萊克多巴胺分子印跡spr傳感器芯片及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及SPR傳感器芯片領域，具體而言，涉及萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片及其制備方法。該萊克多巴胺分子印跡SPR芯片，所述萊克多巴胺分子印跡SPR芯片以萊克多巴胺分子印跡聚合物、石墨烯納米金、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽為芯片基底修飾物。本發明萊克多巴胺分子印跡SPR芯片對萊克多巴胺有高特異性吸附能力，對樣品中低濃度的萊克多巴胺有著明顯的響應信號變化。采用本發明制備的萊克多巴胺分子印跡SPR芯片分析萊克多巴胺殘留，步驟簡單，分析時間短，對低濃度下分析有較高的準確性和靈敏度。
【專利說明】萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及SPR傳感器芯片領域，具體而言，涉及萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片及其制備方法。
【背景技術】
[0002]萊克多巴胺是一種苯酚型的受體激動劑，可以引起交感神經興奮，在醫學臨床上用于治療充血性心力衰竭癥和肌肉萎縮癥，可增長肌肉，減少脂肪沉積；但其在超過治療劑量的5 —10倍用于家畜飼養時，可以顯著促進動物蛋白質沉積，提高飼料報酬，食用此類動物產品時會對人體健康帶來危害，各種均制定了嚴格的標準控制其違法濫用，其中中國禁止使用任何β_激動劑類藥物作為飼料添加劑，美國允許使用萊克多巴胺，豬肉中殘留限量50ng/g,牛肉中為30ng/g。
[0003]當前，分析β_激動劑類藥物殘留的主要方法是液相色譜及其聯用技術。但由于其殘留濃度低，動物樣品前處理繁瑣和基體干擾大，嚴重限制了常規快速檢測方法和儀器分析方法對樣品中萊克多巴胺等β_受體激動劑類藥物殘留的有效檢測，因此，探索一種高靈敏度的快速檢測的新方法，對于提高動物產品中獸藥殘留檢測靈敏度和準確性十分必要。
[0004]表面等離子體波共振(SPR)技術是利用了金屬薄膜光學耦合產生的物理光學現象，是一種非常靈敏的光學分析手段。自1902年被wood在光學實驗室首次發現了 SPR現象后，1990年瑞典的BIAcore公司開發了世界上第一臺商業化的SPR生物傳感器，因其能實時監測生物分子間相互作用，且無需標記、分析快捷、靈敏度高、前處理簡單、樣品用量少等優點，SPR傳感器研究得到了迅猛發展，現已被廣泛應用于蛋白質組學、藥物研發、臨床診斷、食品安全和環境監測等領域并且顯示出廣闊的應用前景。
[0005]SPR生物傳感器其原理是利用抗原抗體免疫反應技術引起敏感膜的光學屬性(主要是折射率)的變化，來檢測待測分子的成分、濃度以及參與化學反應的特性。采用基于抗體抗原反應的SPR芯片制備過程中需要制備待測物的抗體及相應的衍生物，耗時長、成本高，且生物芯片保存時間短、對環境要求高。
[0006]現有的采用分子印跡聚合物膜(MIP)制備的芯片具有制作簡單、成本低廉、堅固耐用、適用范圍廣、對環境要求低的優點，其成膜方法為壓膜法、化學合成法、涂抹法或電化學法。在金膜上修飾了絕緣的分子印跡聚合物后，芯片響應值的變化很大程度上依賴于分子印跡層的厚度及其介電常數的大小，但是萊克多巴胺等β_激動劑類藥物是小分子化合物，當檢測濃度較低時，芯片的響應值變化不明顯，不能夠很好的反應待測物濃度的變化，難以用于實際樣品中低濃度待測物的分析測定。因此，采取石墨烯等納米材料增強SPR效應，放大共振信號是解決低濃度下小分子化合物準確分析的關鍵。

【發明內容】

[0007]本發明是要解決現有的分子印跡聚合物膜制備的芯片的低濃度下分析不靈敏準確的技術問題，而提供萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片以及其制備方法。
[0008]本發明提供了萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片，所述萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片以萊克多巴胺分子印跡聚合物、石墨烯納米金、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽為芯片基底修飾物。
[0009]本申請中，基于石墨烯和納米金材料能夠顯著增強SPR效應的特點，使用二者修飾分子印跡SPR芯片，制備了能夠滿足較低濃度下萊克多巴胺殘留分析的SPR芯片。
[0010]本發明的萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片的制備方法按以下步驟進行:
[0011]I)、鍍膜:
[0012]采用真空蒸發鍍膜的方法，在玻璃片上先沉積1.5nm?2.5nm的鉻，然后再沉積45nm?55nm的純度為99.9999%的金，得到鍍膜玻璃片；
[0013]2)、清洗:
[0014]將質量百分濃度為30%的H202與質量百分比濃度為98%的H2S04的按體積比為1:3的比例混合均勻，得到洗液；然后用該洗液清洗步驟I)得到的鍍膜玻璃片，再用去離子水清洗，最后用無水乙醇清洗，晾干后得到芯片基底；
[0015]3)、萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球制備:
