專利名稱：測定受體配體間結合常數的壓力驅動親和毛細管電泳方法
技術領域：
本專利涉及一種測定受體和配體之間結合常數的毛細管電泳方法，尤其是涉及一種以氣壓為驅動力的親和毛細管電泳法。
背景技術：
親和毛細管電泳法(AffinityCapillary Electrophoresis, ACE)[1]是研究分子之間相互作用的一種常用模式。由于其具有樣品用量少，不需要提純，操作簡單，可在模擬生理環境的水溶液中進行測定等優點，在蛋白結合研究領域中應用越來越廣泛。它主要包括兩種研究方法一種稱為“L/’法，是以受體為緩沖液添加劑，以配體為進樣樣品，測定配體在含有不同濃度受體的緩沖液中有效電泳淌度的變化；另一種稱為“IV’法，是以配體為緩沖液添加劑，以受體為進樣樣品，測定受體在含有不同濃度配體的緩沖液中有效電泳淌度的變化。有效電泳淌度的變化是判斷受體與配體是否發生結合作用，以及計算結合常數的依據。但是，淌度往往受到很多因素的影響[2]。例如，毛細管柱溫的變化會影響緩沖液的粘度，進一步影響電滲流和電泳淌度的大小；毛細管電泳過程是在高電壓下完成的，長時間的高電壓會引起緩沖液中電解質的電離，破壞緩沖液PH的穩定；毛細管內表面的吸附問題不僅影響淌度大小，還會造成樣品峰形變化。采用常規的ACE方法測定樣品有效電泳淌度時， 不能有效地解決重現性和準確性差的問題，結合常數的計算結果也會有較大的偏差。采用內管壁涂層的毛細管[3]作為親和毛細管電泳的分離通道，雖然可以抑制管壁吸附，改善重現性，但是涂層步驟繁瑣，且涂層柱壽命較短。1996年Williams和￥18&4]提出了一種快速測定淌度的方法，在毛細管的恒溫區實現電滲流和樣品電泳淌度的快速、準確測定。該方法已被廣泛用于涂層毛細管電泳、非水毛細管電泳的電滲流測定，以及PKa值的測定等領域。[1]Liu X J, Dahdouh F, Salgado M, Gomez F A. Recent advances in affinity capillary electrophoresis(2007), J.Pharm. Sci. ,2009,98(2) :394-410.[2]朱健萍，胡昌勤，劉文英.毛細管電泳遷移時間重現性影響因素的探討，色譜， 2006,24(4) :396-401.[3] Horvath J, Dolni k V. Polymer wall coatings for capillary electrophoresis, Electrophoresis,2001, 22 :644-655.[4]Williams B A,Vigh G. Fast,accurate mobility determination method for capillary electrophoresis, Anal. Chem. ,1996,68 :1174-1180.

發明內容
本發明的目的是為了克服現有技術ACE方法測定結合常數時存在的問題，提供一種快速、準確的測定受體配體間結合常數的壓力驅動親和毛細管電泳方法。本發明的技術方案概述如下測定受體配體間結合常數的壓力驅動親和毛細管電泳方法，包括如下步驟
(1)使用毛細管電泳儀設備，將毛細管依次用氫氧化鈉水溶液和緩沖液沖洗，然后向毛細管中充滿緩沖液或充滿一系列不同受體濃度的緩沖液溶液，用下面0)-(7)的步驟，分別測定配體在緩沖液中的有效電泳淌度μ ο，和配體在一系列不同受體濃度的緩沖液中的有效電泳淌度μ！；(2)第一次進樣采用氣壓進樣的方法向毛細管中進樣，所進樣品為含有待測配體和可以產生檢測信號的中性標記物的混合物；(3)樣品的推進將毛細管進樣端插入緩沖液槽，施加與步驟( 相同的氣壓，將第一次進樣的樣品推入到毛細管位于所述毛細管電泳儀設備的恒溫區；(4)電泳過程向毛細管兩端施加200-300V/cm場強的分離電壓，使第一次進樣的樣品向檢測窗口遷移，但不能經過檢測窗口 ；(5)第二次進樣采用與步驟( 所述氣壓進樣相同的方法向毛細管中進樣，所進樣品為可以產生檢測信號的中性標記物；(6)檢測將毛細管進樣端插入緩沖液槽，施加與步驟( 相同的氣壓，將兩次進樣的樣品推向毛細管的檢測窗口，工作站上出現三個峰，記錄三個峰的出峰時間；(7)有效電泳淌度的計算峰一和峰二代表第一次進樣的待測配體和中性標記
物，峰三代表第二次進樣的中性標記物；峰三的出峰時間t3，體現了氣壓推動的快慢，根據
t3和毛細管的有效長度Ld，可以計算氣壓推動速度vm，如公式1 ；峰一和峰二之間的距離為
待測配體的有效遷移距離La，且該距離產生在毛細管的恒溫區，不受溫度的影響；根據峰一
和峰二的出峰時間差△ t和氣壓推動速度vm，計算出La，如公式2 ；根據公式3，計算待測配
體的有效電泳淌度μ ； Ld
權利要求
