分析試劑盒及分析方法
【專利摘要】本發明的題目是分析試劑盒及分析方法。本發明提供一種分析試劑盒，與分析物反應，分析試劑盒包括多個反應容器以及多個微粒。各反應容器包括濾膜，且濾膜具有多個孔洞。各微粒的粒徑大于各孔洞，且直接或間接與分析物或其競爭物或識別分子結合。此外，本發明亦提供一種分析方法。
【專利說明】分析試劑盒及分析方法
【技術領域】
[0001]本發明關于一種分析試劑盒及分析方法。
【背景技術】
[0002]生物感測一向是環境監控、科學研究分析、醫學診斷、工業品管以及食物安全等領域中的重要方法。利用識別分子與分析物間特異性辨識的分析法已經長期且廣泛地被應用于多項技術中。其中，包含微孔板分析法(microtiter plate based assay)、測流免疫層析法(lateral flow immunochromatographic assay)或微珠式分析法(bead based assay)
坐寸ο
[0003]微珠式分析法主要的優勢為促使固相與液相分子混合的均勻分布性。目前微珠式分析法的應用可例如結合流式細胞儀和不同熒光標定的微珠，結合識別分子以后便可以廣泛應用在目標的檢測。或是利用具有磁珠的微珠分析的方法，以進行純化的應用，其針對微珠與待分析的物質特異性結合后，并以磁性進一步將結合的待分析的磁珠分離出來。
[0004]然而，微珠式分析法要通過流式細胞儀的分析或是標定多種具有不同分析功能的微珠，使制程變得復雜且需耗費高成本，難以符合進行大量及快速分析的需求。相較于磁珠的應用，其通過磁力以達分離及純化的方式相對具有有效的提升分析的便利性、靈敏度、特異性、快速和簡便性等特性。但磁珠需通過磁力吸引以與其它物質進一步分離的過程，又難免造成步驟繁復且會因磁力不均勻或不足而有部分磁珠損失的疑慮。
[0005]因此，如何提供一種制程簡單、低成本以及可快速分析大量樣品的分析試劑盒及相關分析方法，已成為目前檢測分析領域中的重要課題之一。

【發明內容】

[0006]有鑒于上述課題，本發明的目的為提供一種制程簡單、低成本以及可快速分析大量樣品的分析試劑盒及分析方法。
[0007]有鑒于上述的目的，本發明提供一種分析試劑盒，與分析物反應，分析試劑盒包括多個反應容器以及多個微粒。各反應容器分別包括濾膜，濾膜上具有多個孔洞，而各微粒的粒徑大于各孔洞，且直接或間接與分析物或其競爭物或識別分子接合。
[0008]在本發明一實施例中，孔洞之一的孔徑介于Inm至Icm之間。
[0009]在本發明一實施例中，微粒的材料包括玻璃、乳膠、橡膠、磁石、樹脂、金屬、陶瓷、多糖、塑料、或硅。
[0010]在本發明一實施例中，分析物或其競爭物或識別分子為蛋白質、肽、核酸、糖類、化合物、細胞、或微生物。
[0011]在本發明一實施例中，識別分子與分析物或其競爭物接合。
[0012]在本發明一實施例中，分析試劑盒還包括多個信號分子，分別與分析物或其競爭物或識別分子結合。
[0013]在本發明一實施例中，信號分子包括酶、酶受體、顯色劑、放射性物質、納米脂粒、或金屬化合物。
[0014]在本發明一實施例中，分析試劑盒還包括封合件，設置于濾膜的流出側。
[0015]本發明另提供一種分析方法，與分析物反應的分析試劑盒配合，分析試劑盒包括多個反應容器以及多個微粒，各反應容器包括具有多個孔洞的濾膜，分析方法包括將具有分析物或其競爭物或識別分子的溶液加入各反應容器，微粒分別與分析物或其競爭物或識別分子進行直接或間接接合、加入多個信號分子，信號分子連接至分析物或其競爭物或識別分子、濾除反應容器中的溶液以及檢測信號分子所產生的信號強度。
[0016]在本發明一實施例中，各微粒的粒徑大于各孔洞。
[0017]在本發明一實施例中，識別分子與分析物或其競爭物接合。
[0018]綜上所述，本發明所提供的一種分析試劑盒，通過微粒的粒徑大于濾膜孔洞，能快速經由濾除方式將直接或間接結合在微粒上的分析物或其競爭物或識別分子與其它物質分離，并進行定量分析。如此一來，能改善現有技術中需以提供磁性將磁珠在分離時的復雜程序。本發明的分析試劑盒還兼具分析容易且設備器材成本較低且能廣泛應用于各種分析法等優勢，且反應容器能依據分析所需而制成各種容積，因此還能應用于高通量的分析。另外，本發明亦提供一種分析方法，連同本發明的分析試劑盒，能實施間接型酶聯免疫吸附法、競爭型酶聯免疫吸附法以及夾心法酶聯免疫吸附法，相較現有技術的分析方法可更為快速且更容易地檢測到分析物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1A至圖1D為本發明的一種分析試劑盒的其中一反應容器及其變化態樣示意圖；
[0020]圖2A為依據本發明一實施例的分析試劑盒組合剖面示意圖；
[0021]圖2B為依據本發明另一實施例的分析試劑盒組合俯視圖；
[0022]圖3為依據本發明的分析方法步驟流程圖；
