凈化苯巴比妥和萊克多巴胺復合免疫親和柱及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種凈化苯巴比妥和萊克多巴胺復合免疫親和柱的制備與應用，更確 切的說是苯巴比妥和萊克多巴胺免疫親和柱的制備方法，免疫親和柱凈化-液相色譜法檢 測苯巴比妥和萊克多巴胺檢測方法的建立。
【背景技術】
[0002] 苯巴比妥，為白色有光澤的結晶性粉末；無臭，味微苦。具有鎮靜、催眠、抗驚厥作 用。并可抗癲癇，對癲癇大發作與局限性發作及癲癇持續狀態有良效；對癲癇小發作療效 差；而對精神運動性發作則往往無效，且單用本藥治療時還可能使發作加重。本品還有增 強解熱鎮痛藥之作用，并能誘導肝臟微粒體葡萄糖醛酸轉移酶活性，促進膽紅素與葡萄糖 醛酸結合，降低血漿膽紅素濃度，治療新生兒髙膽紅素血癥（腦核性黃疸）。不良反應（1) 用藥后可出現頭暈、困倦等后遺效應，久用可產生耐受性及依賴性。多次連用應警惕蓄積中 毒。（2)少數患者可出現皮瘆、藥熱、剝脫性皮炎等過敏反應。
[0003] 萊克多巴胺是一種人工合成的克侖巴安β -腎上腺受體激動劑，可用于治療充血 性心力衰竭癥、肌肉萎縮癥，增長肌肉，減少脂肪蓄積，并對胎兒和新生兒生長有益。萊克多 巴胺正被作為一種新型瘦肉精被一些養豬場使用。對此藥物在養殖業的適用范圍和安全性 世界各國的規定不盡相同。自2011年12月5日起在中國境內禁止生產和銷售萊克多巴胺。
[0004] 目前，苯巴比妥和萊克多巴胺的檢測方法主要有薄層層析法，酶聯免疫法 (ELISA)，免疫親和層析-液相色譜法，免疫親和層析-熒光光度法等。薄層層析法，要接觸 大量的標準品，不利于實驗者的健康，而且靈敏度很低。酶聯免疫法，只適用于定性檢測，很 容易出現假陽性和假陰性的現象。免疫親和層析-液相色譜法可以定量地檢測許多商品中 的苯巴比妥和萊克多巴胺的含量。由于采用了先進的生物技術，該方法可以檢測出苯巴比 妥和萊克多巴胺，而不使用有毒的溶劑如氯仿和二氯甲烷等。因此，當務之急，要制備出性 能穩定的免疫親和柱，并建立一種經濟，快捷，精確，安全的試驗方法。

【發明內容】

[0005] 為了解決現有技術中檢測苯巴比妥和萊克多巴胺亟需性能穩定的免疫親和柱的 問題，本發明提供了一種苯巴比妥和萊克多巴胺復合免疫親和柱及其制備方法與在HPLC 檢測中的應用。
[0006] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：一種凈化苯巴比妥和萊克多巴 胺復合免疫親和柱的制備方法如下：
[0007] a)基質制備
[0008] 稱取Ig瓊脂糖凝膠基質粉末，溶于lmmol/L HCl中，然后置于燒結玻璃過濾器中 使用 lmm〇l/L HCl 洗絳 15min ;
[0009] b)配體偶聯
[0010] 使用偶聯緩沖液〇. 2mol/L NaHC03pH8. 3溶解待偶聯的抗苯巴比妥單克隆抗體和 抗萊克多巴胺單克隆抗體，獲得抗體溶液，迅速將步驟a)活化的瓊脂糖凝膠基質轉移到所 述抗體溶液中，充分混勻上述的混和物2-4h ;
[0011] C)配體封閉
[0012] 封閉所有殘留的活性基團，轉移經步驟b)處理的瓊脂糖凝膠基質至0. lmol/L Tris-HCl緩沖液中，室溫條件下靜置2-4h ;
[0013] d)除去偶聯后未偶聯上的多余的配體
[0014] 依次用0· lmol/L醋酸/醋酸鈉緩沖液和0· lmol/L Tris-HCl緩沖液對經步驟c) 處理后的瓊脂糖凝膠基質進行洗滌，至少洗滌3個循環；
[0015] e)裝柱
[0016] 用5倍所述瓊脂糖凝膠體積的0. 01 % NaN3-PBS洗滌，并使用0. 01 % NaN3-PBS保 存，然后裝柱。
[0017] 在以上獲得復合免疫親和柱（IAC)的基礎上，本發明建立了利用液相色譜法檢測 苯巴比妥和萊克多巴胺檢測的方法：當含有苯巴比妥和萊克多巴胺的樣品通過IAC時，免 疫吸附劑就會特異性的吸附苯巴比妥和萊克多巴胺，其他的雜質則流出IAC柱，然后用甲 醇將苯巴比妥和萊克多巴胺從柱子中洗脫下來，樣品得到了很好的凈化。
[0018] 用所述復合免疫親和柱凈化待測樣液，然后用色譜級甲醇洗脫親和柱，流速為 lmL/min~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供HPLC分析；
[0019] 高效液相色譜條件
