專利名稱：一種制作一次成型組織芯片的方法及應用于該方法中的模具的制作方法
技術領域：
本發明屬于組織芯片制作技術領域，涉及一種制作一次成型組織芯片的方法及應 用于該方法中的模具。
背景技術：
組織芯片(tissue chip)又稱組織微陣列(tissue microarray, TMA)，是將數十 至上千個小組織整齊地排列在一張載玻片上而制成的組織切片。它是繼基因芯片、蛋白質 芯片之后出現的又一種重要的生物芯片，主要用于研究同一種基因或蛋白質分子在不同細 胞或組織中表達的情況，具有高通量、大樣本、省時快速等優點。自1998年Kononen等提 出組織芯片的明確概念并證實其作用以來，組織芯片技術發展迅速。該技術已應用于人類 基因組研究、醫學診斷和基礎研究，尤其是在腫瘤基因篩選、腫瘤抗原篩選及尋找與腫瘤發 生、發展及預后相關的標記物等方面顯示了巨大的潛能。組織芯片具有以下優點(1)組織芯片是一種高通量、大樣本技術，一次實驗操作 可以完成傳統實驗方法的幾十次甚至上千次的操作，顯著提高病理組織學研究的效率，省 時快速；(2)耗材少，所需費用是傳統病理學方法的1/10 1/100 ； (3)含生物學信息量大， 有助于進行大樣本的回顧性研究。(3)組織芯片實驗條件比較一致，有利于設計實驗對照 組；(4)可以減少傳統實驗方法中批內和批間誤差；(6)組織芯片的圖像數據可以采用自動 化分析方法，便于數據采集、儲存和檢索；(7) —塊組織芯片蠟塊含有幾十種甚至上千種組 織標本的信息，便于存檔蠟塊的保存。組織芯片應用范圍廣，可用于醫學基礎研究及臨床 研究，還可用于分子診斷、治療靶點定位、抗體或新藥篩選以及基因或蛋白表達的原位分析 等。組織芯片在腫瘤學研究中應用廣泛。組織芯片的應用前景非常廣闊，但制作組織芯片卻很是繁瑣，需要制作空心蠟模， 二次包埋等，還需要帶有抽真空功能的組織芯片制作儀器等。而且制作過程技術要求高，制 作空心蠟模時容易出現變形或開裂；二次包埋時容易出現組織芯融合不佳或熔蠟過度；組 織面不平整；切片時組織移位，甚至脫片等問題。目前比較先進的組織芯片儀價格高達幾 十萬人民幣，即使是國產的也要幾萬人民幣，而且都非常笨重。這些缺點都使得組織芯片的 發展和應用受到了很大的限制，更使得組織芯片技術無法在基層醫院或科研單位推廣。

發明內容
本發明針對現有技術存在的上述問題，提出了 一種制作一次成型組織芯片的方法 及應用于該方法中的模具，通過該方法能夠制作一次成型的組織芯片，并且能夠簡化制作 流程，操作步驟簡單，具有快速、經濟和容易上手等優點；該模具使用方便，結構簡單，成本 低。本發明通過下列技術方案來實現一種制作一次成型組織芯片的方法，其特征在 于，該方法包括如下步驟
(1)、組裝模具將預先設計的模具部件——陣列孔銅板、陣列針銅板和L形銅墊 片組裝起來，陣列孔銅板上的陣列通孔形成陣列模腔；

(2)、取芯和填充用取樣器在預先制作的石蠟包埋組織標記部位打孔取出組織 芯，并按預先準備的組織芯片設計表一一對應填入陣列模腔中；(3)、預熱和注蠟將模具中的承蠟槽放在陣列孔銅板上，使陣列模腔位于承蠟槽 內，再將模具整體放入溫箱預熱，預熱后取出模具，馬上注入68 72°C的石蠟，注入的量 不超過塑料包埋盒的承托面，在石蠟微凝時頂起組織芯，再放入塑料包埋盒，再注滿68 72 °C的石蠟；(4)、拆卸將石蠟快速冷卻，在完全冷卻后，在烤片臺上加熱底座和四周即可取下 模具，至此，組織芯片蠟塊即可制作完成；(5)、切片與染色將制成的組織芯片石蠟塊置于零下20°C冰箱內16 24分鐘， 取出后切成4 μ m厚組織芯片。