[0023]圖4A至圖4E分別為以本發明的分析試劑盒及本發明的分析方法操作流程圖；以及
[0024]圖5A及圖5B分別為以本發明的分析試劑盒及本發明的分析方法分析慶大霉素的數據圖。
【具體實施方式】
[0025]以下將參照相關附圖，說明依本發明提供的制程簡單、低成本以及快速分析的分析試劑盒，其能快速分析大量的樣品。另外，本發明又提供一種以此分析試劑盒進行分析的分析方法，其中相同的組件將以相同的參照符號加以說明。
[0026]本發明所提供的一種分析試劑盒，能與分析物反應，以檢測分析物的濃度，應用領域可包含化學檢測分析以及免疫檢測等分析技術。圖1A為本發明一實施例的一種分析試劑盒的其中一反應容器示意圖。請參照圖1A所示，本發明的分析試劑盒I包括多個反應容器11以及多個微粒12。
[0027]本發明的各反應容器11包括濾膜111，濾膜111可以設置于反應容器11中間、底部或側壁。在本發明一實施例中，濾膜111沿反應容器11底部邊緣設置，且設置于反應容器11的流出側。而本發明所使用的濾膜111材料包括乙酸纖維素(cellulose acetate)、或聚醚砜(polyester sulfone)。另外,本發明的濾膜111具有多個孔洞P,每個孔洞P的孔徑大小介于約Inm至Icm之間，較佳介于0.1 μ m至100 μ m之間。各孔洞P的間距可以以一固定距離而設置，或是以不同距離相互設置于濾膜111上。
[0028]反應容器11與濾膜111圍成的供操作及反應進行的容置空間，以供多個微粒12以及或分析物A的競爭者容置。在此，以各反應容器11分別具有濾膜111為例，當然，分析試劑盒I的反應容器11也可以共享濾膜111，而各反應容器11則分別對應濾膜111的其中一部分。
[0029]微粒12的粒徑大于濾膜111的孔洞P的孔徑大小，使得微粒12于反應容器11中能通過其粒徑較孔洞P的孔徑大而在過濾步驟后仍被保留在容置空間中。本發明的微粒12粒徑較佳介于2nm至2cm之間。且本發明的微粒12所使用的材料包括玻璃、乳膠、橡膠、磁石、樹脂、金屬、陶瓷、多糖、塑料、或硅。然而，本發明的微粒12的形狀不限于為球形、橢圓球形、方塊、或其它不規則形狀的結構。在本發明一實施例中，為使微粒12能具有較大表面積以接合分析物A，因此微粒12為一球形結構。而微粒12球狀的表面積，可與含有分析物A的樣品溶液充分混合，增加反應的均勻度。
[0030]本發明的微粒能直接或間接與分析物或其競爭物或識別分子接合。在此所謂”直接”指微粒與分析物或其競爭物接合時，兩者間未倚靠其它組件或分子即達成連接的情況而言；而相反地”間接”指微粒與分析物或其競爭物接合時，兩者間尚有其它組件或分子以連接兩者的情況而言。適用于本發明的分析試劑盒的分析物或其競爭物或識別分子包括蛋白質、肽、核酸、糖類、化合物、細胞、微生物、或小分子。其中小分子可如環境激素如三聚氰胺(melamine)、二H惡英(dioxin)、萊克多巴胺(Ractopamine)(瘦肉精組成分)、鄰苯二甲酸鹽(phthalate)(塑化劑組成分)等；或如生理代謝產物如葡萄糖、或尿酸等；或如食品添加物等。分析物存在于任何樣品中，且為待分析的標的物。
[0031]本發明依不同的分析方法進行時，組件之間的連結關系會有些許不同，例如于圖1A中，進行間接型酶聯免疫吸附法(indirect ELISA)時，微粒12與分析物A通過第一配體LI而間接結合；而當進行競爭型酶聯免疫吸附法時(如圖4A)，則除了分析物A能和微粒12間接結合以外(經由第一配體LI)，樣品中與分析物A結構相似的競爭物Al也能與分析物A相競爭，而間接結合至微粒12上。競爭物Al主要是在進行分析時，為了協助間接分析分析物A濃度而加入的物質。本發明中所謂的“競爭物”指該競爭物相對于分析物，亦具有能與特異性識別該分析物的識別分子結合能力。
[0032]本發明的微粒與分析物或其競爭物或識別分子直接結合的方式可以為兩者間以電荷吸引、或以結構嵌合、或微粒及/或分析物經由化學修飾具有特定官能團可相互鍵合等方式。在本發明一實施例中，微粒例如為帶負電的樹脂，而分析物例如為帶有正電荷的熒光蛋白。故當含有分析物的樣品溶液被置入反應容器后，分析物即會被微粒吸引，而其余物質則被濾除。由于分析物本身帶有熒光，故能直接定量出分析物的濃度。
[0033]然而，本發明的微粒亦可以間接結合方式結合識別分子、分析物及其競爭物。舉例來說，為增加各組件(微粒、識別分子、或分析物及其競爭物)之間結合能力，或當識別分子、分析物或其競爭物無法通過上述的結構嵌合或官能團結合手段結合到微粒上時，本發明的分析試劑盒中，能通過提供具有較佳結合親和性或結合穩定性的配體(ligand)來達成。配體能設置于微粒、識別分子、或分析物及其競爭物的至少其中之一的表面上，以協助微粒、識別分子、或分析物及其競爭物其中任兩個組件之間的結合。舉例來說，能通過配體來結合兩個組件；或是兩組件分別結合至不相同的兩個配體，再將此兩個配體相互結合。需注意的是，本發明的各組件不限定只能與一種配體結合，也可以同時連接兩種以上的配體(一配位組件)，以與另一組件結合，視檢測分析時的目的而定。
