專利名稱：一種甲烷氧化菌體外特異性熒光染色的方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質染色的技術領域，特別涉及一種甲烷氧化菌體外特異性熒光染色的方法。
背景技術：
甲烷氧化菌是專性烴氧化菌菌群中的一員，是具有高度專一的、以甲烷為唯一碳源的細菌群體。甲烷氧化菌的存活依賴于持續性的甲烷供給。故表層土壤和/或沉積物中甲烷氧化菌異常的產生往往與深部甲烷的持續微滲漏有關，而甲烷氧化菌異常是微生物油氣勘探與微生物油氣藏表征的重要指標。甲烷氧化菌異常的確定需要對甲烷氧化菌的數量進行高通量計數；而甲烷氧化菌數量的高通量計數需要以甲烷氧化菌體外特異性熒光染色技術為基礎。然而，該技術是前人尚未涉及的領域。甲烷單加氧酶(pMMO)是甲烷氧化菌的特征性酶，是一種跨膜蛋白。本方法利用 PMMO的膜外結構域能與經異硫氰酸熒光素(FITC)標記的pMMO單克隆抗體進行特異性結合的這一特性，實現對甲烷氧化菌在體外的特異性熒光染色。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種能在體外對甲烷氧化菌進行特異性熒光染色的方法，從而為甲烷氧化菌高通量計數做技術準備。本發明研究發現，pMMO作為甲烷氧化菌的跨膜特征酶，可通過膜外結構域與相應的單克隆抗體結合。本發明的甲烷氧化菌體外特異性熒光染色的方法，包括如下步驟
(1)PMMO提取和純化采用洲(質量/體積，g/mL)n_十二烷基-β，D-麥芽糖苷溶解甲烷氧化菌的膜蛋白組分，然后使用吸附劑BioBeads SM-2將變性劑η_十二烷基-β，D-麥芽糖苷吸附去除，使其濃度降低至0. 2%，最后加入0. 1%的變性劑Brij 58或Tween 20進行柱層析分離和純化PMMO ；
(2)單克隆抗體的制備將純化得到的pMMO進行小鼠免疫試驗，經3次免疫和1次加強免疫后，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合培養，篩選得到能與PMMO膜外結構域結合的單克隆抗體；
(3)單克隆抗體的FITC熒光標記在堿性溶液中，應用Marsshall法標記FITC熒光抗
體；
(4)甲烷氧化菌體外染色和檢測分析將該標記抗體對甲烷氧化菌進行體外染色，最后用熒光顯微鏡對熒光強度進行分析，評價染色效果。由于η-十二烷基-β，D-麥芽糖苷既是pMMO的最佳溶劑，同時也會抑制pMMO的活性，故不能作為柱層析分離的變性劑。本發明首先使用洲(質量/體積，g/mL)的η-十二烷基-β，D-麥芽糖苷徹底溶解甲烷氧化菌的膜蛋白組分，然后使用吸附劑BioBeads SM_2將變性劑η-十二烷基-β，D-麥芽糖苷吸附去除，使其濃度降低至0. 2%，此時酶活力可達到原始酶活性的88. 2%，最后加入0. 1%的變性劑Brij 58或Tween 20進行柱層析分離、純化ρΜΜΟ。將純化得到SDS-PAGE純的ρΜΜΟ進行小鼠免疫試驗，經3次免疫和1次加強免疫后，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合培養，篩選得到能與PMMO膜外結構域結合的單克隆單體。在堿性溶液中，應用Marsshall法標記FITC熒光抗體后，將該標記抗體對甲烷氧化菌進行體外染色，最后用熒光顯微鏡對熒光強度進行分析，評價染色效果。ρΜΜΟ提取所用菌株是中山大學王江海研究團隊從南陽油田分離得到的甲烷氧化菌ΝΥ003菌株。