專利名稱：植物組織快速石蠟制片的方法
技術領域：
本項發明涉及生物組織石蠟制片技術領域，特別涉及一種植物組織快速石蠟制片的方法。
背景技術：
石蠟制片技術的應用和發展已有150年的歷史。在人、動物、植物、昆蟲、微生物等研究領域都有廣泛的應用，由于可將生物組織材料制成很薄和連續的切片，并且玻片材料保存時間可長達數十年之久。因此成為生物學研究中最為完善的一種制片法。傳統的石蠟制片技術廣泛應用于植物學、植物解剖學、植物病理學等學科。其過程包括固定、脫水、透明、滲蠟、包埋、切片、黏片、展片、烤片、熔蠟、染色和封固等多個步驟。然而傳統的石蠟制片技術也有缺點制片步驟繁瑣冗長，所需制片設備較為昂貴，通常生物組織制片需要配置生物組織脫水機、包埋機、烤片機和熔蠟箱等較為昂貴的設備；制作過程耗費時日較長，一般 需要3 5日甚至更長的時間，操作過程復雜，特別是固定、脫水、透明、滲蠟等步驟，在整個制片過程中耗時最多，其中每一步驟需在規定時間內，制片者須等待各種試劑在組織材料中自然地緩慢替換，這樣容易使組織收縮、變硬和變脆，如遇堅硬或易脆的材料時很難切出理想的切片。同時在制片的過程中，長期大量使用多種有毒有機化學試劑，如二甲苯、冰乙酸、正丁醇和石蠟，不僅引起實驗室空氣的污染而且還嚴重威脅到制片者的身體健康。因此，有必要對現有技術進行改進。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術存在的一些缺陷，提供一種植物組織快速石蠟制片的方法，可簡便快捷地為植物學和植物病理學等學科的教學和科研提供高質量的組織切片。本項發明的植物組織快速石蠟制片的方法，其步驟如下
(I)固定將植物組織材料小塊放入裝有FAA固定液的玻璃瓶中，確保材料完全浸沒在固定液中，然后將該玻璃瓶放入真空干燥箱中，設定35 40°C，- 0. 07 -0. 08Mpa,干燥60 90min，迅速殺死組織并排出組織材料中的氣體直至沉入瓶底。(2)脫水及透明將(I)處理過的玻璃瓶中的FAA固定液倒出，換成50%的乙醇，將裝試驗材料的玻璃瓶放入真空干燥箱中干燥，真空干燥箱條件為35 40°C，- 0. 07 -0. 08Mpa，干燥20 30min ;再將玻璃瓶中50%的乙醇換成60%的乙醇，將玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件同上；把60%的乙醇換成70%的乙醇，把玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件同上；然后將玻璃瓶中70%的乙醇換成脫水一透明劑I液，將玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件為35 40°C，- 0. 07 -0. 08Mpa,干燥40 60min ；再將脫水一透明劑I液換成脫水一透明劑II液，將玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件同上；再把脫水一透明劑II液換成脫水一透明劑III液，把玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件同上；最后將脫水一透明劑III液換成純叔丁醇或正丁醇，將玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件為40 45°C，- 0. 07 -0. 08Mpa,干燥60 120min，使植物組織細胞中的水分和乙醇逐漸被純叔丁醇或正丁醇所替代，完成脫水和透明。