在上述制作一次成型組織芯片的方法中，在所述的步驟(3)中，模具放入溫箱預 熱直至蠟柱微微熔化——表面發亮即可；將模具自溫箱取出，馬上注入68 72°C石蠟后， 觀察蠟柱周圍開始凝固——泛白，就可取出兩塊L形銅墊片，將列陣孔銅板均勻下壓，即將 組織芯均勻頂起，待承蠟槽內石蠟凝固不再透明后就可放入塑料包埋盒。上述的方案由于頂起組織芯操作需待石蠟稍稍凝固后實施，導致頂起部分的組織 芯與蠟體間會留有一些細小的氣泡，為此，作為第二種技術方案，在上述制作一次成型組織 芯片的方法中，在所述的步驟(3)中，準備Imm厚的L形銅墊片和0. 2mm厚的L形銅墊片，在 填充好組織芯后撤去的Imm厚的L形銅墊片，換以0. 2mm的L形銅墊片，再將模具整體放入 溫箱預熱，直至蠟柱微微熔化——表面發亮即可；將模具自溫箱取出，馬上注入68 72°C 的石蠟，在注蠟后不等石蠟凝固，馬上均勻用力按下陣列孔銅板，頂起組織芯，待承蠟槽內 石蠟凝固不再透明后，放入塑料包埋盒。作為第三種方案，在上述制作一次成型組織芯片的方法中，在所述的步驟(3)中， 準備Imm厚的L形銅墊片和0. 2mm厚的L形銅墊片，在填充好組織芯后撤去的Imm厚的L 形銅墊片，換以0. 2mm的L形銅墊片，均勻用力將組織芯頂起，再將模具整體放入溫箱預熱， 直至蠟柱微微熔化——表面發亮即可；將模具自溫箱取出，馬上注入68 72°C的石蠟，待 承蠟槽內石蠟凝固不再透明后，放入塑料包埋盒。為了消除第二種方案和第三種方案在制作時會導致包埋組織芯浪費，在上述制作 一次成型組織芯片的方法中，在完成所述步驟(3)中，換上0. 2mm的L形銅墊片并完成注蠟 后，立即頂起組織芯，待石蠟柱周圍開始凝固而泛白時再將0. 2mm厚L形銅墊片抽出，再均 勻按下陣列孔銅板將最后組織芯頂起。在上述制作一次成型組織芯片的方法中，在所述的步驟(2)中，石蠟包埋組織定 位是將所有石蠟包埋組織塊切片，HE染色，經病理醫生閱片定位，作好標記。在上述制作一次成型組織芯片的方法中，在所述的步驟(3)中，所述溫箱的溫度 為65°C，預熱時間為15 20分鐘。在上述制作一次成型組織芯片的方法中，在所述的步驟(4)中，石蠟的冷卻通過 放入4°C冰箱或置于空調口加快冷卻。如冷卻太慢，容易導致臘體本身產生氣泡。一種上述方法中制作一次成型組織芯片的模具，其特征在于，該模具包括陣列孔銅板、陣列針銅板和兩個L形銅墊片，陣列孔銅板上設有矩形的陣列通孔，陣列針銅板的一 側設有與上述陣列通孔一一對應的陣列針，陣列針的橫截面和高度與陣列通孔的截面和深 度相同，陣列針插接在陣列通孔中，上述兩個L形銅墊片拼成矩形，并墊在陣列孔銅板和陣 列針銅板之間，上述的陣列針位于兩個L形銅墊片內。在上述制作一次成型組織芯片的模具中，所述的陣列孔銅板上還放置有承蠟槽， 該承蠟槽為一個上下開口的銅質四方框體結構，上部為斗狀的寬口，下部為筒狀的窄口結 構。在上述制作一次成型組織芯片的模具中，所述的承蠟槽的上部設有臺階狀的承接 口。該承接口與病理科使用的塑料包埋框相對應，剛好能夠承托。在上述制作一次成型組織芯片的模具中，所述陣列孔銅板和陣列針銅板均為長方 形，兩者寬度相同，陣列針銅板的長度略長于陣列孔銅板的長度；所述L形銅墊片的長邊比 陣列針銅板的寬度略長。在上述制作一次成型組織芯片的模具中，所述陣列針銅板大小50X 30mm2，厚3mm， 針間距為1mm，陣列針的直徑為2mm ；所述陣列孔銅板大小為45 X 30mm2,厚4mm，陣列通孔的 孔徑2mm，孔間距Imm;在上述制作一次成型組織芯片的模具中，所述L形銅墊片厚為1mm， 邊寬為3mmο

與現有技術相比，本發明能夠簡化原有的組織芯片制作流程，提高組織芯片制作 速度和質量，降低切片時組織芯移位和掉片率。本方法只需一個取樣器和四種銅質模具即 可完成整個制作過程，而且操作步驟簡單，具有簡便、快速、經濟、容易上手等優點。通過定 位、取樣、填充、預熱、注蠟等步驟即可一次性完成組織芯片蠟塊的制作，無需制作空心蠟 模，無需二次包埋。制成的組織芯片蠟塊具有組織面平整、一體性好、切片時不掉芯不位移 等優點。