[0034]如圖1A所示，在本發明一實施例中，分析試劑盒I還包括第一配體LI。第一配體LI用以直接或間接接合分析物A或其競爭物，而使分析物A或其競爭物間接接合至微粒12上。舉例來說，當分析物A或其競爭物與微粒12間的結合力較弱時，通過與微粒12具有較佳結合性的第一配體LI結合于微粒12后，同時第一配體LI又具有能與分析物A相結合的結構，因此能將分析物A穩定地間接接合至微粒12上。
[0035]如圖1B所示，另外，本發明的分析試劑盒還可包括一第二配體L2，其能與第一配體LI結合。第二配體L2用以連接識別分子、分析物或其競爭物Al，以使識別分子、分析物或其競爭物Al能間接連接至微粒12上。如圖中所示，第一配體LI直接接合至微粒12上，而第二配體L2與競爭物Al先接合后，由于第一配體LI與第二配體L2具有能相互嵌合的結構，因而兩者之間具有較佳的結合性。當然，在本實施例中，第一配體LI及第二配體L2輔助競爭物Al接合至微粒12上的方式，還可以當第二配體L2接合競爭物Al后，再與第一配體LI接合，最后才通過第一配體LI接合至微粒12上；或是，第一配體LI結合至微粒12后加入第二配體L2，當第二配體L2與第一配體LI結合后，再加入競爭物Al ;亦或是，第一配體LI與第二配體L2先結合后，以第一配體LI的一端結合至微粒12上后，再加入競爭物Al，本發明均不設限。
[0036]在本發明的另一實施例，本發明的分析試劑盒應用于夾心法酶聯免疫吸附法(sandwich ELISA)。如圖1C所示，在本實施例中，識別分子13為捕捉型抗體(captureantibody),能與分析物A相結合,且識別分子13能直接結合至微粒12的表面。
[0037]同樣地在另一實施例中，如圖1D所示，微粒12及識別分子13可以先分別接合第一配體LI及第二配體L2，通過第一配體LI與第二配體L2結合，可使識別分子13間接結合至微粒12上。在此實施例中，第一配體LI與第二配體L2間的結合可以通過結構的互補特性或特有官能團間的鍵合而結合。對此，需額外說明的是，本發明的分析試劑盒在進行分析時，依據所使用的分析方法的不同或依分析的需求不同，本發明的分析試劑盒可具有一種以上的識別分子。如圖1C及圖1D所示，分析試劑盒還具有另一識別分子14，其為檢測抗體(detection antibody)。當識別分子13與一分析物A特異性接合后,最后再由另一具特異性的識別分子14辨識分析物A，其中，識別分子13及識別分子14分別辨識分析物A結構上的兩個不同部位。而本發明的夾心法酶聯免疫吸附法的其它操作流程及其分析原理，為本發明所屬【技術領域】中具有通常知識者所能理解，故不再贅述。
[0038]請同時參照圖1A至圖1D，當本發明的第一配體LI與分析物A或競爭物Al或識別分子13直接或間接結合后，為便于定量結合分析物A或競爭物Al濃度，因此本發明的分析試劑盒I還包括多個信號分子S能直接或間接結合于分析物A或競爭物Al或識別分子13，使信號分子S濃度能與分析物A濃度呈現正相關或負相關，故通過檢測信號分子S的活化的信號強度，可作為檢測微粒12所結合的分析物A濃度的依據。其中，信號分子S可為酶、酶受體、顯色劑、放射性物質、納米粒、或金屬化合物。其中，酶可例如熒光素酶(Iuciferase)、β-半乳糖酶(β-galactosidase)、辣根過氧化氫酶(horseradishperoxidase)、或堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)等加入受質能釋放突光信號者；酶受體可與酶連結而活化并產生信號；顯色劑則例如熒光劑異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocynate)、羅丹明(rhodamine)、藻紅素(phycoerythrin)、突光蛋白、磺酰羅丹明B (Sulforhodamine B, SRB)及冷光物質等；放射性物質如1251、35S、mTc等；金屬化合物可例如為釕絡合物(Ru complex)。另外，本發明的信號分子S為包覆有上述信號分子S的微脂體，其脂質結構中鑲嵌具有信號的信號分子之結構。而部分信號分子S通常于分析定量前才加入或活化，以使信號分子S能于活性期間內有效被檢測，以避免影響檢測強度衰弱造成的定量誤差。而檢測信號分子S的方法依據所使用的信號分子類型的不同而有所差異，例如檢測信號分子S的方法可包括檢測信號的吸光值或放射線強度等，并連同相關儀器進行檢測信號的強度。然而，上述檢測信號分子的方法為本發明所屬【技術領域】具有通常知識者所能理解，故不再贅述。