具體的發酵培養、提取和純化過程如下先用5L自動發酵罐培養甲烷氧化菌2L，離心收集菌體，超聲破碎、提取膜組分；加入pH 7.0,25 mM的MOPS緩沖液將膜組分充分懸浮，向懸浮液持續通入氮氣20 min，將溶液中的氧氣徹底驅除；加入洲(質量/體積，g/mL) η-十二烷基-β，D-麥芽糖苷，混合反應45 1^11后，143，000 X g離心90 min， 保留上清；加入η-十二烷基-β，D-麥芽糖苷的吸附劑BioBeads SM-2，反應45 min后，離心去除BioBeads ；經0. 22 Mm濾膜過濾后加入0. 1% Brij 58或0. 1% Tween 20后，再采用柱層析進行分離、純化。柱層析所用層析柱為P0R0S 20 HQ/Mcolumn (1 cm X 10 cm)；使用前經pH 7. 0、含0. 1% Brij 58或0. 1% Tween 20、25 mM的MOPS緩沖液進行平衡處理。
ρΜΜΟ單克隆抗體的制備選用6 8周齡的雌性Balb/c小鼠作為免疫動物，將 SDS-PAGE純的ρΜΜΟ用生理鹽水稀釋至蛋白濃度為1 mg/mL，與等量弗氏完全佐劑充分乳化后采用皮下多點注射(100 μ g/只)進行免疫；取小鼠脾細胞和事先制備好的骨髓瘤細胞進行細胞融合，篩選出能分泌PMMO單克隆抗體的細胞株；對篩選得到的雜交瘤細胞株進行克隆化培養，生產純化出可用于后續試驗的大量的PMMO單克隆抗體。FITC標記取適量已知濃度的ρΜΜΟ單克隆抗體溶液于燒杯中，再加入生理鹽水和碳酸鹽緩沖液，使最后PMMO濃度為20 mg/mL，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1/10，混勻；將燒瓶置于電磁攪拌器上(控制適當的轉速，以不起泡沫為宜)5-10 min;根據欲標記的蛋白質總量，按每毫克PMMO單克隆抗體蛋白加0.01 0. 03 mg熒光色素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末；邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁(約在5 10 min內加完)；避光攪拌6 12 h。結合期間應保持蛋白溶液于4° C左右，故需將燒杯和攪拌器一起移入4° C冰箱中；結合完畢后，將標記的蛋白溶液5000 Xg離心20 min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋，再置于燒杯中；用pH8.0緩沖鹽水透析((Γ4° C)過夜；取透析過夜的標記物，通過葡聚糖凝膠kphadex G_25或G_50 柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。將甲烷氧化菌標準品固定在濾膜上，加入PBS溶液抽濾3 5次；徹底去除干擾雜質后，加入PBS稀釋的經FITC標記的單克隆抗體，染色2 h后，再加入PBS溶液抽濾3 5 次，將尚未結合的經熒光標記的單克隆抗體除去。用熒光顯微鏡對孔板濾膜上樣品的熒光強度進行觀察和分析，制作甲烷氧化菌數量與熒光強度之間的標準曲線；研究結果表明，甲烷氧化菌在體外的熒光染色率為99. 6% 99. 9%ο與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
(1)首次制備了經FITC標記的ρΜΜΟ單克隆抗體，為甲烷氧化菌的體外染色提供了高效的染色劑。
(2)首次制作了甲烷氧化菌數量與熒光強度之間的標準曲線，驗證了采用甲烷氧化菌體外熒光染色技術來實現對甲烷氧化菌進行高通量計數的可行性。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。實施例1