(3)石蠟滲透將經(2)處理的植物組織材料脫水劑換成叔丁醇一石蠟I液或正丁醇一石蠟I液，將裝試驗材料的玻璃瓶放入真空干燥箱進行石蠟滲透，石蠟滲透條件為52 58°C，- 0. 07 -0. 08Mpa，滲透處理60 120min ;然后將叔丁醇一石蠟I液或正丁醇一石蠟I液換成叔丁醇一石蠟II液或正丁醇一石蠟II液，繼續石蠟滲透，石蠟滲透條件同上；最后將叔丁醇一石蠟III液或正丁醇一石蠟III液換成純石蠟液，進一步純石蠟滲透，石蠟滲透條件同上，使植物組織細胞中的叔丁醇或正丁醇逐漸被純石蠟所替換。(4)包埋及切片將經(3)處理的植物組織與純石蠟溶液一起倒入包埋盒，調整好植物組織的位置，使植物組織與純石蠟溶液快速冷卻，直至石蠟由溶液凝固成石蠟塊，將包埋好的石蠟塊經過分割、修整與固著，然后經切片機將石蠟塊切成連續的蠟帶，蠟帶形狀為長方形，上下兩個長邊平行，切片厚度為4 12Mm。 (5)黏片和展片將(4)切好的蠟帶分割成適宜的片段，用明膠黏貼劑貼于載玻片上，黏片時將蠟片完全伸展，故黏片和展片是在載玻片上連續完成的，將黏貼好蠟帶的載玻片水平放入真空干燥箱進行烤片，烤片的條件為30 33°C，- 0. 07 -0. 08Mpa，烤片3(T40min，之后等待其溫度降至室溫備用。(6)染色采用番紅一固綠雙重染色法染色，其步驟為
A、將經(5)處理的粘有蠟片的載玻片放入純二甲苯中10 15min，使石蠟完全溶解；
B、將A處理過的植物組織載玻片轉到二甲苯一純乙醇混合液I中過渡處理2 3min；
C、將B處理過的植物組織載玻片轉到二甲苯一純乙醇混合液II中過渡處理2 3min；
D、將C處理過的植物組織載玻片在純乙醇中脫水處理30 60s，再依次轉到95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇中分別脫水、透明處理2 3min ；
Ejf D處理過的植物組織載玻片置入含1%番紅染料的60%乙醇溶液的臥式染缸中，然后把染缸放入真空干燥箱，真空干燥條件為38 42°C，染色3 5h ;
F、將經E染色的植物組織載玻片依次轉入60%、70%、80%、90%和95%的乙醇中分別脫水、透明處理30 40s ；
G、將經F處理的植物組織載玻片置入含1%固綠染料的95%乙醇溶液染缸中，染色45 60s ；
H、將G處理過的植物組織載玻片再依次經95%乙醇、無水乙醇、二甲苯一純乙醇混合液II液、二甲苯一純乙醇混合液I液中分別處理5 10s，最后置于純二甲苯中脫水、透明
10 15s。(7)封固用二甲苯稀釋的加拿大樹膠做為封固劑，對經(6)處理的植物組織載玻片進行封固，將封片在室溫下自然干燥即可。所述的FAA固定液是由下列試劑按體積比配制而成分析純級50%乙醇90份、冰乙酸5份、36 40%甲醒5份。所述的固定時植物組織取樣材料的體積為2 4mmX2 4mmX2 4mm。所述的脫水一透明劑I液是由下列試劑按體積比配制而成分析純級95%乙醇50份、叔丁醇或正丁醇35份、蒸餾水15份。所述的脫水一透明劑II液是由下列試劑按體積比配制而成分析純級95%乙醇40份、叔丁醇或正丁醇55份、蒸餾水5份。所述的脫水一透明劑III液是由下列試劑按體積比配制而成分析純級95%乙醇25份、叔丁醇或正丁醇75份。所述的叔丁醇一石蠟I液(或正丁醇一石蠟I液)是由下列試劑按體積/質量份配制而成叔丁醇(正丁醇)30ml、石蠟5克。所述的叔丁醇一石蠟II液(或正丁醇一石蠟II液)是由下列試劑按體積/質量份配制而成叔丁醇(正丁醇)30ml、石蠟15克。所述二甲苯一純乙醇混合液I是由下列試劑按體積比配制而成二甲苯65份、分析純級純乙醇35份。所述二甲苯一純乙醇混合液II是由下列試劑按體積比配制而成二甲苯50份、分析純級純乙醇50份。 本發明的有益效果
