一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統及方法
【專利摘要】本發明公開了一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統，是基于共軸邁克爾孫干涉光路和米勞干涉裝置，樣品位于載物臺上，載物臺為一半透半反鏡，反射光束通過米勞干涉裝置在邁克爾孫干涉光路上產生干涉，由顯微鏡得到放大的干涉圖像，從圖像可以提取樣品的相位信息。同時，通過樣品的前向透射光束經過半透半反鏡面后，產生前向小角和大角散射，該散射圖像可由前向CCD接收，從中可獲取前向散射幅值分布，由散射理論可以解構樣品的大小。本發明裝置通過集成相位和散射信息可更加準確地檢測樣品的形態結構，在透明物體顯微形態測量方面具有重要的實用價值，特別是在生物細胞亞結構形態的檢測應用領域。
【專利說明】一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統及方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物細胞原態顯微成像【技術領域】，具體涉及一種綜合接收和分析干涉 信息和散射信息的顯微成像系統。

【背景技術】
[0002] 大部分細胞雖然常常被認為是無色透明的，但是從嚴格意義上講，不可能是完全 透明的，即不可能是純相位物體，因此當光透過細胞后，光的振幅和相位都會發生改變，透 過細胞的光的振幅和相位都包含了細胞的信息。相位成像檢測技術從細胞對入射光波的相 位調制量中去獲取細胞的信息，而光散射檢測技術則是從細胞對入射光的振幅調制量入手 得到細胞的信息。因此從理論上說，相位成像檢測技術與光散射檢測技術研究的是透過細 胞的光信息的兩個方面，既相互獨立又相互聯系，互為補充。
[0003] 現有的大部分相位成像檢測技術都是基于干涉法，可實現物體的全場成像，不僅 其橫向空間分辨率高，一般只受衍射極限的限制，而且其軸向分辨率高，可達亞波長量級， 適用于無散射物體或弱散射物體的檢測。根據兩干涉光（物光波和參考光波）在記錄平 面是否存在夾角，可以分為同軸式和離軸式。典型的同軸定量相位成像技術包括Gabriel Popescu教授研究小組2004年提出并發展起來的傅立葉相位顯微技術（FPM)，由杜克大學 Adam Wax教授研究小組提出的平行同軸全息相位顯微術，等等，同軸定量相位成像技術具 有較好的穩定性，能夠抑制一定的相位噪聲，但是一般需要多次測量；典型的離軸定量成像 技術包括希爾伯特相位顯微術（HPM)，衍射相位顯微術（DPM)，兩步相移雙通道干涉等等， 此類成像技術成像速度快，但是需要大的CCD空間寬帶。近年來，Adam Wax教授提出了輕 微離軸干涉（Slightly Off-Axis Interference),此技術介于離軸干涉與同軸干涉之間， 相比離軸干涉需要更小的CCD空間寬帶，相比同軸干涉需要更少的測量，優化了空間分辨 率。2006年Gabriel Popescu教授研究小組提出衍射相位顯微術（DPM)，它結合了離軸光 路和共軸光路的優點：具有較好的穩定性和高的采集速率，但是由于光源的原因，衍射相 位顯微技術（DPM)的圖像存在散斑，這將會降低空間相位的敏感度，并限制了其在細胞亞 結構研究中的應用，2011年同樣是由Gabriel Popescu教授研究小組提出空間光干涉技 術（SLIM)采用白光作為光源克服了散斑效應，但是此技術需要為每個定量相位圖采集四 幅強度圖像。之后，2012年Gabriel Popescu研究小組提出用白光作光源的衍射相位顯 微技術（wDPM)，以及其 2014 年發表的專利技術 US 2014/0085715A1 (Diffraction phase microscopy with white light:白光光源的衍射相位顯微技術）實現了單次拍攝以及高的 時間和空間上的靈敏性。但是以上提及的技術都是獲取樣品的干涉信息，僅僅可檢測透明 相位體樣品，對樣品的亞結構尚存在檢測困難。
[0004] 光散射檢測技術一般不需要干涉，直接測量的是散射強度分布、散射能量分布或 光強的衰減等，它提供的信息是測量體積內的平均值，平均化了單個成分對散射的貢獻，樣 品亞結構形態對其散射影響較大，所以在細胞大小測量方面有著重要的應用，如專利技術 W0 2014/084957 A1 (Optical system, apparatus and method for flow-cytometry:流式 細胞儀的光學系統，裝置和方法），但是，此類技術對于細胞形態變化的定量測量，只是從散 射方面分析，不涉及干涉信息。
[0005] 本發明主要針對上述兩類技術存在的不足，發明了可同時接收樣品光散射和相位 顯微信息的裝置，應用該裝置可根據不同模型和算法計算，最終可得到高精確度的細胞亞 結構形態結果。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統及方法， 使之能夠綜合分析物體的干涉信息和散射信息，更加精確地獲得物體的亞結構形態。