[0016]稱取萊克多巴胺、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二異丁腈加入到乙腈中，升溫至60°C?65°C并保持18h?24h，將得到的產物加入模板去除劑中去除萊克多巴胺，然后干燥，得到萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球；其中萊克多巴胺與甲基丙烯酸的物質的量比為1:3?5，萊克多巴胺與二甲基丙烯酸乙二醇酯的物質的量比為1:15?25，萊克多巴胺和引發劑的質量比為1:3?5，萊克多巴胺的質量與乙腈的體積的比為Ig:20 ?40mL ；
[0017]4)、稱取步驟3)制備的萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球、PF6、石墨烯納米金混合液并加入到四氫呋喃中，用超聲波混勻，得到鍍膜液；其中步驟3)制備的萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球的質量與PF6的體積的比為Img:5?10 μ L，PF6與四氫呋喃的體積比為1:100?200，石墨烯納米金混合液與四氫呋喃的體積比為1:100?200 ；
[0018]5)、將步驟4)制備的鍍膜液滴在步驟2)制備的芯片基底中央，然后將芯片基底放在旋涂器上旋涂成膜，得到萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片。
[0019]可選的，步驟3)中的模板去除劑為乙酸甲醇(10?30:70，V:V)，用模板去除劑去除萊克多巴胺的方法為索氏提取法；
[0020]其中步驟4)中石墨烯納米金混合液的濃度為0.5mg/mL,溶劑為四氫呋喃，超聲混勻；
[0021]其中步驟5)所述的旋涂的轉速6000?8000轉/分，旋涂時間為7?15s ;
[0022]本發明中利用石墨烯納米金能夠顯著增強SPR效應的這一特點，結合分子印跡技術，將粒徑為100?200nm的萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球借助于PF6的成膜作用固定在芯片基底膜表面，膜層顆粒分布比較均勻，增大了與待測物的結合面積，提供了更多的結合位點，更能有效的特異性識別模版分子，此外，納米金和石墨烯這兩種納米材料也借住PF6均勻地沉積在基底膜上，增強了等離子效應，放大了 SPR響應信號，為待測物低濃度下分析提供了解決辦法；制得的芯片膜厚度為200?600nm，符合SPR芯片的厚度要求，且芯片容易保存，對萊克多巴胺小分子物質的敏感性高(檢測限可達Ing/mL)，選擇性高、響應速度快(檢測時間15min左右)，抗干擾能力強，制備方法簡便，成本低廉，重現性好，易于規模化生產加工，可用于檢測動物產品及違禁藥物監管中尿液、血液及組織樣品中的痕量萊克多巴胺。也可用于傳感和分離【技術領域】。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是實施例1制備的萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片的原子力電鏡顯微照片;
[0024]圖2是實施例1制備的萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片檢測萊克多巴胺響應值圖。
【具體實施方式】
[0025]用以下試驗(實施例)驗證本發明的有益效果
[0026]實施例1:萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片的制備方法按以下步驟進行:
[0027]1、鍍膜:采用真空蒸發鍍膜的方法，在玻璃片上先沉積2nm的鉻，然后再沉積50nm的純度為99.9999%的金，得到鍍膜玻璃片；
[0028]2、清洗:將質量百分濃度為30%的H2O2與質量百分比濃度為98%的H2SO4的按體積比為1:3的比例混合均勻，得到洗液；然后用該洗液清洗步驟I得到的鍍膜玻璃片，再用去離子水清洗3次，最后用無水乙醇清洗3次，晾干后得到芯片基底；
[0029]3、萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球制備:稱取萊克多巴胺、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二異丁腈加入到乙腈中，升溫至60°C?65°C并保持18h?24h，將得到的產物加入模板去除劑中去除萊克多巴胺，然后干燥，得到萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球；其中，萊克多巴胺與甲基丙烯酸的物質的量比為1:3?5，萊克多巴胺與二甲基丙烯酸乙二醇酯的物質的量比為1:15?25，萊克多巴胺和引發劑的質量比為1:3?5，萊克多巴胺的質量與乙腈的體積的比為Ig:20?40mL ；
[0030]4、稱取步驟3制備的萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球、PF6、石墨烯納米金混合液、鄰苯二甲酸二丁酯并加入到四氫呋喃中，用超聲波混勻，得到鍍膜液；其中步驟3制備的萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球的質量與PF6的體積的比為Img:5?10μ L，PF6與四氫呋喃的體積比為1:100?200，石墨烯納米金混合液與四氫呋喃的體積比為1:100 ?200。
