒性的具體標準為：劇毒，致死中濃度LC₅₀≤0.1mg a.i./Kg_干土；高毒，0.1mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤1.0mg a.i./Kg_干土；中毒，1.0mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤10mg a.i./Kg_干土；低毒，LC₅₀>10mg a.i./Kg_干土。其中，mg a.i./Kg干土指的是每千克干土中熏蒸劑有效成分的含量(mg)。LC₅₀是指半數致死濃度，即暴露周期內，殺死50％受試蚯蚓的含有受試物質的有效成分的濃度，即每千克干土中熏蒸劑有效成分的質量。

進一步，所述蚯蚓選自赤子愛勝蚯蚓、日本杜拉蚓、無錫杜拉蚓、直隸環毛蚓、湖北環毛蚓、透明環毛蚓、狀重環毛蚓、夏威環毛蚓、白頸環毛蚓、舒脈環毛蚓、毛利環毛蚓中的任一種或幾種。

進一步，所述熏蒸劑為液體類熏蒸劑，所述熏蒸劑選自氯化苦、碘甲烷、威百畝、糠醛、二甲基二硫、1，3-二氯丙烯、甲醛、乙醇、異硫氰酸烯丙酯或甲酸乙酯中的任一種或幾種。

本發明提供一種實現上述用于評價液體熏蒸劑對蚯蚓急性毒性的方法的裝置，包括：溫控裝置、光源裝置、熏蒸裝置和加樣裝置，所述溫控裝置用于控制整個裝置所在環境的溫度，所述光源裝置位于熏蒸裝置的上方，為整個裝置提供光源；所述熏蒸裝置內部可用于盛放自然土壤，自然土壤用于放置蚯蚓；所述加樣裝置用于將液體熏蒸劑加入到自然土壤中；

所述熏蒸裝置包括容器蓋和容器主體，容器蓋蓋合在容器主體的開口處，容器蓋可以打開或密閉容器主體。

采用上述方案的有益效果是：本發明所述的裝置具有評價結果準確可靠，而且重復性高等優點。溫控裝置和光源裝置為蚯蚓提供合適的培養條件，排除因條件不適導致的蚯蚓意外死亡。

在使用時，容器蓋可以密閉容器主體，有利于保證熏蒸的效果更加準確，同時避免熏蒸劑從熏蒸裝置逸出對試驗操作人員的健康產生威脅。本發明的裝置對試驗操作人員安全、操作簡便快捷而且成本低廉等優點。

進一步，還包括組合架，所述組合架分成上下設置的多層，每層均放置有多個熏蒸裝置，光源裝置為多個，多個光源裝置分別固設在每層的組合架上。

采用上述方案的有益效果是：通過組合架的設置可以在有限的空間內設置多個實驗組和對照組，可以保證實驗結果的準確性。

多個光源裝置分別固設在每層的組合架上，可以保證每個熏蒸裝置的光照條件是相同的，避免因光照不均導致的實驗誤差。

進一步，組合架為鐵制或不銹鋼制。

采用上述方案的有益效果是：具有結實、耐用且不生銹的優點。

進一步，當容器蓋密閉容器主體時，容器蓋與容器主體的連接處通過油脂類物質密封。

采用上述方案的有益效果是：可以進一步提高密封效果。

進一步，所述密封時用的油脂類物質為白凡士林或黃凡士林。

采用上述方案的有益效果是：進一步提高密封效果。

進一步，所述熏蒸裝置為透明玻璃制的廣口瓶或普通干燥器。

采用上述方案的有益效果是：采用透明玻璃的材質的熏蒸裝置有利于熏蒸過程中隨時觀察到藥劑處理后蚯蚓的行為癥狀,比如從自然土壤中逃逸、在自然土壤表面腐爛或在容器內壁亂爬等。

進一步，所述自然土壤的含水量為該自然土壤的飽和含水量的30％-80％，優選40％-60％，最佳為50％。

進一步，每0.3L-5L容積的熏蒸裝置盛有的自然土壤的重量為100g-4000g；每100g-4000g自然土壤可放入的蚯蚓的數目為5-30條

上述裝置可以適用于各種蚯蚓，例如：所述蚯蚓可以選自赤子愛勝蚯蚓、日本杜拉蚓、無錫杜拉蚓、直隸環毛蚓、湖北環毛蚓、透明環毛蚓、狀重環毛蚓、夏威環毛蚓、白頸環毛蚓、舒脈環毛蚓、毛利環毛蚓中的任一種或幾種。