圖1是模具組裝好后的結構示意圖。圖2為承蠟模塊的冠狀面切面圖。圖3為承蠟模塊的矢狀面切面圖。圖4為陣列孔銅板的結構示意圖。圖5為陣列針銅板的結構示意圖。圖6為L形銅墊片的結構示意圖。圖中，1、陣列孔銅板；2、陣列針銅板；3、L形銅墊片；4、陣列通孔；5、陣列針；6、承
蠟槽；7、模腔。
具體實施例方式以下是本發明的具體實施例，并結合附圖對本發明的技術方案作進一步的描述， 但本發明并不限于這些實施例。實施例1 本發明中制作一次成型組織芯片的模具包括陣列孔銅板1、陣列針銅板2和兩個L 形銅墊片3，陣列孔銅板1上設有nXn矩形的陣列通孔4，陣列通孔4的大小和排列根據需要可靈活變動。陣列針銅板2的一側設有與陣列通孔4 一一對應的陣列針5，陣列針5排列 與陣列通孔4完全相同，既陣列針5的橫截面和高度與陣列通孔4的截面和深度相同，陣列 孔銅板1和陣列針銅板2均為長方形，兩者寬度相同，陣列針銅板2的長度略長于陣列孔銅 板1的長度，可方便組裝和拆卸。以6X7列陣為例提供參考數據陣列孔銅板1的陣列通 孔4數為6X7 ；孔徑2mm、孔間距Imm ；陣列孔銅板1大小為45X30mm2，厚4mm。陣列針銅 板2的針數為6X 7，針直徑2mm、針間距1mm，陣列針銅板2大小50X 30mm2，厚3mm。如圖4 和圖5所示。如圖1所示，兩個L形銅墊片3拼成矩形，并墊在陣列孔銅板1和陣列針銅板2之 間，陣列針5位于兩個L形銅墊片3內。由于L形銅墊片3的存在，陣列針5插接在陣列通 孔4中，在陣列通孔4中形成了模腔7，如圖6所示，L形銅墊片3厚為1mm，邊寬為3mm。L 形銅墊片3的長邊比陣列針銅板2的寬度略長，長出部分可方便制作中拆卸L形銅墊片3。

如圖2和圖3所示，陣列孔銅板1上還放置有承蠟槽6，該承蠟槽6為一個上下開 口的銅質四方框體結構，上部為斗狀的寬口，下部為筒狀的窄口結構。承蠟槽6的上部設有 臺階狀的承接口，該承接口與病理科使用的塑料包埋框相對應，剛好能夠承托。下部的窄口 根據陣列通孔的尺寸，略大之；考慮切片方便，總高應在15mm以內。以6X7列陣為例上內 口寬42 X 29mm2 (包埋盒為40 X 28)，高3mm ；傾斜部高4mm ；下部內口寬26 X 24mm2,高6mm ； 四壁厚約2mm。以6X7胃癌組織芯片的制作為例，其制作一次成型組織芯片的步驟如下芯片設計每例胃癌設正常(N)、癌旁(P)、癌造(C)各一孔，6X7列陣可排14例， 最后1孔留空，用于識別陣列方向，設計好后通過電腦制表并將設計表打印。組織定位將所有胃癌石蠟包埋組織塊切片，HE染色，經病理醫生閱片定位，作好 標記。模具的組裝將預先設計的模具——陣列孔銅板1、陣列針銅板2和L形銅墊片3 組裝起來，陣列孔銅板1上的陣列通孔4形成陣列模腔7 ；取芯和填充在標記部位用取樣器打孔取出組織芯，并按組織芯片設計表一一對 應填入陣列通孔4中。填充時稍加用力，盡量不在陣列針5與組織芯之間留有空隙。預熱和注蠟將承蠟槽6放在陣列孔銅板1之上，再將模具整體放入65°C溫箱預 熱15 20min，觀察到蠟柱微微熔化——表面發亮即可；將模具自溫箱取出，馬上注入70°C 的石蠟(不超過塑料包埋盒的承托面)。觀察蠟柱周圍開始凝固——泛白，然后取出2塊L 形銅墊片3，將列陣孔銅板均勻下壓，即將組織芯均勻頂起。待承蠟槽6內石蠟凝固不再透 明后，放入塑料包埋盒，再注滿70°C的石蠟。拆卸置于空調口或4°C冰箱內加快冷卻，待石蠟完全冷卻后，在70°C烤片臺上加 熱底座和四周即可取下模具。至此，組織芯片蠟塊即可制作完成。