(I)極大地提高了植物組織石蠟制片固定的效率本發明的植物組織石蠟制片固定時材料在真空干燥箱中進行真空抽氣，并保持恒定的溫度，這樣材料中氣體會徹底和迅速地抽出，固定液在相對較高的溫度下增強了對組織的滲透能力，使細胞各個組分得到充分的沉淀和凝固，避免了由于材料長時間浸泡在固定液中而發生膨脹、變硬等破壞，從而產生顯著地光學差異，獲得較好的染色和觀察效果。使用真空干燥箱后，固定時間僅為60—90min，較傳統石蠟制片需要一天的固定時間提高效率10 20倍。(2)用叔丁醇或正丁醇作為脫水、透明劑簡化了脫水與透明步驟叔丁醇或正丁醇可與水、乙醇和二甲苯等溶劑相混合，也是石蠟的溶媒；較二甲苯等脫水劑，叔丁醇或正丁醇不會使組織收縮和變硬，由于叔丁醇或正丁醇兼有脫水和透明兩種作用，因此用叔丁醇或正丁醇作為脫水、透明劑處理植物組織可同時起到脫水和透明的作用，這樣簡化了脫水與透明步驟，節約了大量的時間，且脫水效果比傳統的脫水劑二甲苯好。脫水在真空干燥箱中進行，箱內溫度和負壓可以保持恒定。一方面，由于脫水、透明劑的溫度的提升，可避免季節變化造成室溫波動對實驗試劑凝固點的影響(叔丁醇的凝固點僅為24. (T25. 5°C，特別在北方的春季和冬季)；另一方面，在恒溫和真空負壓下，脫水、透明劑和植物組織內氣體加快排出，加速了脫水乙醇和脫水、透明劑叔丁醇或正丁醇對植物組織細胞的滲透，徹底地將組織中水分除去，有利于后期的石蠟滲透。本發明所需脫水及透明時間僅為6 7h，較傳統脫水和透明效率(20h以上)提高3倍以上。(3)提高了植物組織在石蠟滲透的效率和包埋的質量石蠟滲透是指純石蠟完全替代叔丁醇或正丁醇等試劑進入到組織細胞中的一個漸進過程。在傳統的生物石蠟制片中使用玻璃真空干燥器置于數顯水浴鍋或在熔蠟箱來實現石蠟滲透的溫度控制，器或箱內溫度不宜精確控制且易受外界溫度變化的影響，特別是夏季使用的石蠟的熔點過高(56°C 58°C)，浸蠟溫度過高會使組織材料收縮，組織材料變脆或變硬；而過低時會影響石蠟的滲透速率造成石蠟滲透不完全，并且組織內部易常混有氣泡或包埋時有氣泡附著在組織表面，這樣切片時易發生斷片、掉片和切片蠟帶有空洞，往往影響最終切片的質量。真空干燥箱內不必考慮室溫變化等因素的影響，并且在真空負壓下不同的溶媒經過加溫，可加速滲蠟的進程。包埋時，純石蠟在真空干燥箱內熔化時，由于始終處于真空環境中，比常壓下熔點要低一些，可以有效地解決滲蠟時溫度過高造成組織變硬和變脆等問題。經過抽氣后的純石蠟溶液結構致密且細膩、色澤清亮且結構性良好，利于維持包埋時組織材料的穩定性，使包埋過程簡便易行，保證了包埋的質量。試驗結果顯示使用真空干燥箱后，滲蠟時間共需4 7h，較傳統滲蠟方法(8 12 h)效率提高I倍以上。(4)本發明所涉及的植物組織快速石蠟制片方法所需的設備簡單、操作簡便易行，運行安全環保本發明在植物組織石蠟制片中主要使用的設備就是真空干燥箱，實驗設備價格便宜且操作簡單，中小型生物實驗室均可應用該項技術，免除了傳統石蠟制片中所需的脫水機、包埋機、烤片機和熔蠟箱等昂貴的設備，可謂一機多用。在運行時，由于真空泵可將實驗產生的有害廢氣通過膠皮管室外排出，避免了冰乙酸、二甲苯、正丁醇、叔丁醇和石蠟溶液等試劑揮發造成對實驗室的空氣污染，大大減輕廢氣對實驗人員健康的危害。同時叔丁醇對金屬無腐蝕性，可充分保證試驗設備的安全性。