用于胞內傳遞生物活性分子的官能化納米粒子的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種官能化生物相容性納米粒子，其能夠穿透哺乳動物細胞膜并胞內傳遞用于調節細胞功能的多個生物活性分子。該官能化生物相容性納米粒子包括：中央納米粒子，該中央納米粒子的尺寸范圍為約5nm至約50nm，并且在其上具有聚合物涂層，共價連接于所述聚合物涂層的多個官能團，其中多個生物活性分子連接于所述多個官能團，并且其中所述多個生物活性分子至少包括肽和蛋白質，其中所述肽能夠穿透哺乳動物細胞膜并進入細胞，其中所述蛋白質能夠在細胞內提供新功能。該蛋白質可以是選自Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、cMyc和Klf4的轉錄因子。
【專利說明】用于胞內傳遞生物活性分子的官能化納米粒子
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求申請號為61/550, 213、申請日為2011年10月21日的美國臨時申請的 優先權，該申請的全部內容通過引用并入本文。

【技術領域】
[0003] 本發明主要涉及有機合成和納米生物技術，更具體而言，涉及用于將生物活性分 子傳遞到細胞內以調節細胞功能的官能化納米粒子以及與之相關的方法。

【背景技術】
[0004] 細胞正常增殖、遷移和分化成各種細胞類型的能力對胚胎形成和成熟細胞，包括 但不限于各種遺傳性或獲得性疾病中造血細胞和/或心血管系統細胞的功能是至關重要 的。干細胞和/或進一步分化的特化細胞類型的功能性能力在各種病理狀態下會發生變 化，但是可通過胞內引入生物活性成分而正常化。例如，觀察到周期性中性粒細胞減少癥 或嚴重的先天性中性粒細胞減少癥患者中有異常的細胞功能，例如骨髓干細胞/祖細胞的 存活和/或分化為中性粒細胞的能力受損，此類患者可能患有嚴重的危及生命的感染，并 可能發展成急性髓細胞性白血病或其他惡性腫瘤[Aprikyan等，Impaired survival of bone marrow hematopoietic progenitor cells in cyclic neutropenia(在周期性中 性粒細胞減少癥中受損的骨髓造血祖細胞的存活），Blood，97,147(2001) ;GoranCarlsson 等，Kostmann syndrome:severe congenital neutropenia associated with defective expression of Bcl-2,constitutive mitochondrial release of cytochrome C，and excessive apoptosis of myeloid progenitor cells (科斯特曼綜合征：與 Bcl_2 蛋 白缺陷表達、細胞色素 C的組成性線粒體釋放及骨髓袓細胞的過度凋亡相關聯的嚴重先 天性中性粒細胞減少癥），Blood，103,3355(2004)]。遺傳性或獲得性疾病，例如嚴重的 先天性中性粒細胞減少癥或巴特綜合征是由各種基因突變引發的，并且因患者的血液 和/或心肌細胞的制造和功能不足導致隨后的中性粒細胞減少癥、心肌梗塞和/或心力 衰竭[Makaryan 等，The cellular and molecular mechanisms for neutropenia in Barth syndrome(巴特綜合征中中性粒細胞減少癥的細胞和分子機制），Eur J Haematol， 88:195-209(2012)]。嚴重的先天性中性粒細胞減少癥的表型可由中性粒細胞彈性蛋白酶 基因、HAX1基因或Wiskott-Aldrich綜合征蛋白基因的不同取代、缺失、插入或截短突變引 起[Dale等，Mutations in the gene encoding neutrophil elastase in congenital and cyclic neutropenia(先天性和周期性中性粒細胞減少癥中編碼中性粒細胞彈性蛋白酶的 基因的突變），Blood，96:2317_2322(2000) ;Devriendt 等，Constitutively activating mutation in WASP causes X-linked severe congenital neutropenia (WASP 中的組成性 激活突變導致X-連鎖的嚴重的先天性中性粒細胞減少癥），Nat Genet. 27:313-7(2001); Klein 等，HAX1 deficiency causes autosomal recessive severe congenital neutropenia (Kostmann disease) (HAX1缺乏導致常染色體隱性遺傳的嚴重先天性中性粒 細胞減少癥（科斯特曼病）），Nat Genet，39:86-92 (2007)]。