[0007] 為了解決以上技術問題，本發明采用的具體技術方案如下： 一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統，其特征在于包括：共軸邁克爾孫干 涉光路和米勞干涉裝置，具體為： 所述的米勞干涉裝置由第三透鏡（7)、反光鏡（8)、第二分光鏡（9)組成；經過所述米 勞干涉裝置的圖像經顯微鏡（14)放大后，由干涉圖像接收器即(XD-2 (16)接收為數字相位 圖像并由計算機（17)進行數值計算和處理； 所述的邁克爾孫干涉光路由光源（1)、第一分光鏡（6)、反光鏡（8)、第二分光鏡（9)、載 物臺（10)組成；還包括由第四透鏡（11)和第五透鏡（12)組成的透鏡擴束準直系統、散射 強度接收器即CCD-1 (13)、干涉圖像接收器即CCD-2 (16)、顯微鏡（14)、第六透鏡（15)、用于 對散射信息和相位信息進行采集存儲和處理的計算機（17); 所述載物臺（10)為一個角度可調的半透半反鏡，與反光鏡（8)夾角可調，可實現同軸、 離軸和輕微離軸干涉的光路調節； 所述的載物臺（10)是半透半反鏡，以保證經過樣品的散射光可以透過載物臺向下傳 輸； 第一分光鏡（6)與水平面成45度夾角；第二分光鏡（9)的擺放位置保證使載物臺（10) 的反射光與反光鏡（8)的反射光所經過的路程相等；反光鏡（8)放在第三透鏡（7)下面的 中心位置，其尺寸在能保證發生反射的基礎上越小越好。
[0008] 根據所述的一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統的顯微成像方法，其 特征在于包括以下步驟： 步驟一，使光源（1)的光束經由第一透鏡（2)、視場光闌（3)、第二透鏡（4)、孔徑光闌 (5)組成的光束整形系統后，傳輸至第一分光鏡（6);所述第一分光鏡（6)的反射光通過第 三透鏡（7)傳輸到第二分光鏡（9)，光束由第二分光鏡（9)分成兩部分：一部分反射到反光 鏡（8)上，一部分透射到樣品上；透射到樣品上的光束經載物臺（10)時，一部分發生反射得 反射光，所述反射光再次通過樣品之后和反光鏡（8)的反射光相遇產生干涉，先后經第三 透鏡（7)、第一分光鏡（6)、顯微鏡（14)和第六透鏡（15)，在CCD-2 (16)上形成顯微干涉圖 像；所述顯微干涉圖像經計算機（17)處理后得到反映樣品形態結構的相位分布信息； 步驟二，利用第二分光鏡（9)透射到樣品上的光經載物臺（10)時一部分光透過載物臺 (10)得透射光；所述透射光即包含樣品的散射信息，經第四透鏡（11)、第五透鏡（12)組成 的透鏡擴束準直系統，所述散射信息由CCD-1 (13)接收為數字圖像并由計算機（17)進行數 值計算得散射強度并處理得反映樣品大小的散射幅值分布信息； 步驟三，計算機（17)對所述步驟一得到的干涉信息和步驟二得到的散射信息，基于散 射理論和相位成像理論開展計算，最終可獲得相位體樣品形態、結構和大小信息。
[0009] 本發明的工作原理如下： 由光源1發出的光束，向前傳輸經由第一透鏡2、視場光闌3、第二透鏡4、孔徑光闌5 組成的光束整形系統后，傳輸至第一分光鏡6,所述第一分光鏡6的反射光繼續向下傳播， 經第三透鏡7傳輸至第二分光鏡9,所述第二分光鏡9將光束分為兩部分，一部分反射到反 光鏡8上，一部分透射到樣品上：透射到樣品上的光一部分發生反射，這部分反射光和反光 鏡8的反射光在第二分光鏡9處相遇并發生干涉，之后經第三透鏡7、第一分光鏡6、顯微鏡 14、第六透鏡15,由（XD-2 16接收顯微干涉圖樣；透射到樣品上的光還有一部分透過半透 半反鏡的載物臺，經第四透鏡11、第五透鏡12組成的透鏡擴束準直系統，由（XD-1 13收集 樣品散射強度信息。最后計算機17對得到的干涉信息和散射信息，基于散射理論和相位成 像理論開展計算，最終可獲得高精確度的相位體樣品形態、結構和大小信息。
[0010] 本發明具有有益效果。本發明光源采用低相干白光源，提高分辨率，減少噪聲；本 發明采用共軸邁克爾孫干涉光路，提高了實驗的穩定性；本發明載物臺為一角度可調的半 透半反鏡，能保證包含樣品散射信息的散射光可以透過載物臺繼續傳輸，并且與反光鏡角 度可調，可實現同軸、離軸和輕微離軸干涉的光路調節。本發利用CCD-1 13采集樣品散射 強度、CCD-2 16接收顯微干涉圖像，使計算機可以綜合分析散射信息和干涉信息，得到具有 高精確度的相位體樣品形態、結構和大小信息；本發明的顯微物鏡位于干涉系統之后，可減 少相位噪聲。因此，本發明系統應用面廣，具有很強的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是本發明集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統對應的光路示意圖。