上述裝置可以適用于各種液體熏蒸劑，例如：所述液體熏蒸劑選自氯化苦、碘甲烷、威百畝、糠醛、二甲基二硫、1，3-二氯丙烯、甲醛、乙醇、異硫氰酸烯丙酯或甲酸乙酯中的任一種或幾種。

附圖說明

圖1為本發明所述一種用于室內評價液體類土壤熏蒸劑對蚯蚓急性毒性的裝置的結構示意圖(加樣裝置并未畫出)。

附圖中，各標號所代表的部件列表如下：

1、溫控裝置，2、光源裝置，3、組合架，4、容器蓋，5、容器主體，6、自然土壤，7、蚯蚓。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。

一種用于評價液體熏蒸劑對蚯蚓急性毒性的方法，包括以下步驟：

1)將自然土壤置于熏蒸裝置中；

2)調節溫度和光照強度，將多個蚯蚓放在步驟1)的自然土壤的表面；

3)待蚯蚓全部鉆入自然土壤中后，利用加樣裝置將液體熏蒸劑加入到自然土壤中；將熏蒸裝置密封，之后進行熏蒸處理；

4)調查蚯蚓的死亡情況，并計算蚯蚓的死亡率，根據蚯蚓的死亡率來評價熏蒸劑對蚯蚓急性毒性。

上述方法中，各步驟具體的控制參數如下：

步驟1)中，所述自然土壤的含水量為該自然土壤飽和含水量的30％-80％，優選40％-60％，最佳為50％。步驟1)中，按照下述的比例加入自然土壤：每0.3L-5L容積的熏蒸裝置加入自然土壤的重量為100g-4000g。

步驟2)中，按照下述的比例加入蚯蚓：每0.3L-5L容積的熏蒸裝置加入5-30條。步驟2)中，溫度為18℃-22℃。步驟2)中，光照強度為400Lx-800Lx。

步驟3)中，熏蒸處理的時間為3-21天。

上述方法中，根據死亡率判斷熏蒸劑的急性毒性的具體標準為：劇毒，致死中濃度LC₅₀≤0.1mg a.i./Kg_干土；高毒，0.1mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤1.0mga.i./Kg_干土；中毒，1.0mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤10mg a.i./Kg_干土；低毒，LC₅₀>10mga.i./Kg_干土。

本發明還提供一種實現上述方法的用于室內評價液體類土壤熏蒸劑對蚯蚓急性毒性的裝置。

如圖1所示，一種用于室內評價液體類土壤熏蒸劑對蚯蚓急性毒性的裝置包括：溫控裝置1、光源裝置2、熏蒸裝置和加樣裝置，熏蒸裝置包括容器蓋4和容器主體5，容器蓋4蓋合在容器主體5的開口處，容器蓋4可以打開或密閉容器主體5；所述溫控裝置1用于控制整個裝置所在環境的溫度；所述光源裝置2位于容器的上方，為整個裝置提供光源；所述熏蒸裝置內部盛有已人工調節至合適含水量的自然土壤6，自然土壤6可放置一定數量健康并生長一致的蚯蚓7，熏蒸裝置用油脂類物質密封。所述加樣裝置用于將液體熏蒸劑加入到自然土壤中，加樣裝置可以為注射器、移液槍或者其他加樣的器具。溫控裝置1可以為溫箱或溫室，光源裝置2可以為燈棍或燈泡等室燈。

為了進一步提高空間的利用率以及方便在同一批次設置多個樣品的檢測，上述裝置還包括組合架3，所述組合架3分成上下設置的多層，每層均放置有多個熏蒸裝置，光源裝置為多個，多個光源裝置分別固設在每層的組合架上。在具體設置組合架3時，組合架3為鐵制或不銹鋼制。組合架3包括頂板、底板以及位于頂板和底板之間的多個隔板。多個隔板沿著豎直方向設置。每個隔板以及底板均放置有多個熏蒸裝置。光源裝置固定在頂板處以及隔板處。凡是有熏蒸裝置的一層均有一個光源裝置，保證光源裝置能夠照射到熏蒸裝置，并且每層熏蒸裝置得到光照是相同的。