1、用5L發酵罐培養甲烷氧化菌NY003溶液2 L至光密度(OD)值為0. 6，5000 Xff離心5 min后收集菌體，超聲破碎后提取膜組分。2、采用現有技術從膜組分中得到含0. (質量/體積，g/mL) n_十二烷基-β， -麥芽糖苷的膜蛋白溶液；向該溶液加入0.1% Brij 58后進行柱層析分離，提取 pMMOo3、委托專業廠家制備pMMO單克隆抗體。4、按每毫克pMMO單克隆抗體蛋白添加0. 01 0. 02 mg FITC熒光色素；避光攪拌 12-14 h經FITC標記的抗體蛋白；標記產物用pH 8. 0的緩沖鹽水透析過夜后，通過葡聚糖
G-25柱，分離出游離的熒光素，收集經標記的熒光抗體。5、將5個不同數量級(103、105、107、IO9UO11個)的甲烷氧化菌抽濾產物固定于孔徑為0.2 ym、96孔的濾膜孔上；加入PBS溶液抽濾清洗3次，然后分別加入用PBS稀釋、終濃度為10 mg/mL、經FITC標記的單克隆抗體100 yL，染色2 h ；加入PBS溶液抽濾5次后， 將尚未結合的經FITC標記的單克隆抗體除去。6、用熒光顯微鏡對孔板濾膜上樣品的熒光強度進行分析，制作甲烷氧化菌數量與熒光強度之間關系的標準曲線；研究結果表明，甲烷氧化菌在體外的熒光染色率為99. 8%。實施例2
1、用5 L發酵罐培養甲烷氧化菌NY003溶液2 L至OD值為0. 6，5000 X g離心5 min
后收集菌體，超聲破碎后提取膜組分。2、采用現有技術從膜組分中得到含0. (質量/體積，g/mL) n_十二烷基-β， -麥芽糖苷的膜蛋白溶液；向該溶液加入0.1% Tween 20后進行柱層析分離，提取 pMMOo3、委托專業廠家制備pMMO單克隆抗體。4、按每毫克pMMO單克隆抗體蛋白加0.01 0.02 mg FITC熒光色素；避光攪拌12 14 h經FITC標記的抗體蛋白；標記產物用pH8.0的緩沖鹽水透析過夜后，通過葡聚糖凝
G-50柱，分離出游離的熒光素，收集經標記的熒光抗體。5、將5個不同數量級(103、105、107、IO9UO11個)的甲烷氧化菌抽濾產物固定于孔徑為0.2 ym、96孔的濾膜孔上；加入PBS溶液抽濾清洗3次，然后分別加入用PBS稀釋、終濃度為10 mg/mL、經FITC標記的單克隆抗體100 yL，染色2 h ；加入PBS溶液抽濾5次后， 將尚未結合的經FITC標記的單克隆抗體除去。6、用熒光顯微鏡對孔板濾膜上樣品的熒光強度進行分析，制作甲烷氧化菌數量與熒光強度之間關系的標準曲線；研究結果表明，甲烷氧化菌在體外的熒光染色率為99. 9%。實施例3
1、用5 L發酵罐培養甲烷氧化菌NY003溶液2 L至OD值為0. 6，5000 X g離心5 min后收集菌體，超聲破碎后提取膜組分。2、采用現有技術從膜組分中得到含0. (質量/體積，g/mL) n_十二烷基-β， -麥芽糖苷的膜蛋白溶液；向該溶液加入0.1% Brij 58后進行柱層析分離，提取 pMMOo3、委托專業廠家制備pMMO單克隆抗體。4、按每毫克pMMO單克隆抗體蛋白加0. 02 0. 03 mg FITC熒光色素；避光攪拌6 10 h經FITC標記的抗體蛋白；標記產物用PH8.0的緩沖鹽水透析過夜后，通過葡聚糖凝
G-25柱，分離出游離的熒光素，收集經標記的熒光抗體。5、將5個不同數量級(103、105、107、IO9UO11個)的甲烷氧化菌抽濾產物固定于孔徑為0.2 ym、96孔的濾膜孔上；加入PBS溶液抽濾清洗3次，然后分別加入用PBS稀釋、終濃度為10 mg/mL、經FITC標記的單克隆抗體100 yL，染色2 h ；加入PBS溶液抽濾5次后， 將尚未結合的經FITC標記的單克隆抗體除去。6、用熒光顯微鏡對孔板濾膜上樣品的熒光強度進行分析，制作甲烷氧化菌數量與熒光強度之間關系的標準曲線；研究結果表明，甲烷氧化菌在體外的熒光染色率為99. 7%。實施例4