[0031]5、將步驟4制備的鍍膜液滴在步驟2制備的芯片基底中央，然后將芯片基底放在旋涂器上旋涂成膜，得到萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片。
[0032]其中步驟3中的模板去除劑為乙酸甲醇(10?30:70，V:V)，用模板去除劑去除萊克多巴胺的方法為索氏提取法；
[0033]其中步驟4中的石墨烯和納米金的混合液的濃度為0.5mg/mL，溶劑為四氫呋喃，超聲混勻；
[0034]其中步驟5所述的旋涂的轉速6000?8000轉/分，旋涂時間為7?15s ;
[0035]本實施例制備的萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片的原子力電鏡顯微照片如圖1所示，從圖1可以看出，芯片表面的萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球的粒徑為140nm，大小分布均勻。[0036]利用本試驗制備的萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片的檢測萊克多巴胺，其檢測方法如下:萊克多巴胺標準品溶解于甲醇PBS(10:90,V:V)溶液中，再生溶液為乙酸甲醇溶液(30:70, V:V)得到的響應值圖如圖2所示，從圖2可以看出，芯片響應值變化比較明顯，再生后基線基本能夠回到初水平。對萊克多巴胺等小分子物質敏感性高，定量限可低至10ng/mL,選擇性高、響應速度快，15min左右即可得到分析結果。
[0037]以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片，其特征在于，所述萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片以萊克多巴胺分子印跡聚合物、石墨烯納米金、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽為芯片基底修飾物。
2.如權利要求1所述的萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)、鍍膜: 采用真空蒸發鍍膜的方法，在玻璃片上先沉積1.5nm?2.5nm的鉻，然后再沉積45nm?55nm的純度為99.9999%的金，得到鍍膜玻璃片； 2)、清洗: 將質量百分濃度為30 %的H2O2與質量百分比濃度為98 %的H2SO4的按體積比為1:3的比例混合均勻，得到洗液；然后用該洗液清洗步驟I)得到的鍍膜玻璃片，再用去離子水清洗，最后用無水乙醇清洗，晾干后得到芯片基底； 3)、萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球制備: 稱取萊克多巴胺、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二異丁腈加入到乙腈中，升溫至60°C?65°C并保持18h?24h，將得到的產物加入模板去除劑中去除萊克多巴胺，然后干燥，得到萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球；其中萊克多巴胺與甲基丙烯酸的物質的量比為1:3?5，萊克多巴胺與二甲基丙烯酸乙二醇酯的物質的量比為1: 15?25，萊克多巴胺和引發劑的質量比為1:3?5，萊克多巴胺的質量與乙腈的體積的比為Ig:20?40mL ； 4)、稱取步驟3)制備的萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球、PF6、石墨烯納米金混合液并加入到四氫呋喃中，用超聲波混勻，得到鍍膜液；其中步驟3)制備的萊克多巴胺分子印跡聚合物納米微球的質量與PF6的體積的比為Img:5?10 μ L，PF6與四氫呋喃的體積比為1:100?200，石墨烯納米金混合液與四氫呋喃的體積比為1:100?200 ； 5)、將步驟4)制備的鍍膜液滴在步驟2)制備的芯片基底中央，然后將芯片基底放在旋涂器上旋涂成膜，得到萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片。
3.根據權利要求2所述的萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片的制備方法，其特征在于， 步驟3)中的模板去除劑為乙酸甲醇溶液(10?30:70, V:V)，用模板去除劑去除萊克多巴胺的方法為索氏提取法。
4.根據權利要求2所述的萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片的制備方法，其特征在于， 步驟4)中的石墨烯納米金混合液的濃度為0.5mg/mL,溶劑為四氫呋喃,超聲混勻。
5.根據權利要求2所述的萊克多巴胺分子印跡SPR傳感器芯片的制備方法，其特征在于， 步驟5)所述的旋涂的轉速6000?8000轉/分，旋涂時間為7?15s。
【文檔編號】G01N21/552GK103983613SQ201410258295
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月11日 優先權日:2014年6月11日
【發明者】王靜, 佘永新, 杜欣蔚, 姚婷, 李騰飛, 王淼, 張艷欣, 于海龍, 金芬, 邵華, 金茂俊, 王珊珊 申請人:中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所