[0020] 苯巴比妥
[0021] 色譜柱！Cloversil-C18, 4. 6 X 250mm
[0022] 流動相：甲醇：水=50:50 (v/v)
[0023] 流速：0. 8mL/min
[0024] 檢測器：紫外檢測器，波長254nm
[0025] 進樣體積：50~IOOuL ;
[0026] 萊克多巴胺：
[0027] 色譜柱！Cloversil-C18, 4. 6 X 250mm
[0028] 流動相：乙腈：0· 05%三氟乙酸=20 :80 (v/v)
[0029] 流速：0· 8mL/min
[0030] 檢測器：紫外檢測器，波長224nm
[0031] 進樣體積：50~IOOuL ;
[0032] 定量
[0033] 用進樣器吸取50 μ L標準工作液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定標 準溶液的響應值，分別得到標準溶液高效液相色譜圖。
[0034] 本發明制備的復合免疫親和柱可以有效地利用到苯巴比妥和萊克多巴胺的液相 色譜檢測中，使檢測快捷，精確，安全。
【附圖說明】
[0035] 圖1為樣品中苯巴比妥的色譜圖；
[0036] 圖2為樣品中萊克多巴胺的色譜圖。
【具體實施方式】
[0037] 實例一：
[0038] 制備抗苯巴比妥單克隆抗體；萊克多巴胺抗體為市售產品。
[0039] 動物免疫：免疫動物為6-8周齡左右，雌性BALB/c小鼠。免疫原：ZER-BSA免疫5 只小鼠。取適量免疫原（IOOyg/只）加等量弗氏完全佐劑，制成乳化劑進行免疫，之后佐 劑改為不完全佐劑，共免疫6次，每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外，其余 均為腹腔注射。
[0040] 細胞融合：脾細胞和雜交瘤細胞按照10:1的比例進行細胞融合試驗。
[0041] 雜交瘤細胞克隆化：采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，直到得到對苯巴比妥有很 好的特異性反應的細胞。最后篩選出分泌苯巴比妥抗體的雜交瘤細胞9203,制備出單克隆 抗體。抗苯巴比妥單克隆抗體細胞已于2014年5月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心（CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC No. 9203〇
[0042] 實例二：
[0043] 本實例為苯巴比妥和萊克多巴胺復合免疫親和柱的制備
[0044] 1.基質制備
[0045] 稱取所需Ig的瓊脂糖凝膠（Sepharose)基質粉末（每克凍干基質粉末可形成 3.5ml終體積的溶脹基質），溶于lmmol/L HCl中。基質將會立即溶脹，然后置于燒結玻璃 過濾器中使用lmm〇l/L HCl洗絳15min。
[0046] 2.配體（抗體）偶聯
[0047] a使用偶聯緩沖液0. 2mol/L NaHC03pH8. 3溶解待偶聯的抗苯巴比妥單克隆抗體 細胞9203分泌的抗苯巴比妥單克隆抗體和市購的萊克多巴胺抗體，抗體濃度為7. 8mg/ml， 溶解的抗體置于冰浴中暫存。在一個帶蓋的可完全密封的容器中加入上述含有抗體的偶聯 緩沖液。迅速將CNBr活化的Sepharose轉移到抗體溶液中。室溫條件（20-25°C)下采用 end-over-end的方式充分混勾上述的混和物2_4h，
[0048] b偶聯率的計算：離心，2, 000RMPX lmin，將s印harose離心至管底，將上清液轉移 至新的離心管中，測定上清液的蛋白質含量值。計算偶聯率為99.3% (說明偶聯很成功）。 取離心至管底的sepharose，使用偶聯緩沖液進行洗滌，除去多余的配體。
[0049] c封閉：封閉所有殘留的活性基團。轉移基質至0. lmol/L Tris-HCl緩沖液中。室 溫條件下靜置2-4h。
[0050] d為除去偶聯后未偶聯上的多余的配體，依次用低、高兩種pH的緩沖液對基質進 行洗滌，至少洗滌3個循環，每種緩沖液的使用量至少5倍基質體積。
[0051] 每個洗滌循環步驟：先用0. lmol/L醋酸/醋酸鈉緩沖液洗滌，接著再用0. lmol/L Tris-HCl緩沖液進行洗滌。
[0052] e用5倍基質體積的0. 01 % NaN3-PBS