為了進一步提高分離效率，所述熏蒸裝置為透明玻璃制的廣口瓶或普通干燥器,容積為0.3L-5L,密封用油脂類物質為白凡士林或黃凡士林；所述自然土壤的重量為100g-4000g；溫控裝置1提供的溫度為18℃-22℃；光照強度為400Lx-800Lx。

結合上述的裝置，在進行用于室內評價液體類土壤熏蒸劑對蚯蚓急性毒性時,具體操作步驟為：

1)人工調節提前風干的自然土壤，其含水量為該自然土壤飽和含水量的30％-80％，優選40％-60％，最佳為50％，其中自然土壤中的水為蒸餾水或去離子水，之后稱取一定重量的上述含水量的自然土壤并置于熏蒸裝置的容器主體中，按照下述的比例加入自然土壤：每0.3L-5L容積的熏蒸裝置加入自然土壤的重量為100g-4000g；

2)開啟溫控裝置和光源裝置，調節溫度，使溫度為18℃-22℃，調節光源使光照強度為400Lx-800Lx，之后挑選一定數量健康并生長一致的蚯蚓放在自然土壤的表面，按照下述的比例加入蚯蚓：每0.3L-5L容積的熏蒸裝置加入5-30條蚯蚓；

3)待蚯蚓全部鉆入自然土壤6中后，利用加樣裝置準確移取一定體積的液體熏蒸劑注射到自然土壤6中，之后迅速用油脂類物質將熏蒸裝置密封；之后進行熏蒸處理，熏蒸處理的時間為3-21天；

4)熏蒸結束后，打開熏蒸裝置調查蚯蚓的死亡情況，并計算蚯蚓的死亡率，根據蚯蚓的死亡率來評價熏蒸劑對蚯蚓急性毒性。

根據死亡率判斷熏蒸劑的急性毒性的具體標準為：劇毒，致死中濃度LC₅₀≤0.1mg a.i./Kg_干土；高毒，0.1mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤1.0mg a.i./Kg_干土；中毒，1.0mg a.i./Kg_干土<LC₅₀≤10mg a.i./Kg_干土；低毒，LC₅₀>10mg a.i./Kg_干土。

本發明所述的裝置和方法適用于各種蚯蚓，例如：赤子愛勝蚯蚓、日本杜拉蚓、無錫杜拉蚓、直隸環毛蚓、湖北環毛蚓、透明環毛蚓、狀重環毛蚓、夏威環毛蚓、白頸環毛蚓、舒脈環毛蚓、毛利環毛蚓中的任一種或幾種。

本發明所述的裝置和方法適用于各種液體類熏蒸劑，例如：氯化苦、碘甲烷、威百畝、糠醛、二甲基二硫、1，3-二氯丙烯、甲醛、乙醇、異硫氰酸烯丙酯或甲酸乙酯中的任一種或幾種。

下面以赤子愛勝蚯蚓為例進行具體介紹。

實施例1

以赤子愛勝蚯蚓(Eisenia foetida)為例，利用上述裝置評價了液體土壤熏蒸劑質量百分數為42％的威百畝水劑(密度＝1.21g/mL)對蚯蚓的急性毒性，具體如下：

1)人工調節提前風干的自然土壤至飽和含水量的50.0％，分別稱取1000g上述自然土壤置于容積為2.5L的普通干燥器中；

2)調節溫度為18℃；光照強度為400Lx。每容器中放入15條生長健康一致的環帶明顯的赤子愛勝蚯蚓；

3)待蚯蚓全部鉆入自然土壤中后，按照設置的梯度濃度12.0、6.0、3.0、1.5、0.75、0.38、0.19mg ai/kg_干土分別將相應體積的威百畝液體制劑注射入自然土壤中，之后迅速涂抹凡士林并密閉容器，并設置空白對照處理，每個處理4次重復；