[0005] 其他遺傳性疾病，如巴特綜合征，是一種可能由線粒體TAZ基因的功能缺失突變 所引發的多系統干細胞疾病，該類疾病與中性粒細胞減少癥（血中性粒細胞水平下降）相 關聯，該類遺傳性疾病可能會導致復發性的嚴重的、有時甚至危及生命的致命性感染和/ 或可能會導致心力衰竭的心肌梗塞，該心力衰竭可通過心臟移植來解決。在大多數情況下， 與發病機制和遺傳性或獲得性人類疾病的發展相關聯的該突變基因產物會影響不同的細 胞內事件（intracellular events),這會導致異常的細胞功能和特定的疾病表型。
[0006] 用粒細胞集落刺激因子（G-CSF)治療這些患者會誘導位于細胞表面的G-CSF受 體分子發生構象變化，隨之引發一系列的細胞內事件，最終將中性粒細胞的生產恢復至接 近正常水平，并提高患者的生活質量[Welte和Dale, Pathophysiology and treatment of severe chronic neutropenia(嚴重的慢性中性粒細胞減少癥的病理生理學和治 療），Ann.Hematol. 72, 158(1996)]。然而，用G-CSF治療的患者可能進化發展為白血 病[Aprikyan 等，Cellular and molecular abnormalities in severe congenital neutropenia predisposing to leukemia(嚴重的先天性中性粒細胞減少癥中的細胞和分 子異常易誘發白血病），Exp Hematol.31, 372(2003) ;Philip Rosenberg 等，Neutrophil elastase mutations and risk of leukaemia in severe congenital neutropenia(嚴 重的先天性中性粒細胞減少癥中中性粒細胞彈性蛋白酶突變和白血病的風險），Br J Haematol. 140,210 (2008) ;Peter Newburger 等，Cyclic Neutropenia and Severe Congenital Neutropenia in Patients with a Shared ELANE Mutation and Paternal Haplotype: Evidence for Phenotype Determination by Modifying Genes (共有ELANE 突 變和父源單倍型患者的周期性中性粒細胞減少癥和嚴重的先天性中性粒細胞減少癥：通過 修飾基因測定表型的證據），Pediatr. Blood Cancer, 55, 314 (2010)]，這正是探索新的替代 方法的原因。
[0007] 可以通過使用截然不同的官能化納米粒子胞內傳遞不同的生物活性分子，從而能 夠更有效地影響和調節細胞內事件。這些生物活性分子可以使細胞功能正常化或根據需要 消除不需要的細胞。然而，細胞膜作為有效屏障保護細胞內事件的級聯反應免受外源性刺 激的影響。
[0008] 因此，在本領域中需要新型的生物活性分子，其能夠穿透細胞膜并實現所關心的 細胞內事件。本發明滿足了這些需要，并提供了更多相關的優點。


【發明內容】

[0009] 在一些實施方案中，本發明涉及將蛋白質和/或肽連接于生物相容性納米粒子以 調節細胞功能的官能化方法。在一些實施方案中，本發明涉及官能化生物相容性納米粒子 本身。
[0010] 在一個實施方案中，一種能夠穿透哺乳動物細胞膜并胞內傳遞用于調節細胞功能 的多個生物活性分子的官能化生物相容性納米粒子，包括：中央納米粒子，尺寸范圍為5? 50nm，且在其上具有聚合物涂層；共價連接于所述聚合物涂層的多個官能團，其中所述多個 生物活性分子連接于所述多個官能團，并且其中所述多個生物活性分子至少包括肽和蛋白 質，并且其中所述肽能夠穿透哺乳動物細胞膜并進入細胞，并且其中所述蛋白質能夠在細 胞內提供新功能。
[0011] 中央納米粒子可包括鐵，并有磁性。本發明所述的肽可以連接于蛋白質（相反側 連接于納米粒子）。肽和蛋白質可各自通過一個或多個插入連接子分子而連接于納米粒子。 在一些實施方式中，肽可以包括5?9個堿性氨基酸，而在其他實施方式中，肽包括9個以 上堿性氨基酸。該蛋白質可以是選自由0ct4、Sox2、Nanog、Lin28、cMyc和Klf4組成的組 的轉錄因子。
[0012] 另一方面，本發明涉及改變哺乳動物細胞內的細胞功能的方法。該新方法包括將 有效量的官能化生物相容性納米粒子給予細胞，并改變細胞內的細胞功能。細胞功能的改 變涉及細胞理化特性的改變、細胞增殖特性的改變、細胞存活能力的改變或細胞形態學表 型特性的改變。細胞功能的變化涉及細胞制造新細胞類型的獲取能力，所述新細胞類型包 括干細胞或更多特化細胞類型。