[0012] 圖中：1.光源；2.第一透鏡；3.視場光闌；4.第二透鏡；5.孔徑光闌；6.第一分 光鏡；7.第三透鏡；8.反光鏡；9.第二分光鏡；10.載物臺；11.第四透鏡；12.第五透鏡； 13. CCD-1 ;14.顯微鏡；15.第六透鏡；16. CCD-2 ;17.計算機。

【具體實施方式】
[0013] 下面結合附圖，對本發明的技術方案做進一步詳細說明。
[0014] 本發明的集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統，是通過共軸邁克爾孫光路 和米勞干涉儀實現的，如圖1所示。
[0015] 由光源1發出的光束，向前傳輸經第一透鏡2、視場光闌3、第二透鏡4、孔徑光闌 5組成的光束整形系統，到達第一分光鏡6,所述第一分光鏡6的反射光經第三透鏡7傳輸 至第二反光鏡9,光束由第二分光鏡9分成兩部分，一部分反射到反光鏡8上，一部分透射 到樣品上：透射到樣品上的光一部分發生反射，這部分反射光和反光鏡8的反射光在第二 分光鏡9處相遇并發生干涉，之后經第三透鏡7、第一分光鏡6、顯微鏡14、第六透鏡15,由 CCD-2 16接收顯微干涉圖像，并存儲在計算機17中；透射到樣品上的光還有部分透過半透 半反鏡的載物臺10繼續向下傳輸，經第四透鏡11、第五透鏡12組成的透鏡擴束準直系統， 在CCD-1 13上采集散射強度，并存儲在計算機17中。最后計算機17根據得到的樣品顯微 干涉圖像和散射強度信息，基于散射理論和相位成像理論開展計算，最終可獲得相位體樣
【權利要求】
1. 一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統，其特征在于包括：共軸邁克爾孫 干涉光路和米勞干涉裝置，具體為： 所述的米勞干涉裝置由第三透鏡（7)、反光鏡（8)、第二分光鏡（9)組成；經過所述米勞 干涉裝置的圖像經顯微鏡（14)放大后，由干涉圖像接收器即(XD-2 (16)接收為數字相位圖 像并由計算機（17)進行數值計算和處理； 所述的邁克爾孫干涉光路由光源（1)、第一分光鏡（6)、反光鏡（8)、第二分光鏡（9)、載 物臺（10)組成；還包括由第四透鏡（11)和第五透鏡（12)組成的透鏡擴束準直系統、散射 強度接收器即CCD-1 (13)、干涉圖像接收器即CCD-2 (16)、顯微鏡（14)、第六透鏡（15)、用于 對散射信息和相位信息進行采集存儲和處理的計算機（17); 所述載物臺（10)為一個角度可調的半透半反鏡，與反光鏡（8)夾角可調，可實現同軸、 離軸和輕微離軸干涉的光路調節； 所述的載物臺（10)是半透半反鏡，以保證經過樣品的散射光可以透過載物臺向下傳 輸； 第一分光鏡（6)與水平面成45度夾角；第二分光鏡（9)的擺放位置保證使載物臺（10) 的反射光與反光鏡（8)的反射光所經過的路程相等；反光鏡（8)放在第三透鏡（7)下面的 中心位置，其尺寸在能保證發生反射的基礎上越小越好。
2. 根據權利要求所述的一種集成光干涉和散射信息分析的顯微成像系統的顯微成像 方法，其特征在于包括以下步驟： 步驟一，使光源（1)的光束經由第一透鏡（2)、視場光闌（3)、第二透鏡（4)、孔徑光闌 (5)組成的光束整形系統后，傳輸至第一分光鏡（6);所述第一分光鏡（6)的反射光通過第 三透鏡（7)傳輸到第二分光鏡（9)，光束由第二分光鏡（9)分成兩部分：一部分反射到反光 鏡（8)上，一部分透射到樣品上；透射到樣品上的光束經載物臺（10)時，一部分發生反射得 反射光，所述反射光再次通過樣品之后和反光鏡（8)的反射光相遇產生干涉，先后經第三 透鏡（7)、第一分光鏡（6)、顯微鏡（14)和第六透鏡（15)，在CCD-2 (16)上形成顯微干涉圖 像；所述顯微干涉圖像經計算機（17)處理后得到反映樣品形態結構的相位分布信息； 步驟二，利用第二分光鏡（9)透射到樣品上的光經載物臺（10)時一部分光透過載物臺 (10)得透射光；所述透射光即包含樣品的散射信息，經第四透鏡（11)、第五透鏡（12)組成 的透鏡擴束準直系統，所述散射信息由CCD-1 (13)接收為數字圖像并由計算機（17)進行數 值計算得散射強度并處理得反映樣品大小的散射幅值分布信息； 步驟三，計算機（17)對所述步驟一得到的干涉信息和步驟二得到的散射信息，基于散 射理論和相位成像理論開展計算，最終可獲得相位體樣品形態、結構和大小信息。
【文檔編號】G01N21/45GK104122228SQ201410331575
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月14日 優先權日:2014年7月14日
【發明者】季穎, 梁敏捷, 王亞偉, 徐媛媛 申請人:江蘇大學