1.測定受體配體間結合常數的壓力驅動親和毛細管電泳方法，其特征是包括如下步驟(1)使用毛細管電泳儀設備，將毛細管依次用氫氧化鈉水溶液和緩沖液沖洗，然后向毛細管中充滿緩沖液或充滿一系列不同受體濃度的緩沖液溶液，用下面0)-(7)的步驟，分別測定配體在緩沖液中的有效電泳淌度μ C1，和配體在一系列不同受體濃度的緩沖液中的有效電泳淌度μ！；(2)第一次進樣采用氣壓進樣的方法向毛細管中進樣，所進樣品為含有待測配體和可以產生檢測信號的中性標記物的混合物；(3)樣品的推進將毛細管進樣端插入緩沖液槽，施加與步驟( 相同的氣壓，將第一次進樣的樣品推入到毛細管位于所述毛細管電泳儀設備的恒溫區；(4)電泳過程向毛細管兩端施加200-300V/cm場強的分離電壓，使第一次進樣的樣品向檢測窗口遷移，但不能經過檢測窗口 ；(5)第二次進樣采用與步驟( 所述氣壓進樣相同的方法向毛細管中進樣，所進樣品為可以產生檢測信號的中性標記物；(6)檢測將毛細管進樣端插入緩沖液槽，施加與步驟( 相同的氣壓，將兩次進樣的樣品推向毛細管的檢測窗口，工作站上出現三個峰，記錄三個峰的出峰時間；(7)有效電泳淌度的計算峰一和峰二代表第一次進樣的待測配體和中性標記物，峰三代表第二次進樣的中性標記物；峰三的出峰時間、，體現了氣壓推動的快慢，根據t3和毛細管的有效長度Ld，可以計算氣壓推動速度vm，如公式1 ；峰一和峰二之間的距離為待測配體的有效遷移距離La，且該距離產生在毛細管的恒溫區，不受溫度的影響；根據峰一和峰二的出峰時間差At和氣壓推動速度vm，計算出LA，如公式2 ；根據公式3，計算待測配體的有效電泳淌度μ ；
2.根據權利要求1所述的測定受體配體間結合常數的壓力驅動親和毛細管電泳方法， 其特征是所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，硼砂緩沖液，醋酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液。
3.根據權利要求1所述的測定受體配體間結合常數的壓力驅動親和毛細管電泳方法，其特征是所述中性標記物為N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亞砜，硫脲，異亞丙基丙酮或丙酮。
4.測定受體配體間結合常數的壓力驅動親和毛細管電泳方法，其特征是包括如下步驟(1)使用毛細管電泳儀設備，將毛細管依次用氫氧化鈉水溶液和緩沖液沖洗，然后向毛細管中充滿緩沖液或充滿一系列不同配體濃度的緩沖液溶液，用下面0)-(7)的步驟，分別測定受體在緩沖液中的有效電泳淌度μ 3，和受體在一系列不同配體濃度的緩沖液中的有效電泳淌度μ4;(2)第一次進樣采用氣壓進樣的方法向毛細管中進樣，所進樣品為含有待測受體和可以產生檢測信號的中性標記物的混合物；(3)樣品的推進將毛細管進樣端插入緩沖液槽，施加與步驟( 相同的氣壓，將第一次進樣的樣品推入到毛細管位于所述毛細管電泳儀設備的恒溫區；(4)電泳過程向毛細管兩端施加200-300V/cm場強的分離電壓，使第一次進樣的樣品向檢測窗口遷移，但不能經過檢測窗口 ；(5)第二次進樣采用與步驟( 所述氣壓進樣相同的方法向毛細管中進樣，所進樣品為可以產生檢測信號的中性標記物；(6)檢測將毛細管進樣端插入緩沖液槽，施加與步驟( 相同的氣壓，將兩次進樣的樣品推向毛細管的檢測窗口，工作站上出現三個峰，記錄三個峰的出峰時間；(7)有效電泳淌度的計算峰一和峰二代表第一次進樣的待測受體和中性標記物，峰三代表第二次進樣的中性標記物；峰三的出峰時間、，體現了氣壓推動的快慢，根據t3和毛細管的有效長度Ld，可以計算氣壓推動速度vm，如公式1 ；峰一和峰二之間的距離為待測受體的有效遷移距離Lb，且該距離產生在毛細管的恒溫區，不受溫度的影響；根據峰一和峰二的出峰時間差At和氣壓推動速度vm，計算出LB，如公式5 ；根據公式6，計算待測受體的有效電泳淌度μ ；
5.根據權利要求4所述的測定受體配體間結合常數的壓力驅動親和毛細管電泳方法， 其特征是所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，硼砂緩沖液，醋酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液。
6.根據權利要求4所述的測定受體配體間結合常數的壓力驅動親和毛細管電泳方法，其特征是所述中性標記物為N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亞砜，硫脲，異亞丙基丙酮或丙酮。
全文摘要
本發明公開了測定受體配體間結合常數的壓力驅動親和毛細管電泳方法，步驟為(1)使用毛細管電泳儀設備，沖洗毛細管并充滿緩沖液或一系列不同受體濃度的緩沖液溶液，用(2)一(7)的步驟，分別測定配體在緩沖液中的有效電泳淌度μ0，和配體在一系列不同受體濃度的緩沖液中的有效電泳淌度μ1；(2)第一次進樣；(3)樣品推進；(4)電泳；(5)第二次進樣；(6)檢測；(7)有效電泳淌度計算；(8)結合常數計算。本發明的方法消除了毛細管內溫度不均一對淌度的影響，減小了高電壓下緩沖液電解質解離現象的發生。準確測定出含有不同濃度受體緩沖液中配體的有效電泳淌度，并由此計算結合常數，縮短了分析時間。
文檔編號G01N27/447GK102253103SQ201110104249
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月25日 優先權日2011年4月25日
發明者包建民, 張勃, 李優鑫 申請人:天津大學