[0013] 本發明的上述及其他方面通過參考下面的詳細描述和附圖將變得更為清楚。但 是，應當理解的是，可在不脫離本發明主旨和保護范圍的前提下對本說明書中公開的實施 方式進行各種改變、變更和替換。最后，本說明書中引用的各種參考文獻都明確地通過引用 并入本文。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1示出根據本發明實施例的基于肽和蛋白質分子同時連接于納米粒子的納米 粒子多步驟官能化方案。
[0015] 圖2A示出根據本發明實施例的含胺基納米粒子與等摩爾比的長鏈LC1-SPDP和碘 乙酸納米粒子的反應。
[0016] 圖2B示出根據本發明實施例，還原PDP的二硫鍵以提供自由SH基納米粒子。
[0017] 圖2C示出根據本發明實施例的長鏈LC1-SMCC與蛋白質納米粒子的賴氨酸基團的 反應。
[0018] 圖2D示出根據本發明實施例的多功能納米粒子與蛋白質的反應，該蛋白質已經 與SMCC反應并且包含末端反應性馬來酰亞胺基納米粒子。
[0019] 圖2E示出肽的氨基與LC2-SMCC的反應。根據本發明實施例，該反應后隨之進行 與巰基乙醇的反應，將末端馬來酰亞胺轉化為醇納米粒子。
[0020] 圖2F示出根據本發明實施例的功能珠（和連接有蛋白質）與帶修飾的肽的在納 米粒子上自由羧基端的反應。
[0021] 圖3示出根據本發明實施例的含胺基的納米粒子與LC1-SPDP納米粒子的反應。
[0022] 圖3B示出根據本發明實施例，還原PDP的二硫鍵以提供自由SH基納米粒子。
[0023] 圖3C示出根據本發明實施例的長鏈LC2-SMCC與蛋白質納米粒子的賴氨酸基團的 反應。
[0024] 圖3D示出根據本發明實施例的多功能納米粒子與蛋白質的反應，該蛋白質已經 與SMCC反應并且包含了末端反應性馬來酰亞胺基納米粒子。
[0025] 對本領域普通技術人員來說，結合附圖參考以下詳細描述時，本發明的上述和其 它方案將變得更加清楚。

【具體實施方式】
[0026] 為了胞內傳遞生物活性分子，本發明的發明人提出了一種基于帶有共價連接的生 物活性分子的細胞膜穿透性納米粒子的通用手段。為此，本發明人在此提出一種新官能化 方法，其確保了蛋白質和肽對納米粒子的共價連接。本發明的經修飾了的細胞透過性納米 粒子為胞內傳遞用于調節細胞功能和/或細胞功能正常化的生物活性分子提供了通用機 制。
[0027] 細胞正常增殖、遷移和分化成各種細胞類型的能力對胚胎發育和成熟細胞，包括 但不限于各種遺傳性或獲得性疾病中造血細胞和心血管系統的干細胞/祖細胞和進一步 分化的細胞的功能是至關重要的。干細胞和/或進一步分化的特化細胞類型的這種功能性 能力在細胞內事件中的異常改變所導致的各種病理狀態下會發生改變，但可通過胞內引入 生物活性成分而正常化。例如，在患有嚴重的危及生命的感染并可能發展成白血病的周期 性中性粒細胞減少癥或嚴重的先天性中性粒細胞減少癥患者中觀察到人骨髓祖細胞的存 活和/或分化為中性粒細胞的能力受損，其可通過中性粒細胞彈性蛋白酶的細胞膜穿透性 小分子抑制劑而正常化，它干擾異常的細胞內事件并明顯地恢復正常表型。然而，這種小分 子對導致疾病的目標突變產物基本無效，這正是需要用于胞內傳遞能夠調節細胞功能的生 物活性分子的可替代性的有效的細胞膜穿透手段的原因。
[0028] 本說明書中公開的方法利用生物相容性納米粒子，包括例如類似于前文在科學 文獻中描述的超順磁性氧化鐵粒子。這種類型的納米粒子在臨床環境中可被用于骨髓細 胞、淋巴結、脾臟和肝臟的磁共振成像[參見例如Shen等，Monocrystalline iron oxide nanocompounds (MI0N)(單晶氧化鐵納米復合物（MION)) ;physicochemical properties. Magn. Reson. Med. , 29, 599 (1993) ；Harisinghani 等，MR lymphangiography using ultrasmallsuperparamagnetic iron oxide in patients with primary abdominal and pelvic malignancies (對原發性腹腔和盆腔惡性腫瘤患者利用超小超順磁氧化鐵 的MR淋巴管造影），Am. J. Roentgenol. 172, 1347 (1999)]。這些磁性氧化鐵納米粒子包 含5nm左右的涂覆有交聯葡聚糖的核，并具有大約45nm的總粒子尺寸。重要的是，已經 證明這些包含交聯的細胞膜可透過性Tat-衍生肽的納米粒子，以每個細胞高達30pg的 超順磁氧化鐵納米粒子的量，有效地內在化到造血細胞和神經祖細胞中[Lewin等，Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells (Tat肽衍生磁性納米粒子實現在體內祖細胞的跟蹤和恢復），似1:· Biotechnol. 18, 410 (2000)]。此外，納米粒子的插入不影響骨髓衍生⑶34+原始祖細胞的 增殖和分化特性或細胞存活能力[MaiteLewin等，Nat.Biotechnol.l8,410(2000)]。這些 納米粒子可用于在體內跟蹤標記細胞。