切片與染色將制成的組織芯片石蠟塊置于零下20°C冰箱內約20min，取出后切 成4 μ m厚組織芯片。然后，即可對切片進行常規HE染色或免疫組化染色。實施例2 實施例2的內容與實施例1基本相同，不同點在于，模具使用兩種型號的L形銅 墊片3，除了實施例1中的Imm厚的銅墊片，還有0.2mm厚的銅墊片。由于實施例1中，頂 起組織芯操作需待石蠟稍稍凝固后實施，導致頂起部分的組織芯與蠟體間會留有一些細小的氣泡，雖然氣泡不影響組織芯的穩固，也不影響切片和染色，但影響了組織芯片蠟塊的美 觀。因此，在步驟預熱和注蠟上與實施例1不同，本實施例中，先準備Imm厚的L形銅墊片 3和0. 2mm厚的L形銅墊片3，在填充好組織芯后撤去的Imm厚的L形銅墊片3，換以0. 2mm 的L形銅墊片3，將模具中的承蠟槽6放在陣列孔銅板1上，使陣列模腔7位于承蠟槽6內， 再將模具整體放入溫箱預熱，直至蠟柱微微熔化——表面發亮即可；將模具自溫箱取出，馬 上注入70°C的石蠟，注入的量不超過塑料包埋盒的承托面，在注蠟后不等石蠟凝固，馬上均 勻用力，按下陣列孔銅板1，頂起組織芯，待承蠟槽6內石蠟凝固不再透明后，放入塑料包埋 盒，再注滿70°C的石蠟。由于超薄L形銅墊片3的作用，使陣列針5不能完全頂出，陣列通 孔4仍留有約0. 2mm孔深，使得組織芯能夠很好的保持位置，不移動不傾斜，石蠟的流動性 也很好，減少了氣泡存在的空間。通過實施例2制作的組織芯片有0. 2mm厚是露在蠟塊平面外的，在切片時此突出 部分必須先被切除。因此，如果要求蠟塊即美觀無氣泡，又不浪費組織，在完成注蠟后，待石 蠟柱周圍開始凝固而泛白時再將超薄“L”形墊片抽出，在均勻按下陣列孔銅板1將最后的 約0.2mm的組織頂起。由于頂起厚度很小，頂起部分與蠟體間留有的氣泡也很少。這樣即 可以保證大部分組織芯與蠟體融合的很好，又可充分利用組織芯的厚度。實施例3 實施例3基本與實施例2相同，只是在預熱和注蠟步驟上與實施例2不同，在填充 好組織芯后撤去的Imm厚的L形銅墊片3，換以0. 2mm的L形銅墊片3，均勻用力將組織芯頂 起，將模具中的承蠟槽6放在陣列孔銅板1上，使陣列模腔7位于承蠟槽6內，再將模具整 體放入溫箱預熱，直至蠟柱微微熔化——表面發亮即可；將模具自溫箱取出，馬上注入70°C 的石蠟，注入的量不超過塑料包埋盒的承托面，待承蠟槽6內石蠟凝固不再透明后，放入塑 料包埋盒，再注滿70°C的石蠟。
權利要求
1.一種制作一次成型組織芯片的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)、組裝模具將預先設計的模具部件——陣列孔銅板(1)、陣列針銅板⑵和L形銅 墊片⑶組裝起來，陣列孔銅板⑴上的陣列通孔⑷形成陣列模腔(7)；(2)、取芯和填充用取樣器在預先制作的石蠟包埋組織標記部位打孔取出組織芯，并 按預先準備的組織芯片設計表一一對應填入陣列模腔(7)中；(3)、預熱和注蠟將模具中的承蠟槽(6)放在陣列孔銅板⑴上，使陣列模腔(7)位于 承蠟槽(6)內，再將模具整體放入溫箱預熱，預熱后取出模具，馬上注入68 72°C的石蠟， 注入的量不超過塑料包埋盒的承托面，在石蠟微凝時頂起組織芯，再放入塑料包埋盒，再注 滿68 72 °C的石蠟；(4)、拆卸將石蠟快速冷卻，在完全冷卻后，在烤片臺上加熱底座和四周即可取下模 具，至此，組織芯片蠟塊即可制作完成；(5)、切片與染色將制成的組織芯片石蠟塊置于零下20°C冰箱內16 24分鐘，取出 后切成4μπι厚組織芯片。
2.根據權利要求1所述的制作一次成型組織芯片的方法，其特征在于，在所述的步驟 (3)中，模具放入溫箱預熱直至蠟柱微微熔化——表面發亮即可；將模具自溫箱取出，馬上 注入68 72°C石蠟后，觀察蠟柱周圍開始凝固——泛白，就可取出兩塊L形銅墊片(3)，將 列陣孔銅板均勻下壓，即將組織芯均勻頂起，待承蠟槽(6)內石蠟凝固不再透明后就可放 入塑料包埋盒。