總之，本發明的植物組織快速石蠟制片技術，在固定抽氣、脫水透明及石蠟滲透等步驟中，可以使植物組織材料始終保持在相對穩定的溫度和真空條件下，這樣可加速氣 體分子快速的彌散，加快水分子與有機溶劑的交換和滲透速率，使試驗材料的處理時間大幅度地縮短，而其組織結構和細胞形態依然保持完好。這樣可以極大地減少材料在各級溶液中長時間處理而引起的組織變形扭曲、脆化收縮，使制片質量顯著提高，實驗時間大大縮短。制片周期由傳統的3 5天縮短到I 2天完成。該項技術具有實驗程序簡化、所用儀器設備價格便宜，實用性強，一般普通中小型生物實驗室均可進行，且制片質量高和安全環保等特點。下面結合實施例對本發明的植物組織快速石蠟制片的方法作進一步的說明。實施例I
實驗目的梨果實愈傷組織接種梨褐腐病病原菌iMonilinia fructigena) 24h后觀察菌絲侵染狀態。植物組織快速石蠟制片的步驟如下
(I)取樣(上午8:00 8:30)梨褐腐病病原菌菌種接種于梨果實愈傷組織上表面，培養24h后混合取材15份，愈傷組織柔軟且富含大量水分。選取完整的愈傷組織，體積為3mmX3mmX2mm，共取樣10份，然后用FAA固定液浸沒在青霉素玻璃瓶中。(2)固定(上午8:30 10:00)確保愈傷組織材料完全浸沒在固定液后，將愈傷組織材料玻璃瓶敞口放入真空干燥箱中，設定真空干燥條件為35°C，- O.OSMpa，開機干燥90min，迅速殺死愈傷組織材料并排出愈傷組織材料中的氣體直至沉入瓶底。(3)脫水(上午10:00 下午18:00)固定結束后，將浸沒愈傷組織材料的固定液依次換成50%、60%、70%的乙醇，梯度脫水，將愈傷組織材料玻璃瓶放入真空干燥箱中，設定真空干燥條件為40°C，- 0. 08Mpa,開機干燥20min。然后將浸沒愈傷組織材料的液體依次換成脫水一透明劑I液、脫水一透明劑II液、脫水一透明劑III液，將愈傷組織材料玻璃瓶放入真空干燥箱中，設定真空干燥條件為35°C，- O.OSMpa，分別干燥處理60min，最后將浸沒愈傷組織材料的試劑換成純叔丁醇，真空干燥條件為40°C，- 0. 08Mpa,開機干燥120min。(4)滲蠟和包埋(下午18:00 22:00)將經過脫水、透明后的愈傷組織材料依次換入叔丁醇一石蠟液I液、叔丁醇一石蠟液II液和純石蠟液，將愈傷組織材料玻璃瓶放入真空干燥箱中，設定真空干燥條件為58°C，- 0. 08Mpa，分別進行石蠟滲透60min。將經處理的愈傷組織材料與純石蠟溶液一起倒入包埋盒，調整好愈傷組織的位置，使愈傷組織與純石蠟溶液快速冷卻，直至石蠟由溶液凝固成石蠟塊。(5)切片、黏片和展片(次日上午8:00 10:30)把包埋好的愈傷組織材料石蠟塊經過分割、修整與固著等步驟，然后經滾輪式切片機將蠟塊切成連續不斷的蠟帶，切片厚度為4 6Mm。蠟片切好后，將蠟帶分割成適宜的片段，用明膠黏貼劑貼于載玻片上，然后將黏貼好蠟帶的載玻片水平放入真空干燥箱進行烤片，烤片溫度設定30°C，- O.OSMpa，烤片時間為40min。(6)染色(上午10:30 17:30)將烤片結束的愈傷組織載玻片放入純二甲苯中使石蠟溶解lOmin，再依次轉到二甲苯一純乙醇混合液I和二甲苯一純乙醇混合液II中各處理3min，把愈傷組織載玻片移至無水乙醇中處理30s，再依次轉到95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇中分別處理2min。之后把愈傷組織載玻片置入含1%番紅染料的60%乙醇溶液的臥式染缸中，然后把染缸放入真空干燥箱，真空干燥條件為38°C，染色5h。然后將愈傷組織載玻片依次轉入60%、70%、80%、90%和95%的乙醇中分別處理30s，再將愈傷組織載玻片置入含1%固綠染料的95%乙醇溶液的染缸中，染色45s后，將愈傷組織載玻片依次經95%乙醇、無水乙醇、二甲苯一純乙醇混合液II和二甲苯一純乙醇混合液I中分別 處理IOs,最后置于純二甲苯中脫水、透明15s。(7)封固用二甲苯稀釋的加拿大樹膠做為封固劑，對染色結束的愈傷組織載玻片進行封固，將封片在室溫下晾干即為愈傷組織石蠟制片玻片。該愈傷組織玻片可在顯微鏡下觀察及顯微攝影。實施例2