[0029] 標記細胞保持其分化能力，還可以使用磁共振成像在組織樣品中被檢測到。本發 明人在此提出基于新納米粒子的手段，其被功能化以攜帶肽和蛋白質，所述肽和蛋白質可 以作為優良的載體胞內傳遞生物活性分子用于目標細胞內事件的細胞重編程解決方案并 且調節細胞功能和特性。
[0030] 納米粒子-肽/蛋白質耦合物的概述：
[0031] 納米粒子基于鐵或帶有生物相容性涂層（例如葡聚糖多糖）的其它材料，其具有 連接有不同長度的連接子的X/Y官能團，反過來通過它們的X/Y官能團共價連接于蛋白質 和/或肽（或其它小分子）。
[0032] 可用于交聯的官能團包括：
[0033] -NH2(例如，賴氨酸，α-ΝΗ2);
[0034] -SH,
[0035] -C00H,
[0036] -NH-C (ΝΗ) (ΝΗ2)，
[0037] 碳水化合物，
[0038] -羥基（0Η)，
[0039] -通過連接子上的疊氮基的光化學反應連接。
[0040] 交聯試劑包括：
[0041] SMCC[4-(Ν-馬來酰亞胺基-甲基）環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯]也可以是磺 基-SMCC，該磺基琥珀酰亞胺基衍生物用于交聯氨基和巰基。
[0042] LC-SMCC (長鏈 SMCC)。也可以是磺基-LC-SMCC。
[0043] srop [Ν-琥珀酰亞胺基-3-(吡啶基二硫代）-丙酸酯]也可以是磺基-srop。與 胺反應提供疏基。
[0044] LC-SPDP (長鏈 SPDP)。也可以是磺基-LC-SPDP。
[0045] EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽]用于將-C00H基團與-NH2 基團連接的試劑。
[0046] SM(PEG)n，其中η = 1，2,3,4……24乙二醇單位。也可以是磺基_SM(PEG)n衍生 物。
[0047] SPDP(PEG)n，其中 n = 1，2,3,4......12 乙二醇單位。也可以是磺基-SH)P (PEG)η 衍生物。
[0048] 同時含有羧基和胺基的PEG分子。
[0049] 含有羧基和巰基的PEG分子。
[0050] 封端劑和阻斷劑包括：
[0051] 檸康酸酐-對NH特異性
[0052] 乙基馬來酰亞胺-對SH特異性
[0053] 巰基乙醇-對馬來酰亞胺特異性
[0054] 鑒于上述情況，本發明人處理了生物相容性納米粒子以在表面上產生功能性胺， 其反過來被用于化學鍵合蛋白質和短肽。
[0055] 在將蛋白質，例如綠色熒光蛋白或轉錄因子，連接于超順磁性納米粒子或可替代 的納米粒子的情況下，可采用以下方法：外部包含氨基官能團的超順磁珠可以通過商業渠 道從不同的制造商處購得。它們的尺寸范圍可以是20-50nm，每毫升具有10 15-102°個納米 粒子，每個納米粒子具有10個以上胺基團。將納米粒子通過使用截留分子量為10, 〇〇〇道 爾頓分子的Amicon離心過濾單元（微柱）放置到適當的反應緩沖液（0. 1M磷酸鹽緩沖液， pH7. 2)中。通常要求清洗大約四次以確保適合的緩沖系統。按照制造商所推薦的那樣，將 納米粒子從過濾器單元中移出（通過低速旋轉翻轉柱/過濾裝置）。
[0056] 將SMCC(來自Thermo Fisher)以lmg/ml的濃度溶解于由ACR0S(密封小瓶且無 水）得到的二甲基甲酰胺（DMF)。樣品密封且幾乎立即使用。
[0057] 將10 μ 1溶液加入到納米粒子中至體積為200 μ 1。這提供了相對于存在的可用胺 基團遠遠過量的SMCC，使反應進行1小時。可以用截留分子量為3000道爾頓分子的Amicon 離心過濾柱移除過量的SM和DMF。通常要求5次體積更換以確保適當的緩沖交換。重要的 是過量的SMCC在這個階段被除去。
[0058] 將任何肽基分子，例如市售可得的綠色熒光蛋白（GFP)或純化的重組綠色熒光蛋 白或其它蛋白質加入到含有一定量的乙二醇的溶液中，在_30°C冷凍。邊劇烈攪拌邊加入在 14 μ 1、10 μ 1新鮮制備的DTT (二硫蘇糖醇，克萊蘭氏試劑）中含3 μ g蛋白質的PBS溶液。 因為蛋白質通常含有一個以上的半胱氨酸，傾向于交聯不同的GFP分子。因此，過量的DTT 還原二硫鍵并釋放綠色熒光蛋白。使反應在4°C進行2小時，然后通過截留分子量為3000 的分子的Amicon離心過濾單元除去過量的試劑。