[0039]在本發明一實施例中，信號分子S與分析物A間接結合如圖1C及圖1D所示，所使用的信號分子S(星形)以微脂體(圓形)包覆以形成信號復合物15。信號復合物15能直接結合于分析物A或透過識別分子14間接結合于分析物A，并于定量分析前移除微脂體或破裂微脂體而使信號分子S (星形)露出，用以檢測信號分子S (星形)的濃度判斷分析物A的濃度。
[0040]同樣地，為使信號分子S與分析物A具有較佳的結合性，本發明的信號分子S可還包括配體(圖未表示)，配體能直接或間接結合于信號分子S或信號分子復合物15。信號分子S能通過配體與分析物A具有較佳的親和性，以進一步與分析物A或與其結合的識別分子結合。而關于上述信號分子S及微脂體的相關制程及信號分子S結合配體的舉例說明及其制備的步驟流程，將于后續進一步說明。除微脂體之外，本發明的信號分子S亦能通過連接其它連結件而結合至分析物，例如特異結合分析物的抗體或連接體(linker)。
[0041]再請同時參照圖1A至圖1D,本發明的分析試劑盒還包括一封合件112,封合件112設置于濾膜111的流出側。當實施各分析法時，為使各反應物質間微粒12與第一配體L1、第一配體LI與分析物A或其競爭物Al或第二配體L2之間、信號分子S與分析物A或其競爭物Al或識別分子14等之間能有足夠時間進行經由浸泡以相互進行特異性結合，封合件112能暫時封閉濾膜111的孔洞P，待反應完全后再移除封合件112，以濾除多余的溶液。在本發明一實施例中，封合件112為薄膜、或盒蓋形式，且其材料可以是金屬、乳膠或塑料材料制成。
[0042]由于反應容器11具有濾膜111，因此本發明的分析試劑盒的單一反應容器可為具有至少一濾板(filter plate)或至少一管柱形式。當反應容器為濾板形式時，則可以同時進行多種不同分析方法或同時分析不同的分析物。每個反應容器的組合方式可如圖2A所示，相互并排于平面的方式組合成具有各種數目的反應容器11的分析試劑盒2，組合方式較佳為一數組式排列，如96孔濾板、或384孔濾板、或1536孔濾板等。各濾盤或管柱的反應空間深度可隨分析樣品的體積進行調整，如可容置I μ I至IOOml溶液體積的空間。由于具有多個反應容器11，故本發明的分析試劑盒I能進行分析中的各項檢測及分析，包括以標準品建立標準濃度曲線、或于相同樣品之間進行重復試驗。
[0043]舉例來說，如圖2Β所示，圖中所顯示為本發明的分析試劑盒以96孔濾板形式表示，且為俯視示意圖。Al?AS為稀釋不同濃度標準品，并以此建立的標準曲線對分析物濃度進行分析，而BI?B8為針對八種不同的分析物進行分析，Cl?C8及Dl?D8為BI?B8的另外兩個重復，將BI?B8、C1?C8及Dl?D8三者的三個重復分析結果進行統計并對應標準曲線得到平均濃度。故，本發明的分析試劑盒除能用于標準曲線之建立以外，也能同時進行多次重復分析。此外，由于各反應容器的反應空間能依應用的分析樣品量調整，因此，也適用于高通量的樣品分析。
[0044]除此之外，本發明亦提供一種分析方法，與分析物反應的分析試劑盒配合，分析試劑盒包括多個反應容器以及多個微粒，各反應容器包括具有多個孔洞的濾膜，分析方法步驟包括將具有分析物或其競爭物或識別分子的溶液加入各反應容器，微粒分別與分析物或其競爭物或識別分子直接或間接接合(步驟SI)、加入多個信號分子，信號分子連接至分析物或其競爭物或識別分子(步驟S2)、濾除反應容器中的溶液(步驟S3)以及檢測信號分子所產生的信號強度(步驟S4)。
[0045]而關于本發明的分析方法，所使用的分析試劑盒如上述的分析試劑盒，其中的反應容器及其組成組件的相關說明請參照上述。本發明的步驟流程及操作流程示意圖分別如圖3及圖4A至圖4E所示。在此，圖4A至圖4E參照如圖1B結構的分析試劑盒同時連同競爭型酶聯免疫吸附法進一步說明。
[0046]于步驟SI，在本發明一實施例中，與分析物相競爭的競爭物能直接與微粒結合。對此，微粒先加入至反應容器后，隨即加入含有競爭物的溶液與微粒作用一段時間，使競爭物能與微粒充分結合。
[0047]而于另一實施例中，競爭物間接與微粒結合。對此，本發明的分析方法還包括設置至少一第一配體于微粒的表面，第一配體能與分析物或其競爭物直接結合至微粒上。則在進行步驟Si時，則接有第一配體的微粒直接先置于反應容器中，再加入含有分析物或其競爭物的溶液至反應容器中與微粒結合。而若分析物或其競爭物采間接結合方式至微粒時，則本發明的分析方法又可還包括設置第二配體于分析物或其競爭物。其中，第一配體及第二配體能相互結合，兩者的結合方式如上述說明。請同時參照如圖3及圖4A所示。在此實施例中，微粒12先與第一配體LI結合后，設置于反應容器11中，而競爭物Al (方形斜線)則與第二配體L2進行結合。圖4A中以單一個反應容器11為例，而真正進行操作時，可有多個反應容器11 一同來進行分析。于步驟SI中，本發明亦不限為先將第一配體LI與微粒12結合后才加入競爭物Al或第二配體L2，也可以先使第一配體LI與競爭物Al或第二配體L2特異性結合后，再通過第一配體LI連接到微粒12上，本發明不限于此。當然在其它實施例中，與微粒12直接或間接接合者，也可為分析物A。