實驗目的觀察玉米種子萌發時胚根橫斷面的組織細胞顯微結構。植物組織快速石蠟制片的步驟如下
(I)取樣與固定(上午8 :00 9:00)選取玉米種子在低溫下萌發(7d)的胚根(下胚軸)組織，用鋒利的刀片將整段胚根切成三段(每段長度約為2 3mm)，將其浸沒在裝有FAA固定液的青霉素玻璃瓶中，將胚根材料玻璃瓶敞口放入真空干燥箱中，設定真空干燥條件為40°C, - 0.07Mpa，開機干燥60min，迅速殺死胚根并排出胚根組織中的氣體直至沉入瓶底。(2)脫水(上午9 00 下午14:30)固定結束后，將浸沒胚根的固定液依次換成50%、60%、70%的乙醇，將裝有胚根玻璃瓶放入真空干燥箱中，設定真空干燥條件為35°C，-0. 08Mpa，分別開機處理30min，梯度脫水。然后將浸沒胚根的試劑依次換成脫水一透明劑I液、脫水一透明劑II液、脫水一透明劑III液，將玻璃瓶放入真空干燥箱中，設定真空干燥條件為40°C，- O.OSMpa，分別開機處理40min。最后將浸沒胚根的試劑換成純正丁醇，設定真空干燥條件為45°C，- 0. 08Mpa,開機干燥60min。(3)滲蠟和包埋(下午14 30 下午17:00)將經過脫水、透明后的胚根浸沒液依次換成正丁醇一石蠟液I液、正丁醇一石蠟液II液和純石蠟液，將胚根玻璃瓶放入真空干燥箱中，設定真空干燥條件為57°C，- O.OSMpa，分別進行石蠟滲透60min。將經處理的胚根與純石蠟溶液一起倒入包埋盒，調整好胚根的位置，使胚根與純石蠟溶液快速冷卻，直至石蠟由溶液凝固成石蠟塊。(4)切片、黏片和展片(下午17 00 下午19:40)把包埋好的胚根石蠟塊經過分害I]、修整與固著等步驟，然后經滾輪式切片機將蠟塊切成連續不斷的蠟帶，切片厚度為4 6Mm。蠟片切好后，將蠟帶分割成適宜的片段，用明膠黏貼劑貼于載玻片上。然后將黏貼好蠟帶的載玻片水平放入真空干燥箱進行烤片，烤片溫度設定為33°C，- O.OSMpa，烤片時間為 30min。(5)染色、封固(次日上午8:00 10:00)將烤片結束的胚根載玻片放入純二甲苯中使石蠟溶解15min，再依次轉到二甲苯一純乙醇混合液I和二甲苯一純乙醇混合液II中各處理2min,把胚根載玻片移至無水乙醇中處理60s,再依次轉到95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇中分別處理3min。之后把胚根載玻片置入含1%番紅染料的60%乙醇溶液的臥式染缸中，然后把染缸放入真空干燥箱，真空干燥條件為42°C，染色3h。然后將胚根載玻片依次轉入60%、70%、80%、90%和95%的乙醇中分別處理40s ;再將胚根載玻片置入含1%固綠染料的95%乙醇溶液的染缸中，染色60s后，將胚根載玻片依次經95%乙醇、無水乙醇、二甲苯一純乙醇混合液II和二甲苯一純乙醇混合液I中各處理5s，最后置于純二甲苯中脫水、透明10s。(6)封固用二甲苯稀釋的加拿大樹膠做為封固劑，對脫水后的胚根載玻片進行封固，將封片在室溫下晾干即為胚根石蠟玻片。該胚根石蠟玻片可在顯微鏡下觀察及顯微攝 影。
權利要求