[0059] 將活化的納米粒子和蛋白質溶液混合，并使其反應2小時，之后將未反應的蛋白 質通過具有適當的截留分子量（在使用GFP的本例中截留分子量為50, 000道爾頓）的 Amicon離心過濾裝置除去。樣品儲存于-80°C。也可以代替使用Amicon旋轉過濾柱，使用 含有固定尺寸過濾組件的小旋轉柱、例如Bio Rad P柱。它們都是尺寸排阻柱。還應當指 出的是SMCC也可以作為磺基衍生物（磺基-SMCC)購得，使其更溶于水。也可以用DMS0代 替DMF作為標記試劑的溶劑載體，另外它應該是無水的。
[0060] 所有的其他交聯試劑都可以以類似的方式被使用。SPDP也是以與SMCC相同的方 式被施用于蛋白質/適當的肽。它易溶于DMF。二硫鍵通過與DTT反應1小時或1小時以 上而被切斷。除去副產物和未反應的材料后，通過使用截留分子量為3, 000的Amicon離心 過濾柱將其純化。
[0061] 其他更直接可控的用肽和蛋白質標記納米粒子的手段是使用兩種不同的雙官能 耦合劑。反應順序有些類似于圖1。碘乙酸用于將選定數量的"羧基"基團引入到納米粒子 表面。
[0062] 用氨基巰基乙醇處理含LC-SMCC的肽。這能夠通過巰基成鍵，并提供自由氨基。然 后通過使用EDC將此氨基與納米粒子上的羧基耦合。已知EDC為1-乙基-3 [3-二甲基氨 基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽。該耦合步驟在反應方案的最后執行。
[0063] 圖1示出磁性納米粒子-蛋白質/肽加成物的一般性描述。磁性納米粒子涂覆有 多糖，然后被官能化。其表面可以被胺取代。也可以改變/變形成任何其他的功能形式。擴 展子/連接子將兩個單元物理性連接在一起。
[0064] 各種各樣的官能團可被用于通過交聯反應將納米粒子化學連接于蛋白質。可用的 官能團的變化允許每次一個步驟地將大量的蛋白質/肽連接于納米粒子。
[0065] 類似地，各種交聯試劑或反應催化劑可被用于通過異型雙官能試劑將納米粒子與 蛋白質/肽交聯。還應當指出的是這些交聯試劑有不同的長度。例如許多包含代表擴展子 或"長鏈"的LC符號。聚乙二醇化的化合物也可為不同的長度。這樣不同長度的連接子可 以被加入到該納米粒子中，并對較大的分子（例如蛋白質）和小分子（例如肽）提供不同 的連接長度。
[0066] 通常，不同蛋白質可能會含有相同的官能團，因此很難用各種蛋白質來標記納米 粒子。因為有使官能團發生變化的試劑，所以，能夠改變蛋白質的官能團，從而階段性地獲 得選擇性而不會受到其他蛋白質的干擾。這需要改變蛋白質上的官能團。
[0067] 各種試劑可以用于改變蛋白質，以便不同的化學作用可以用于由所希望的官能團 連接蛋白質。例如，化合物（如SPDP)可以用于將胺轉換為巰基，然后其將與馬來酰亞胺部 分反應。
[0068] 在逐步地將蛋白質連接于珠（納米粒子）時，先前連接的蛋白質的殘基和活性基 團可能干擾耦合化學作用。因而可使用永久性或可逆的封端劑阻斷這些活性部分以免受將 要用于連接第二個或第三個蛋白質到納米粒子上的試劑的干擾。
[0069] 可使用大量不同的封端化合物阻斷未反應部分。因為封端化合物也可能會干擾蛋 白質活性，所以需要謹慎使用。通常在第二個化學連接步驟是必需的，并且該官能團可能會 干擾時使用。
[0070] 為了表明蛋白質可以使用上面提到的化學作用連接于珠（納米粒子），給出了磁 性納米粒子的合成，其包含源自水母的綠色熒光蛋白質。LCC-SMCC被用于該合成方案。
[0071] N-羥基琥珀酰亞胺與納米粒子上的自由胺基團發生化學反應以形成化學鍵。提 供能與GFP反應的馬來酰亞胺端基。已知GFP具有兩個半胱氨酸，并且來自不同的GFP分 子的半胱氨酸會反應形成二硫鍵。為了消除這種干擾，首先用克萊蘭氏試劑（Cleland' s reagent)還原該分子。
[0072] 將該蛋白質純化，然后使其與含有LC-馬來酰亞胺基團的珠反應。使反應進行1 小時，用Amicon旋轉過濾器（截留分子量50K)純化反應。用熒光電子顯微鏡拍攝照片。
[0073] 可以在納米粒子上設置多種類型的官能團。使其能夠連接三個以上不同的蛋白 質。
[0074] 首先是與表面上的胺。
[0075] 特勞特試劑（Traut's reagent)可用于將這些胺中的一部分轉化為巰基。除此之 夕卜，碘乙酸可以用于將部分胺轉化為羧酸。
[0076] 對于蛋白質和肽，胺都被轉化為如下詳細描述的具有不同連接子長度的官能團。 其將作為通用基團來連接蛋白質和肽。
[0077] 圖1示出納米粒子官能化、肽類和蛋白質與納米粒子的連接的示意性代表例。