[0048]在本實施例中，微粒12為樹脂材料，第一配體LI為鏈霉親和素(streptavidin),且第二配體L2為生物素(biotin)為例，能與作為第一配體LI的鏈霉親和素嵌合。在本實施例中，微粒12浸泡于含有鏈霉親和素的溶液中進行反應，以使鏈霉親和素接合至微粒12表面。在此實施例中，競爭物Al通過第二配體L2而結合至第一配體LI之外，并可與分析物A共同競爭后續加入具專一結合性的識別分子14(如圖4B所示)。需額外說明的是，本發明中的分析方法中，競爭物Al與分析物A競爭識別分子14的方式，依分析的目的不同，而可以待接有第二配體L2的分析物A與微粒12上的第一配體LI結合后，再加入競爭物Al ；或是先加入接有第二配體L2的競爭物Al，待第二配體L2與微粒12上的第一配體LI結合后，再加入分析物A ;或是分析物A與競爭物Al先混合后再加入，而競爭物Al連接第二配體L2，以與連接在微粒12上的第一配體LI結合。然而，本發明的競爭物Al所扮演的競爭角色，視分析時檢測需求而定，本發明不限于此。在本實施例中，如圖4A所示，分析物A待競爭物Al所連接的第二配體L2與第一配體LI間接結合后才加入反應容器11中，以競爭后續加入的識別分子14。
[0049]在本實施例中，第二配體L2為生物素，其標定分析物A或競爭物Al的反應使用Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin以抗生素20倍的摩爾數與競爭物Al溶液混合，在室溫下反應2小時以后加入68mM牛血清蛋白使未與分析物反應的Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin與牛血清蛋白上胺基反應，再以Tris-HCl將剩余的自由NHS反應官能團結合，以Amiconultrafiltration(Millipore)將接合競爭物Al的生物素與接合牛血清蛋白(Bovineserum albumin, BSA)的生物素通過大小分離,取得溶有生物素標定競爭物Al的過濾液并且加入其1.5倍量具有鏈霉親和素接合的微粒12均勻混合，于室溫反應I小時，以使生物素與鏈霉親和素間相互結合。同時加入BSA溶液以阻斷微粒12表面非特異性吸附作用，最后利用離心清洗除去溶液中沒有結合上微粒12的其它物質，其中包含游離的競爭物Al，反復離心清洗后，最后將合成好的接合競爭物Al之微粒12溶液儲存在4°C備用。
[0050]接著，如步驟S2，加入多個信號分子S，此步驟的示意圖如圖4C所示。在本實施例中，信號分子S以微脂體包覆以形成信號復合物15。本實施例中，信號復合物15通過識別分子14，而能特異性結合或標定至分析物A或其競爭物Al。另外，為使信號復合物15與識別分子14間的特異性結合更佳，本實施例的信號復合物15還包括第三配體L3。第三配體L3與識別分子14具有較佳特異性，因而能使帶有信號分子S的信號復合物15間接接合至有識別分子14的分析物A或競爭物Al上。通過識別分子14與第三配體L3的結合，使信號分子S能標定到分析物A及競爭物Al。當然，于其它實施例中，信號復合物15也可能直接連結于分析物A及/或競爭物Al上，而不需要通過識別分子14或第三配體L3。
[0051]在此實施例中，信號分子S為包覆于微脂體中的熒光物質SRB (磺酰羅丹明，sulforhodamine B, Sigma)。本實施例中的微脂體及包覆突光物質SRB之方法如下:微脂體的組成包含4.8 % DPPG( 二棕櫚酰磷脂酰甘油，dipalmi toy lphosphat idyl glycerol, Avanti Polar Lipids) >45.3 % DPPC ( 二掠櫚酸憐脂酸膽喊，dipalmi toy lphosphat idyl choline, Avanti Polar Lipids)、45.9 % 膽固醇(cholesterol, Sigma)以及4 % ATA-DPPE，以上的磷脂質組成包覆有150mM的熒光物質SRB (磺酰羅丹明，sulforhodamine B, Sigma)。事先將N-琥拍酰亞胺基S-乙酰基硫代乙酸鹽(N-Succinimidyl S-Acetylthioacetate) (SATA, Thermo)與 DPPE 1,2-二(十六酸)-sn-甘油基-3-憐酸乙醇胺(1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanola-mine, Avanti Polar Lipids)反應30分鐘完成DPPE-ATA的制備，而后將膽固醇、DPPC及DPPG溶于3: I氯仿/甲醇有機溶劑中，再加入事先完成的SATA修飾的DPPE，以氮氣除去有機溶劑后形成膠狀透明脂質膜再加入預熱至60°C的150mM SRB溶液，并于60°C的水浴槽中進行熒光物質SRB的包覆反應(encapsulation)，45分鐘后將殘留塊狀的脂質震蕩混合均勻在溶液中，再次利用60°C水浴槽繼續進行熒光物質SRB的包覆作用30分鐘至I小時。