1.一種植物組織快速石蠟制片的方法，其步驟如下 (1)固定將植物組織材料小塊放入裝有FAA固定液的玻璃瓶中，確保材料完全浸沒在固定液中，然后將該玻璃瓶放入真空干燥箱中，設定35 40°C，-0.07 -0.08Mpa，干燥60 90min，迅速殺死組織并排出組織材料中的氣體直至沉入瓶底； (2)脫水及透明將(I)處理過的玻璃瓶中的FAA固定液倒出，換成50%的乙醇，將裝試驗材料的玻璃瓶放入真空干燥箱中干燥，真空干燥箱條件為35 40°C，-0.07 -0.08Mpa，干燥20 30min ;再將玻璃瓶中50%的乙醇換成60%的乙醇，將玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件同上，把60%的乙醇換成70%的乙醇，把玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件同上，然后將玻璃瓶中70%的乙醇換成脫水一透明劑I液，將玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件為35 40°C，-0.07 -0.08Mpa，干燥40 60min ； 再將脫水一透明劑I液換成脫水一透明劑II液，將玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件同上，再把脫水一透明劑II液換成脫水一透明劑III液，把玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件同上；最后將脫水一透明劑III液換成純叔丁醇或正丁醇，將玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥條件為40 45°C，- O. 07 -O. 08Mpa,干燥60 120min，使植物組織細胞中的水分和乙醇逐漸被純叔丁醇或正丁醇所替代，完成脫水和透明； (3)石蠟滲透將經(2)處理的植物組織材料脫水劑換成叔丁醇一石蠟I液或正丁醇一石蠟I液，將裝試驗材料的玻璃瓶放入真空干燥箱進行石蠟滲透，石蠟滲透條件為52 58°C，-0.07 -0.08Mpa，滲透處理60 120min ;然后將叔丁醇一石蠟I液或正丁醇一石蠟I液換成叔丁醇一石蠟II液或正丁醇一石蠟II液，繼續石蠟滲透，石蠟滲透條件同上；最后將叔丁醇一石蠟II液或正丁醇一石蠟II液換成純石蠟液，進一步純石蠟滲透，石蠟滲透條件同上，使植物組織細胞中的叔丁醇或正丁醇逐漸被純石蠟所替換； (4)包埋及切片將經(3)處理的植物組織與純石蠟溶液一起倒入包埋盒，調整好植物組織的位置，使植物組織與純石蠟溶液快速冷卻，直至石蠟由溶液凝固成石蠟塊，將包埋好的石蠟塊經過分割、修整與固著，然后經切片機將石蠟塊切成連續的蠟帶，蠟帶形狀為長方形，上下兩個長邊平行，切片厚度為4 12ΜΠ1; (5)黏片和展片將(4)切好的蠟帶分割成適宜的片段，用明膠黏貼劑貼于載玻片上，黏片時將蠟片完全伸展，故黏片和展片是在載玻片上連續完成的，將黏貼好蠟帶的載玻片水平放入真空干燥箱進行烤片，烤片的條件為30 33°C，-0.07 -0.08Mpa，烤片3(T40min，之后等待其溫度降至室溫備用； (6)染色采用番紅一固綠雙重染色法染色，其順序為 A、將經(5)處理的粘有蠟片的載玻片放入純二甲苯中10 15min，使石蠟完全溶解； B、將A處理過的植物組織載玻片轉到二甲苯一純乙醇混合液I中過渡處理2 3min； C、將B處理過的植物組織載玻片轉到二甲苯一純乙醇混合液II中過渡處理2 3min； D、將C處理過的植物組織載玻片在純乙醇中脫水處理30 