4)分別于熏蒸處理1w、2w后，調查蚯蚓的死亡率；

5)使用DPS軟件對毒力回歸方程進行擬合，求LC₅₀和LC₉₀值，具體數據見表1和表2。

表1

表2

通過試驗可以發現：1)空白對照處理蚯蚓死亡率在1w、2w均為0.0％，說明該方法可以很好的保證蚯蚓的自然存活；2)通過死亡率調查和毒力回歸方程進行擬合后發現相關系數r分別為0.95和0.90，說明擬合較好。同時可以分別得到42％威百畝水劑對赤子愛勝蚯蚓在1w和2w的LC₅₀和LC₅₀值分別為0.84和0.39mg ai/Kg_干土，高毒性。

根據表1和表2中的數據可以看出，本發明所述的裝置和方法具有評價結果準確可靠而且重復性好，同時操作簡便快捷，對操作人員安全等優點。

實施例2

發明人在實施例1的基礎上，調整了熏蒸裝置的容積為0.3L，自然土壤的重量為100g，蚯蚓的數目為5條。培養溫度為22℃，光照強度為800Lx，熏蒸時間為3天。其余操作均與實施例1相同。

實施例3

發明人在實施例1的基礎上，調整了熏蒸裝置的容積為5L，自然土壤的重量為4000g，蚯蚓的數目為30條。培養溫度為20℃，光照強度為500Lx，熏蒸時間為21天。其余操作均與實施例1相同。

經實施例2和實施例3的驗證，也能得到與實施例1類似的結果。綜上所述，本發明所述的裝置和方法均具有評價結果準確可靠而且重復性好，同時操作簡便快捷，對操作人員安全等優點。

發明人還進一步提供了下面的實施例來證明本發明所述方法的優越性。

以赤子愛勝蚯蚓(Eisenia foetida)為例，利用上述裝置，評價不同自然土壤濕度對蚯蚓存活的影響，具體如下：

1)人工調節提前風干的自然土壤至系列濕度：調節后的自然土壤分別為自然土壤飽和含水量的100％、90.0％、80.0％、70.0％、60.0％、50.0％、40.0％、30.0％、20.0％、10.0％，分別稱取1000g上述自然土壤置于容積為2.5L的普通干燥器中，每個處理4次重復；

2)調節溫度為18℃-22℃；光照強度為400Lx-800Lx。每容器中放入15條生長健康一致的環帶明顯的赤子愛勝蚯蚓；

3)待蚯蚓全部鉆入自然土壤中后，之后涂抹凡士林密閉容器；

4)分別于熏蒸處理2w、4w、6w、8w后，調查蚯蚓的死亡率，具體試驗數據見表3。

表3

試驗結果表明:濕度過大或過低均不利于蚯蚓在密閉環境中的存活。在4w時，30.0％-80.0％的相對含水量處理蚯蚓死亡率均為0.0％，其余處理的死亡率均超過10％；在6w時，只有40.0％-60.0％的相對含水量處理的蚯蚓死亡率低于10％，其余處理的蚯蚓死亡率均高于10％，其中50.0％的相對含水量處理的蚯蚓死亡率最低，仍為0.0％；在8w時，只有50.0％的相對含水量處理的蚯蚓死亡率低于10％，其余處理的蚯蚓死亡率均高于10％。因為藥劑對蚯蚓急性毒性試驗通常進行1w和2w進行調查。為保證試驗方法的可靠性，只有保證蚯蚓可以自然存活4w，因此，試驗應調節自然土壤的相對含水量至30.0％-80.0％，優選40.0％-60.0％，最佳為50.0％。

發明人也采用了其他種類的液體熏蒸劑，例如氯化苦、碘甲烷、威百畝、糠醛、二甲基二硫、1，3-二氯丙烯、甲醛、乙醇、異硫氰酸烯丙酯或甲酸乙酯中的任一種或幾種，發現具有評價結果準確可靠而且重復性好，同時操作簡便快捷，對操作人員安全等優點。

發明人也采用了其他種類的蚯蚓進行試驗，例如：日本杜拉蚓、無錫杜拉蚓、直隸環毛蚓、湖北環毛蚓、透明環毛蚓、狀重環毛蚓、夏威環毛蚓、白頸環毛蚓、舒脈環毛蚓、毛利環毛蚓等，也能得到類似的結果。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。