[0052]最后,將已形成的突光微脂體溶液在60°C的條件下,來回擠壓穿過200nm孔徑的聚碳酸酯針筒式濾器(polycarbonate syringe filers) (Avanti Polar Lipids) 30 次。此時，微脂體直徑已被調整成約200nm。將有包覆熒光物質SRB的微脂體與未包覆在微脂體內的突光物質SRB利用大小排除層析法(size exclusion chromatography, SEC)分離,有包覆熒光物質SRB的微脂體經由SEC(CL-4B resin)被分離出來，其沖提液為TBS-蔗糖(25mMTris, 140mM NaCl, and 65g/L 鹿糖,酸堿值調整至 pH 7.5)。
[0053]在本實施例中，第三配體L3為蛋白質G (protein G)，而識別分子14為免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG),且為能與分析物A及其競爭物Al進行特異性結合的抗體。由于蛋白質G能與免疫球蛋白G特異性結合，因此，信號復合物15能通過第三配體L3而與識別分子14特異性結合。
[0054]將蛋白質G接合至包覆有信號復合物15表面上的接合方法如下所述:接合反應依Chen等人(2005)的方法改良，原方法中所使用的Sulfo-SMCC(4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己燒-1-羧酸橫酸基玻拍酸亞胺酯，Sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)交聯劑以具有 24 個 PEG(聚乙二醇，polyethylene glycol)的SM (PEG) 24(琥珀酰亞胺基-[(N-馬來酰亞胺基丙酰胺基)_ 二十四碳亞乙基二醇]酯，succinimidyl-[ (N~maleimidoprop1-namido) -tetracosaethyleneglycoI] ester)交聯劑(crosslinker, Thermo)取代。預期可以使蛋白質G-微脂體-SRB足以突破空間障礙的困難而具有更大的靈活度與后續使用的作為識別分子14的抗體結合，利于分析的進行。
[0055]關于信號復合物15中的微脂體與蛋白質G的接合反應(conjugation),其作法如下:首先由以SM(PEG) 24將蛋白質G進行衍生化作用(derivitization of neutravidinwith SM(PEG)24)以及微脂體-熒光物質SRB表面的去乙酰反應(deacetylation)同時平行進行，其中蛋白質G的衍生化反應在酸堿值7至9之間在室溫下進行I小時，產物由0.2MTris HCl將未反應的官能團結合后，以分子量大小限制為7K的離心柱(Zeba Desaltingcolumn)將接有SM(PEG)24的蛋白質G與未反應的SM(PEG)24分離，得到馬來酰亞胺衍生化(Maleimide-derivetized)的蛋白質G,再與同樣經過I小時、室溫下以0.5M輕基胺鹽酸鹽(hydroxylamine hydrochloride)去乙酰反應完成后的表面硫醇基裸露的微脂體在酸堿值
6.5到7.5之間進行反應。此馬來酰亞胺衍生化的蛋白質G與微脂體表面的硫醇基在室溫下反應1.5個小時后以硫氫基結合劑NEM(N-ethylmaleimide)將未反應的微脂體表面硫醇基阻斷，再經由大小排除層析法將蛋白質G接合成功的微脂體-熒光物質SRB與未接合成功的蛋白質G分離,沖提液同樣使用TBS-鹿糖(25mM Tris, 140mM NaCl, and 65g/L鹿糖，酸堿值調整至PH7.5)。
[0056]另外，如圖3及圖4D所示，本發明的分析方法于進行步驟SI之后及/或步驟S2之后，可進行一濾除步驟(步驟S3)。當每個加入步驟(步驟SI或S2)后通過封合件112密合濾膜111的孔洞P，使各物質之間充分作用及結合，之后再通過移除封合件112，使溶液中未結合至微粒12上的物質如分析物A或其競爭物Al、第一配體L1、第二配體L2、識別分子14或信號復合物15等，由濾膜111的孔洞P流出。除此之外，本發明的濾除步驟還包括多個清洗的步驟，以達到充分移除非欲進行檢測的物質。