[0078] 如下所述地進行合成和涂覆：通過Thermo Fisher在市售可得的NHS-LC-SPDP是 長鏈擴展子，兩端帶有對胺特異性的雙官能耦合劑，并且具有可被轉化為硫化物的二硫鍵。
[0079] 擴展子的一端有N-羥基琥珀酰亞胺酯，而另一端具有吡啶基二硫代基團。這個二 硫代基團可以被還原而生成巰基。使NHS-LC-SPDP與納米粒子反應，反應可以從未被摻入 的NHS-LC-SH)中清除。然后如圖1所示將耦合納米粒子還原。
[0080] 制造耦合蛋白質：用親和層析柱純化的生物活性蛋白質含有來自羧基末端賴氨 酸殘基的自由ε -胺基團，羧基末端賴氨酸殘基是為了促進與納米粒子連接而加入的。 NHS-LC-SMCC用作雙官能耦合劑。該分子具有LC1鏈擴展子。一端具有胺特異性的Ν-羥基 琥珀酰亞胺試劑。另一端包含馬來酰亞胺基團，具體為巰基。一旦材料與蛋白質連接，就從 反應混合物中分離出來，馬來酰亞胺耦合蛋白質將被添加到該含巰基的納米粒子中。所得 材料通過凝膠過濾而分離。
[0081] 肽耦合到納米粒子：在這種情況下，肽還包含羧基末端賴氨酸，其作為NHS 酯-LC-馬來酰亞胺耦合的基體發揮作用。該分子具有LC2鏈擴展子。所有流程都類似于 上述對蛋白質的描述。
[0082] 在最佳實施方式中，膜透過性肽和蛋白質將被以不同的比例混合，以實現最大數 目的分子連接于納米粒子。根據之前公布的研究，每個納米粒子具有3?4個分子的表面 結合細胞透過性肽就足以進行有效的超順磁性納米粒子的胞內傳遞。
[0083] 利用LC2-擴展臂提供了增加肽基分子鍵合量的重要手段。使用不同濃度的 NHS-LC-SPDP使錨定在納米粒子表面的肽和蛋白質分子的數量增加，因此，能夠實現更有效 的滲透以及更可靠的細胞重編程活性。
[0084] 肽和蛋白質連接于納米粒子：可以使用圖1所示的流程來實現。在這種情況下，將 SMCC標記的蛋白質和肽按比例加入到珠中并使其反應。
[0085] 用肽和蛋白質標記納米粒子的另一種更直接可控的手段是使用兩種不同的雙官 能耦合試劑（圖2A-F)。反應順序有些類似于圖1，一些改進之處在下文中描述。
[0086] 碘乙酸用于將選定數量的"羧基"基團引入到納米粒子表面。這是在步驟I中進 行的（參見圖2A-F，步驟（I-VII))。
[0087] 用氨基乙醇處理含有NH-LC-SMCC的肽。這能夠通過巰基成鍵，并提供自由氨基基 團。然后使用EDAC (EDC)將此氨基耦合于納米粒子上的羧基。已知EDAC為1-乙基-3 [3-二 甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽。該耦合步驟在反應方案的最后執行。
[0088] 另一方面，本發明還涉及用于調節胞內活性的連接于官能化納米粒子的生物活性 分子的傳遞方法。例如，首先將人體細胞、成纖維細胞或者市售可得的或使用標準或改良實 驗步驟可獲得的其它類型的細胞在無菌條件下平鋪（plate)到具有或不具有細胞粘附底 物（飼養細胞，明膠、基質膠、纖連蛋白等）的固體表面。將平鋪細胞（plated cell)與特 定因子組合培養一段時間，使細胞分裂/增殖或維持可接受的細胞生存能力。實例是血清 和/或各種生長因子，它可以在之后被除去或更新，而繼續進行培養。在官能化生物相容性 細胞透過性納米粒子的存在下培養平鋪細胞，該官能化生物相容性細胞透過性納米粒子在 存在或不存在磁場的條件下使用此處描述的各種方法連接有生物活性分子。在超順磁性納 米粒子的情況下使用磁鐵使得細胞和納米粒子之間的接觸表面積呈現重要的增長，從而進 一步增強官能化納米粒子對細胞膜的穿透。根據需要，用官能化納米粒子反復處理細胞群， 以胞內傳遞生物活性分子。
[0089] 將細胞懸浮在培養基中，通過離心或細胞分離除去未摻入納米粒子，留下作為集 群存在的細胞。然后，將集群細胞再懸浮，并在新鮮的培養基中再培養一段適宜的時間。可 以通過分離、再懸浮和再培養的多次循環，直至觀察到胞內傳遞的特定生物活性分子引起 隨之發生的生物效應后收集細胞。
[0090] 本發明的一個用途是篩選對細胞重編程有效的一個化合物（或多個化合物）。該 化合物使用本說明書中公開的一個或多個方法以所希望的細胞群連接于納米粒子，培養適 當時間，然后測定由化合物產生的任何調節作用。可以包括：細胞重編程的開始和多功能干 細胞的產生，細胞分化或轉分化成進一步特化的或不同特化的細胞類型，檢查細胞毒性，代 謝變化或對收縮活動的效果等功能。
[0091] 本發明的另一種用途是生成作為藥物的特化細胞或在傳遞裝置中用以治療人體 或動物體。這使得臨床醫生能夠將細胞施用到受損組織（不論是心臟、肌肉、肝臟等）中或 周圍，該施用是經脈管系統施用或直接施用到肌肉或器官壁內，從而植入特化細胞，控制損 傷，并參與組織的肌肉組織再生和特化功能恢復。
[0092] 本發明的一種用途涉及用其他蛋白質（如0ct4和Sox2轉錄因子）官能化的納米 粒子，從而確保具有保存完好的基因組的干細胞或進一步分化的細胞類型的細胞重編程或 產生。