3.根據權利要求1所述的制作一次成型組織芯片的方法，其特征在于，在所述的步驟 (3)中，準備Imm厚的L形銅墊片(3)和0. 2mm厚的L形銅墊片(3)，在填充好組織芯后撤 去的Imm厚的L形銅墊片(3)，換以0. 2mm的L形銅墊片(3)，再將模具整體放入溫箱預熱， 直至蠟柱微微熔化——表面發亮即可；將模具自溫箱取出，馬上注入68 72°C的石蠟，在 注蠟后不等石蠟凝固，馬上均勻用力按下陣列孔銅板(1)，頂起組織芯，待承蠟槽(6)內石 蠟凝固不再透明后，放入塑料包埋盒。
4.根據權利要求1所述的制作一次成型組織芯片的方法，其特征在于，在所述的步驟 (3)中，準備Imm厚的L形銅墊片(3)和0. 2mm厚的L形銅墊片(3)，在填充好組織芯后撤 去的Imm厚的L形銅墊片(3)，換以0. 2mm的L形銅墊片(3)，均勻用力將組織芯頂起，再將 模具整體放入溫箱預熱，直至蠟柱微微熔化——表面發亮即可；將模具自溫箱取出，馬上注 入68 72°C的石蠟，待承蠟槽(6)內石蠟凝固不再透明后，放入塑料包埋盒。
5.根據權利要求3所述的制作一次成型組織芯片的方法，其特征在于，在所述的步驟(3)中，換上0.2mm的L形銅墊片并完成注蠟后，立即頂起組織芯，待石蠟柱周圍開始凝固而 泛白時再將0. 2mm厚L形銅墊片(3)抽出，再均勻按下陣列孔銅板(1)將最后組織芯頂起。
6.根據權利要求1或2或3或4或5所述的制作一次成型組織芯片的方法，其特征在 于，在所述的步驟(3)中，所述溫箱的溫度為65°C，預熱時間為15 20分鐘。
7.根據權利要求6所述的制作一次成型組織芯片的方法，其特征在于，在所述的步驟(4)中，石蠟的冷卻通過放入4°C冰箱或置于空調口加快冷卻。
8.—種在權利要求7所述方法中所使用的制作一次成型組織芯片的模具，其特征在 于，該模具包括陣列孔銅板(1)、陣列針銅板(2)和兩個L形銅墊片(3)，陣列孔銅板(1)上 設有矩形的陣列通孔(4)，陣列針銅板(2)的一側設有與上述陣列通孔(4) 一一對應的陣列針(5)，陣列針(5)的橫截面和高度與陣列通孔(4)的截面和深度相同，陣列針(5)插接在 陣列通孔⑷中，上述兩個L形銅墊片(3)拼成矩形，并墊在陣列孔銅板⑴和陣列針銅板 (2)之間，上述的陣列針(5)位于兩個L形銅墊片(3)內。
9.根據權利要求8所述的制作一次成型組織芯片的模具，其特征在于，所述的陣列孔 銅板(1)上還放置有承蠟槽(6)，該承蠟槽(6)為一個上下開口的銅質四方框體結構，上部 為斗狀的寬口，下部為筒狀的窄口結構，所述的承蠟槽(6)的上部設有臺階狀的承接口。
10.根據權利要求9所述的制作一次成型組織芯片的模具，其特征在于，所述陣列孔銅 板(1)和陣列針銅板(2)均為長方形，兩者寬度相同，陣列針銅板(2)的長度略長于陣列孔 銅板⑴的長度；所述L形銅墊片(3)的長邊比陣列針銅板(2)的寬度略長。
全文摘要
本發明提供了一種制作一次成型組織芯片的方法及應用于該方法中的模具，屬于組織芯片制作技術領域。它解決了現有的組織芯片制作過程技術要求高等問題。本方法包括如下步驟(1)組裝模具；(2)取芯和填充；(3)預熱和注蠟；(4)拆卸；(5)切片與染色。通過該方法能夠制作一次成型的組織芯片，并且能夠簡化制作流程，操作步驟簡單，具有快速、經濟和容易上手等優點。
文檔編號G01N1/28GK102042922SQ20101052874
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月2日 優先權日2010年11月2日
發明者包衛光, 林愛芬, 顏衛華 申請人:浙江省臺州醫院