60s，再依次轉到95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇中分別脫水、透明處理2 3min ； E、將D處理過的植物組織載玻片置入含1%番紅染料的60%乙醇溶液的臥式染缸中，然后把染缸放入真空干燥箱，真空干燥條件為38 42°C，染色3 5h ; F、將經E染色的植物組織載玻片依次轉入60%、70%、80%、90%和95%的乙醇中分別脫水、透明處理30 40s ；G、將經F處理的植物組織載玻片置入含1%固綠染料的95%乙醇溶液染缸中，染色45 ,60s ； H、將G處理過的植物組織載玻片再依次經95%乙醇、無水乙醇、二甲苯一純乙醇混合液II液、二甲苯一純乙醇混合液I液中分別處理5 10s，最后置于純二甲苯中脫水、透明,10 15s ； (7)封固用二甲苯稀釋的加拿大樹膠做為封固劑，對經(6)處理的植物組織載玻片進行封固，將封片在室溫下自然干燥即可。
2.根據權利要求I所述的植物組織快速石蠟制片的方法，其特征在于，所述的FAA固定液是由下列試劑按體積比配制而成分析純級50%乙醇90份、冰乙酸5份、36 40%甲醛5份。
3.根據權利要求I所述的植物組織快速石蠟制片的方法，其特征在于，所述的脫水一透明劑I液是由下列試劑按體積比配制而成分析純級95%乙醇50份、叔丁醇或正丁醇35份、蒸餾水15份。
4.根據權利要求I所述的植物組織快速石蠟制片的方法，其特征在于，所述的脫水一透明劑II液是由下列試劑按體積比配制而成分析純級95%乙醇40份、叔丁醇或正丁醇55份、蒸餾水5份。
5.根據權利要求I所述的植物組織快速石蠟制片的方法，其特征在于，所述的脫水一透明劑III液是由下列試劑按體積比配制而成分析純級95%乙醇25份、叔丁醇或正丁醇75份。
6.根據權利要求I所述的植物組織快速石蠟制片的方法，其特征在于，所述的叔丁醇一石蠟I液是由下列試劑按體積/質量份配制而成叔丁醇30ml、石蠟5克。
7.根據權利要求I所述的植物組織快速石蠟制片的方法，其特征在于，所述的叔丁醇一石蠟II液是由下列試劑按體積/質量份配制而成叔丁醇30ml、石蠟15克。
8.根據權利要求7或8所述的植物組織快速石蠟制片的方法，其特征在于，所述的叔丁醇可用等量的正丁醇替代。
9.根據權利要求I所述的植物組織快速石蠟制片的方法，其特征在于，所述二甲苯一純乙醇混合液I是由下列試劑按體積比配制而成二甲苯65份、分析純級純乙醇35份。
10.根據權利要求I所述的植物組織快速石蠟制片的方法，其特征在于，所述二甲苯一純乙醇混合液II是由下列試劑按體積比配制而成二甲苯50份、分析純級純乙醇50份。
全文摘要
本發明公開了一種植物組織快速石蠟制片的方法，其步驟包括取樣、固定、脫水及透明、石蠟滲透、包埋及切片、黏片和展片、染色和封固。本發明極大地提高了植物組織石蠟制片固定的效率，較傳統石蠟制片需要一天的固定時間提高效率10～20倍；用叔丁醇或正丁醇作為脫水、透明劑簡化了脫水與透明步驟，所需脫水及透明時間僅為6～7h，較傳統脫水和透明效率提高了3倍以上；提高了植物組織在石蠟滲透的效率和包埋的質量，滲蠟時間共需4～7h，較傳統滲蠟方法效率提高1倍以上，有效地解決了滲蠟時溫度過高造成組織變硬和變脆等問題。本發明具有實驗程序簡化、所用儀器設備價格便宜、制片周期短、制片質量高和安全環保等特點。
文檔編號G01N1/28GK102967493SQ20121041651
公開日2013年3月13日 申請日期2012年10月27日 優先權日2012年10月27日
發明者賀冰 申請人:山西農業大學