[0093] 本發明的另一種用途是篩選對細胞重編程有效的一個化合物（或多個化合物）。 該化合物使用本說明書中公開的多個方法以所希望的細胞群連接于納米粒子，培養適當時 間，然后測定由化合物產生的任何調節作用。可以包括：細胞重編程的開始和多功能干細胞 的產生，細胞分化或轉分化成進一步特化的或不同特化的細胞類型，檢查細胞毒性，代謝變 化或對收縮活動的效果等功能。
[0094] 本發明還有一種用途，就是生成作為藥物的特化細胞或在傳遞裝置中用以治療人 體或動物體。這使得臨床醫生能夠將細胞施用到受損組織（不論是心臟、肌肉、肝臟等）中 或周圍，該施用經脈管系統施用或直接施用到肌肉或器官壁內，從而植入特化細胞，控制損 傷，并參與組織的肌肉組織再生和特化功能恢復。
[0095] 作為進一步的說明（但并非是限制），下面的實施例公開了本發明的其它方面。
[0096] 實施例
[0097] 實施例1
[0098] 使用LC-SMM作為交聯劑將GFP連接到超順磁性粒子（連接于珠的胺基團），然后 將其直接耦合于GFP上的巰基。將LC-SMCC (來自Thermo Fisher)以lmg/μ 1的濃度溶解 在由ACR0S(密封小瓶且無水）得到的二甲基甲酰胺（DMF)。樣品密封且幾乎立即使用。
[0099] 將10 μ 1溶液加入到納米粒子中至體積為200 μ 1。這樣提供了相對于存在的可用 的胺基團遠遠過量的SMCC，使反應進行1小時。可以用截留分子量為3000道爾頓的分子的 Amicon旋轉過濾器移除過量的SMCC和DMF。通常要求5次體積更換以確保適當的緩沖交 換。重要的是過量的SMCC在這個階段被除去。
[0100] 將任何肽基分子、例如市售可得的綠色熒光蛋白（GFP)或純化的重組綠色熒光蛋 白或其它蛋白質加入到含有一定量的乙二醇的溶液中，在_30°C冷凍。邊劇烈攪拌邊加入 在14以1、10以1新鮮制備的01'1'(二硫蘇糖醇，克萊蘭氏試劑（(：161311(1'8代386111:))中含 3 μ g蛋白質的PBS溶液。因為蛋白質通常含有一個以上的半胱氨酸，傾向于交聯不同的GFP 分子。因此，過量的DTT還原二硫鍵并釋放綠色熒光蛋白。使反應在4°C進行2小時，然后 通過截留分子量為3, 000的Amicon離心過濾單元除去過量的試劑。
[0101] 將活化的納米粒子和蛋白質溶液混合，并使其反應2小時，之后將未反應的蛋白 質通過具有適當的截留分子量（在使用GFP的本例中截留分子量為50, 000道爾頓）的 Amicon離心過濾單元除去。樣品儲存于-80°C。還應當指出的是也可以使用SMCC的磺基 衍生物（磺基-SMCC)，其更溶于水。也可以用DMS0代替DMF作為標記試劑的溶劑載體，另 外它應該是無水的。
[0102] 實施例2
[0103] 在該方法中，使用賴氨酸的氨基對珠上的巰基進行耦合反應。在這些研究中使用 剛剛以ρΗ7· 2的0· 1M磷酸緩沖液平衡過的珠。新鮮配制lmg/ml (DMF中）的LC-SH)P。在 劇烈攪拌下將10 μ 1的SPDP溶液加入到珠懸浮液中，并使其反應1小時。接著，將未反應 的材料通過離心去除，并使用截留分子量為10Κ的Amicon旋轉過濾器以磷酸鹽緩沖液清洗 納米粒子。使用克萊蘭氏試劑切斷SPDP的二硫鍵，將lmg加入到溶液中，并使其反應1小 時。將副產物和未反應的克萊蘭氏試劑通過截留分子量為10K的Amicon旋轉過濾器除去。
[0104] 在上述反應的進行中，使用N-乙基馬來酰亞胺阻斷GFP。將過量的乙基馬來酰亞 胺加入到GFP溶液中。反應在室溫下進行1小時，用截留分子量為3K的Amicon旋轉過濾 器除去不需要的材料。然后，使GFP與過量的SMCC反應1小時。隨后，將GFP用旋轉柱純 化，然后與TOP-納米粒子反應。反應進行1小時，并用截留分子量為50K的Amicon旋轉過 濾器純化終產物。
[0105] 實施例3
[0106] 將從商業渠道獲得或使用所描述的標準試驗方法[Moretti等，Mouse and human induced pluripotent stem cells as a source for multipotent Isll cardiovascular progenitors (小鼠和人類誘導多能干細胞作為多能Isll心血管祖細胞的來源）。FASEB J. 24:700(2010)]獲得的人體成纖維細胞在無菌條件下以150, 000個細胞的密度平鋪在 6孔板中的固體表面，該固體表面有或沒有以150, 000-200, 000的密度預先平鋪的飼養細 胞。飼養細胞可通過商業渠道或用標準的實驗室方法獲得。將平鋪細胞與特定因子組合培 養一段時間，使細胞分裂/增殖或維持在含血清培養基中可接受的細胞存活能力，從而可 以在之后除去或再生，并在濕潤的培養箱（5% C02和環境02)中在無菌條件下持續培養。