1、用5 L發酵罐培養甲烷氧化菌NY003溶液2 L至OD值為0. 6，5000 X g離心5 min
后收集菌體，超聲破碎后提取膜組分。2、采用現有技術從膜組分中得到含0. (質量/體積，g/mL) n_十二烷基-β， -麥芽糖苷的膜蛋白溶液；向該溶液加入0.1% Tween 20后進行柱層析分離，提取 pMMOo3、委托專業廠家制備pMMO單克隆抗體。4、按每毫克pMMO單克隆抗體蛋白加0. 02 0. 03 mg FITC熒光色素；避光攪拌6 10 h經FITC標記的抗體蛋白；標記產物用PH8.0的緩沖鹽水透析過夜后，通過葡聚糖凝
G-50柱，分離出游離的熒光素，收集經標記的熒光抗體。5、將5個不同數量級(103、105、107、IO9UO11個)的甲烷氧化菌抽濾產物固定于孔徑為0.2 ym、96孔的濾膜孔上；加入PBS溶液抽濾清洗3次，然后分別加入用PBS稀釋、終濃度為10 mg/mL、經FITC標記的單克隆抗體100 yL，染色2 h ；加入PBS溶液抽濾5次后， 將尚未結合的經FITC標記的單克隆抗體除去。6、用熒光顯微鏡對孔板濾膜上樣品的熒光強度進行分析，制作甲烷氧化菌數量與熒光強度之間關系的標準曲線；研究結果表明，甲烷氧化菌在體外的熒光染色率為99. 6%。
權利要求
1. 一種甲烷氧化菌體外特異性熒光染色的方法，其特征在于包括如下步驟(1)PMMO提取和純化采用洲(質量/體積，g/mL)n_十二烷基-β，D-麥芽糖苷溶解甲烷氧化菌的膜蛋白組分，然后使用吸附劑BioBeads SM-2將變性劑η_十二烷基-β，D-麥芽糖苷吸附去除，使其濃度降低至0. 2%，最后加入0. 1%的變性劑Brij 58或Tween 20進行柱層析分離和純化PMMO ；(2)單克隆抗體的制備將純化得到的ρΜΜΟ進行小鼠免疫試驗，經3次免疫和1次加強免疫后，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合培養，篩選得到能與PMMO膜外結構域結合的單克隆單體；(3)單克隆抗體的FITC熒光標記在堿性溶液中，應用Marsshall法標記FITC熒光抗體；(4)甲烷氧化菌體外染色和檢測分析將該標記抗體對甲烷氧化菌進行體外染色，最后用熒光顯微鏡對熒光強度進行分析，評價染色效果。
全文摘要
本發明涉及蛋白質染色技術領域，公開了一種甲烷氧化菌體外特異性熒光染色的方法。本發明利用甲烷氧化菌特征性跨膜蛋白“甲烷單加氧酶(pMMO)”與異硫氰酸熒光素(FITC)標記的pMMO單抗的特異性結合，進行甲烷氧化菌體外特異性熒光染色的方法；包括pMMO提取和純化；pMMO單克隆抗體的制備；pMMO單克隆抗體的FITC熒光標記；甲烷氧化菌的體外染色。熒光強度分析和標準曲線制作驗證了本發明能實現對甲烷氧化菌在體外進行特異性高效(99.6%~99.9%)熒光染色的目的，為土壤和沉積物樣品中甲烷氧化菌的高通量定量檢測提供技術支持。
文檔編號G01N1/30GK102183398SQ20111004458
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月24日 優先權日2011年2月24日
發明者劉權, 呂寶鳳, 吳酬飛, 彭娟, 徐小明, 徐小燕, 燕騰鵬, 王江海, 袁建平, 許紅, 鄭新寧, 鄭貴洲 申請人:中山大學, 廣州安能特化學科技有限公司