[0057]最后，于步驟S4中檢測微粒12上競爭物Al所結合的信號復合物15釋放的信號分子S的信號強度。依據所接合的不同信號分子S種類，本發明的分析方法中能額外添加其受質或催化酶等，使信號分子S活化后釋出信號。在本實施例中，如圖4E所示，信號復合物15通過加入界面活性劑使微脂體溶解后，釋放出SRB信號分子S。并且依據各種信號分子S的波長范圍或信號特性的不同以不同儀器進行檢測，統計各分析數值后定量出分析物A的濃度。
[0058]需特別說明的是，在本實施例中，當溶液中分析物A越多，則后續結合到競爭物Al的識別分子14及信號分子S量則越少；反之，溶液中分析物A越少，則后續結合到競爭物Al的識別分子14及信號分子S量則越多。又由于非與微粒12結合的分析物A于進行步驟S3時會被濾除，因此，最后檢測被保留在反應容器11中的信號分子S強度，將與所加入的分析物A濃度成反比，因而能間接推知分析物A的濃度。
[0059]當然，若用于三明治分析方法時，加入至反應容器中的溶液還包括至少一識別分子，識別分子能與分析物或其競爭物特異性結合，并能直接或間接地接合至微粒上。請參照圖3、圖1C及圖1D所示。同樣地，識別分子13能與分析物A特異性結合。在本實施例中，識別分子13為能與分析物A相結合的抗體。識別分子13能如圖1C所示，直接結合于微粒12的表面。或是，為使識別分子13能穩定地結合于微粒12上，于步驟SI前，如圖1D所示，微粒12可先直接結合第一配體LI，而識別分子13結合第二配體L2，而第一配體LI與第二配體L2的結合方式已于前文中詳細描述。然而，依所使用不同的第一配體LI及第二配體L2而有不同的結合手段。待識別分子13與微粒12直接或間接結合后，即加入分析物A或其競爭物Al以與識別分子13結合，進而將分析物A或其競爭物Al直接或間接結合于微粒12上(步驟SI)。而后續施用于三明治分析方法的步驟S2、步驟S3及步驟S4如上所述，故在此不再贅述。
[0060]以下，本發明將以一實施例說明本發明的分析方法，能快速準確建立檢測分析的標準曲線及多重分析的可行性。
[0061]實驗例:本發明的分析方法以競爭型分析法分析抗生素
[0062]于本實驗例中，分析試劑盒所采用的各組件及其連結關系如圖4A所示。其中，微粒12為樹脂材料制成的粒子。分析物A及其競爭物Al均為慶大霉素硫酸鹽(gentamycinsulfate),微粒12上具有的多個第一配體LI為鏈霉親和素(streptavidin),慶大霉素以上述的方法標定生物素(biotin)后與微粒12的卵蛋白結合，形成慶大霉素微粒。而在本實驗例中，反應容器11為一濾盤。
[0063]首先以牛血清蛋白阻斷在后續所有步驟中非特異性的吸附濾盤的可能性，接著將慶大霉素微粒與6種具有不同濃度的慶大霉素樣品(0(負控制組)、0.05、0.1、1、10以及100 μ g/mL)加入底部有封膜的濾盤中，利用微量盤式震動儀(micromixer，TAITEC)混合均勻數秒后加入所需要的抗慶大霉素抗體溶液在室溫下反應I小時，待反應過后移除封合件112，在此以鋁箔封膜為例，并將TBS-蔗糖加入濾盤中，使反應后除了接有抗慶大霉素抗體的慶大霉素微粒以及未接有抗慶大霉素抗體的慶大霉素微粒以外，其余的抗慶大霉素抗體-慶大霉素、抗慶大霉素抗體、剩余的慶大霉素樣品皆隨TBS-蔗糖溶液流出濾盤以達到分離清洗的效果，總共清洗三次，最后一次清洗步驟后離心將多余液體移除。再次將96孔濾板底部加上鋁箔封膜，加入含信號復合物的溶液，即含有蛋白質G-微脂體-SRB信號分子的溶液反應30分鐘，移除封合件112以后仍使用TBS-蔗糖溶液清洗，將多余的蛋白質G-微脂體-SRB洗除，清洗共兩次，同樣通過離心將多余液體移除。最后將濾盤按照各個孔洞的編號相對應地組合在一般96孔濾板上,加入界面活性劑n-OG(noctyl-beta-d-glucopyranoside)將各孔洞中蛋白質G-微脂體-SRB打破并且通過離心將濾盤中因打破蛋白質G-微脂體-SRB而釋放出來的SRB接入一般96孔黑盤中，最終以synergy 2 (Synergy 2Mult1-Mode microplate reader, BioTek)在激發光 540nm 以及吸收光 590nm 的條件下測量記錄熒光信號的強弱，而后再統計分析。
[0064]利用本發明的分析方法，進行針對慶大霉素的檢測，在6種不同的慶大霉素濃度五次重復下，同時在一個濾盤上一共30個孔洞中分別進行如同上述的高通量濾盤微珠式競爭型分析反應。其中，6種慶大霉素濃度包含分別在TBS(Tris buffered saline)溶液中濃度為0(負控制組)、0.05,0.U0.2,0.5以及I μ g/mL的慶大霉素，測量最后收集于一般96孔黑盤的熒光信號以后，結果如圖5A所示，本發明的分析試劑盒及分析方法所得到的檢測結果具有穩定的線性關系(R2 = 0.995)。另外，在本發明另一實驗例中，樣品為配制在脫脂牛奶中含有不同濃度的慶 大霉素溶液，并且依上述的實驗步驟，依然可以檢測到R2 =