[0107] 用50 μ 1含有官能化生物相容性細胞透過性納米粒子的懸浮液處理在錐形管底 部收集到的細胞或平鋪細胞，該官能化生物相容性細胞透過性納米粒子在存在或不存在磁 場的情況下使用本說明書中公開的各種方法連接有生物活性分子。
[0108] 在超順磁性納米粒子的情況下使用磁場使得細胞和納米粒子之間的接觸表面積 呈現重要的增長，從而確保官能化納米粒子對細胞膜的穿透進一步增強。重要的是，類似于 連接有PEG的聚（乙二醇）PEG-介導保護的幾種以蛋白質為基礎的藥物（PEG-GCSF，Amgen， CA ;PEG-干擾素，Schering-Plough/Merck，NJ)，用于與稱合肽連接的納米粒子增加了多肽 的尺寸并遮住蛋白質的表面，從而減少蛋白質被蛋白水解酶降解，從而獲得所使用的蛋白 質分子更長期的穩定性。根據需要，用官能化納米粒子反復處理細胞群，以胞內傳遞生物活 性分子
[0109] 將細胞懸浮在培養基中，通過以約1200Xg離心10分鐘除去未摻入的納米粒子， 留下作為集群存在的細胞。然后，將集群細胞再懸浮，再使用類似的流程清洗，并在新鮮的 培養基中再培養適當的時間。可以通過分離、再懸浮和在培養基中再培養的多次循環直至 觀察到胞內傳遞的特定生物活性分子引起隨之發生的生物效應，收集細胞。
[0110] 在使用綠色熒光蛋白的特定例中，細胞透過性納米粒子將蛋白質傳遞到細胞內， 通過靶細胞獲得新的綠色熒光。該新獲得的能力允許后續的分選，以及將帶有胞內傳遞的 蛋白質的細胞以高度均質化進行分離，其可進一步用于各種應用。重要的是，連接有蛋白質 的細胞透過性官能化納米粒子不會以任何形式整合到細胞基因組中，從而確保每個具有新 (在這種情況下為熒光）特性的細胞保持完整的基因組，并保留細胞DNA的完整性。
[0111] 在不脫離其主旨或本質特征的情況下，本發明可以以其他具體形式實施。因此，上 述實施方式應被認為是說明性的，而不是限制本說明書中描述的發明。因此，本發明的范圍 由所附的權利要求書而不是由前面的說明書來表示，并且在與權利要求等同的含義和范圍 內的所有改變都涵蓋于此。
【權利要求】
1. 一種官能化生物相容性納米粒子，其能夠穿透哺乳動物細胞膜并胞內傳遞用于調節 細胞功能的多個生物活性分子，包括： 中央納米粒子，其尺寸范圍為5?50nm，且在其上具有聚合物涂層， 共價連接于所述聚合物涂層的多個官能團，其中所述多個生物活性分子連接于所述多 個官能團，并且其中所述多個生物活性分子至少包括肽和蛋白質，并且其中所述肽能夠穿 透哺乳動物細胞膜并進入細胞，并且其中所述蛋白質能夠在細胞內提供新功能。
2. 根據權利要求1所述的官能化生物相容性納米粒子，其中，所述納米粒子包括鐵。
3. 根據權利要求2所述的官能化生物相容性納米粒子，其中，所述肽連接于所述蛋白 質。
4. 根據權利要求3所述的官能化生物相容性納米粒子，其中，所述肽和所述蛋白質各 自通過一個或多個插入連接子分子而連接于所述納米粒子。
5. 根據權利要求1所述的官能化生物相容性納米粒子，其中，所述肽包含5?9個堿性 氨基酸。
6. 根據權利要求1所述的官能化生物相容性納米粒子，其中，所述肽包括9個以上堿性 氨基酸。
7. 根據權利要求5所述的官能化生物相容性納米粒子，其中，所述蛋白質是轉錄因子。
8. 根據權利要求7所述的官能化生物相容性納米粒子，其中，所述轉錄因子選自由 0ct4、Sox2、Nanog、Lin28、cMyc 和 Klf4 組成的組。
9. 一種改變哺乳動物細胞內的細胞功能的方法，包括將有效量的權利要求1所述的官 能化生物相容性納米粒子給予細胞，并改變細胞內的細胞功能。
10. 根據權利要求9所述的改變哺乳動物細胞內的細胞功能的方法，其中，所述細胞功 能的改變涉及細胞理化特性的改變。
11. 根據權利要求9所述的改變哺乳動物細胞內的細胞功能的方法，其中，所述細胞功 能的改變涉及細胞增殖特性的改變。
12. 根據權利要求9所述的改變哺乳動物細胞內的細胞功能的方法，其中，所述細胞功 能的改變涉及細胞存活能力的改變。
13. 根據權利要求9所述的改變哺乳動物細胞內的細胞功能的方法，其中，所述細胞功 能的改變涉及細胞形態學表型特性的改變。
14. 根據權利要求9所述的改變哺乳動物細胞內的細胞功能的方法，其中，所述細胞功 能的改變涉及細胞成為新細胞類型的獲取能力，所述新細胞類型包括干細胞或更多特化細 胞類型。
【文檔編號】G01N33/53GK104094119SQ201280063870
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年10月22日 優先權日:2011年10月21日
【發明者】安德拉尼克·安德魯·阿普里克彥, 基利恩·迪爾 申請人:斯特姆詹尼克斯公司