0.9314的線性關系。在此實驗結果中更說明了，本發明的分析試劑盒及分析方法具有極佳的特異性，于分析過程中不會受到溶液中其它物質的干擾。因此，在得到的穩定的標準曲線且具特異性的分析條件下，本發明的分析試劑盒及分析方法能還進一步對未知濃度的分析物進行檢測，而可得到準確地檢測結果。
[0065]為了測量飽和的劑量反應曲線(Dose response curve)選擇O (負控制組)、
0.05、0.1、1、10 以及 100 μ g/mL。結果如圖 5B 所示，定義檢測極限(Limit ofdetection,L0D)為該濃度的信號值為負控制組的數據平均扣除三倍負控制組數據標準差(standarddeviation, SD)。樣品配制在TBS溶液中所得到的LOD為52.65ng/mL,以及樣品配制在脫脂牛奶中所得到的LOD為14.16ng/mL，足以檢測慶大霉素的法規所定的最高殘余限量(Maximum residue level, MRL)為200ng/mL。除此之外,本發明的分析試劑盒及分析方法能將此30個標準品的實驗在2小時以內即可完成，具有快速準確分析的功效。
[0066]綜上所述，本發明所提供的一種分析試劑盒，通過微粒的粒徑大于濾膜孔洞，能快速經由濾除方式將直接或間接結合在微粒上的分析物或其競爭物或識別分子與其它物質分離，并進行定量分析。如此一來，能改善現有技術中需以提供磁性將磁珠于分離時的復雜程序。本發明的分析試劑盒還兼具分析容易且設備器材成本較低且能廣泛應用于各種分析法等優勢，且反應容器能依據分析所需而制成各種容積，因此還能應用于高通量的分析。另外，本發明亦提供一種分析方法，連同本發明的分析試劑盒，能實施間接型酶聯免疫吸附法、競爭型酶聯免疫吸附法以及夾心法酶聯免疫吸附法，相較現有技術的分析方法可還為快速且靈敏地分析及定量分析物。
[0067]以上所述僅為舉例性，而非為限制性。任何未脫離本發明的精神與范疇，而對其進行的等效修改或變更，均應包含于后附的權利要求中。
[0068]【主要組件符號說明】
[0069]1、2:分析試劑盒
[0070]11:反應容器
[0071]111:濾膜
[0072]112:封合件
[0073]12:微粒
[0074]13、14:識別分子
[0075]15:信號復合物[0076]A:分析物
[0077]Al:競爭物
[0078]L1:第一配體
[0079]L2:第二配體
[0080]L3:第三配體
[0081]P:孔洞
[0082]S:信號分子
[0083]SI ?S4:步驟
【權利要求】
1.一種分析試劑盒,與分析物反應,所述分析試劑盒包括: 多個反應容器，分別包括濾膜，所述濾膜具有多個孔洞；以及 多個微粒，各微粒的粒徑大于各孔洞，且直接或間接與所述分析物或其競爭物或識別分子接合。
2.如權利要求1所述的分析試劑盒，其中所述孔洞的孔徑介于Inm至Icm之間。
3.如權利要求1所述的分析試劑盒，其中所述微粒的材料包括玻璃、乳膠、橡膠、磁石、樹脂、金屬、陶瓷、多糖、塑料、或硅。
4.如權利要求1所述的分析試劑盒，其中所述分析物或其競爭物或所述識別分子為蛋白質、肽、核酸、糖類、化合物、細胞、或微生物。
5.如權利要求1所述的分析試劑盒，其中所述識別分子與所述分析物或其競爭物結口 ο
6.如權利要求1所述的分析試劑盒，還包括: 多個信號分子，分別與所述分析物或其競爭物或所述識別分子結合。
7.如權利要求6所述的分析試劑盒，其中所述信號分子包括酶、酶受體、顯色劑、放射性物質、納米脂粒、金屬化合物。
8.如權利要求1所述的分析試劑盒，還包括: 封合件，設置于所述濾膜的流出側。
9.一種分析方法，與分析物反應的分析試劑盒配合，所述分析試劑盒包括多個反應容器以及多個微粒，各反應容器包括具有多個孔洞的濾膜，所述分析方法包括: 將具有所述分析物或其競爭物或識別分子的溶液加入各反應容器，所述微粒分別與所述分析物或其競爭物或所述識別分子進行直接或間接結合； 加入多個信號分子，所述信號分子連接至所述分析物或其競爭物或所述識別分子； 濾除所述反應容器中的所述溶液；以及 檢測所述信號分子所產生的信號強度。
10.如權利要求9所述的分析方法，其中各微粒的粒徑大于各孔洞。
11.如權利要求9所述的分析方法，其中所述識別分子與所述分析物或其競爭物接合。
【文檔編號】G01N33/543GK103954765SQ201310292413
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2013年7月12日 優先權日:2012年7月24日
【發明者】陳健生, 何天瑜 申請人:國立中央大學