專利名稱：賴氨酸去丙酰化酶及去丁酰化酶的篩選及活性測定方法
技術領域：
本發明涉及了一種篩選賴氨酸去丙酰化酶和去丁酰化酶以及測定賴氨酸去丙酰 化酶和去丁酰化酶活性的方法。尤其是通過測定Boc-Lys (Prop) -AMC (叔丁氧羥基丁酰化 賴氨酸-4-氨基-7-甲基香豆素)和Boc-Lys (Buty) -AMC (叔丁氧羥基丙酰化賴氨酸_4_氨 基-7-甲基香豆素)被賴氨酸去丙酰化酶及去丁酰化酶的催化后的熒光強度，以及結合質 譜鑒定、生物化學分析和細胞學檢測確認特異性的賴氨酸去丙酰化酶和去丁酰化酶以及酶 活性的測定。
背景技術：
核小體是染色質的基本重復單元，由八聚體的核心組蛋白以及環繞的約長147堿 基對的DNA構成。核小體能夠進一步折疊成更高級的結構ω。染色質結構的動態變化調節 了 DNA的可塑性，進而影響了基于DNA模板的生物學過程，如轉錄，復制和重組。在過去幾十年里，大量研究顯示組蛋白的翻譯后修飾(PTMs)通過調節染色質的 結構和功能在細胞過程中起到了至關重要的作用te_S。組蛋白，尤其是其N末端尾部，至少 存在11種蛋白翻譯后修飾方式，包括乙酰化，ADP-核糖基化，瓜氨酸化，甲酰化，甲基化，磷 酸化，脯氨酸異構化，SUMO化，泛素化，以及在賴氨酸側鏈的丁酰化和丙酰化(后兩者分別 記為Kpmp和KBut0。組蛋白翻譯后修飾被認為調節了染色質的結構，進而通過兩種機制行使 功能(2_3’5)。首先，通過改變組蛋白的電荷或核小體間相互作用直接調節染色質包裝過程， 進而調節了染色質的高級結構和DNA結合蛋白的結合能力。其次，組蛋白翻譯后修飾能夠 招募與修飾特異性結合的蛋白及這些蛋白的相互作用蛋白，或者阻止某些蛋白結合到染色 質上。組蛋白賴氨酸乙酰化約在四十年前被鑒定。該修飾是一種高度調節的可逆的翻譯 后修飾方式，其修飾狀態被兩組互為相反活性的酶一組蛋白乙酰轉移酶(HATs或KATs) 和組蛋白去乙酰化酶(HDACs)所調控(6_7)。組蛋白賴氨酸乙酰化通過中和賴氨酸側鏈的正 電荷調節染色質的可塑性，并且產生了一個能夠招募具有bromo結構域蛋白的“停泊”位點 (6’8)。組蛋白賴氨酸過乙酰化被認為與活性基因表達相關。近年來，質譜分析和基因組尺度 的關聯研究強有力地表明了賴氨酸乙酰化與其它組蛋白翻譯后修飾之間存在著長距離的 關聯。例如，組蛋白H3過乙酰化與組蛋白H4第四位賴氨酸的三甲基化OKMmd)顯著相 關，并調節了活性基因轉錄(…9-11)。除了組蛋白，賴氨酸乙酰化也存在于細胞的不同區域中， 包括核蛋白，胞質蛋白和線粒體蛋白，并且這些修飾與衰老和多種疾病密切相關(12_14)。最近，我們通過質譜分析在組蛋白H4上鑒定到兩種結構與賴氨酸乙酰化相似的 翻譯后修飾方式一賴氨酸丙酰化與賴氨酸丁酰化(15)。最初的鑒定通過對合成多肽的二級 質譜分析(MS/MS或串聯質譜)、體外酶促反應、HPLC共洗脫、以及修飾得的蛋白印跡分析得 到確認(15_16)。我們最近的研究證實這兩種翻譯后修飾并不僅僅存在于組蛋白中，在一些非 組蛋白如p53，p300和CBP中也存在(17)。研究顯示賴氨酸乙酰化的調節酶，Sirtl，p300和 CBP也能夠調節p53的丙酰化(17)。Escalante-Semerena及其同事報道了腸道沙門氏菌的丙酰輔酶A合酶的賴氨酸丙酰化，并顯示該可逆性修飾起到了調節酶活性的作用(18)。賴氨酸乙酰化，丙酰化和丁酰化之間在生化水平存在類似性。例如，這三種修飾均 用三種不同的高能輔酶A分子，即乙酰輔酶A，丙酰輔酶A和丁酰輔酶A，作為修飾反應的底 物。先前的結構研究顯示酵母組蛋白乙酰轉移酶Hatl具有一個空間上足夠大的乙酰輔酶 A結合域，在空間上該結合域可接受更大的乙酰輔酶A類似物⑽。因此，丁酰輔酶A也可能 被某些賴氨酸乙酰轉移酶(KATs)所利用以催化賴氨酸丙酰化反應。的確，研究表明乙酰化 轉移酶P300/CBP能夠利用催化同位素標記的丁酰輔酶A轉移到組蛋白賴氨酸(15)。此外， 一些去乙酰化酶，如Sirtl，在體內和體外都能夠催化去丙酰化反應(17)。利用一系列賴氨酸 乙酰化類似多肽作為底物，Smith和Denu發現一些去乙酰化酶具有對體外賴氨酸丁酰化的 可測量的酶活性_)。這些有限的研究暗示了在賴氨酸去乙酰化和去丙酰化及去丁酰化反 應之間共享一些催化酶的可能性。然而，對具體的賴氨酸去丙酰化和去丁酰化酶的篩選以 及酶活性的測定卻知之甚少，從而直接影響了對這兩種修飾方式的生物學功能研究。

發明內容
基于此，結合生物化學分析，本發明提出了一種篩選賴氨酸去丙酰化酶和去丁酰 化酶以及酶活性測定的方法。本發明方法包括三個主要步驟首先，合成高純度的Boc-Lys (Prop)-AMC和 B0c-Lys(Buty)-AMC;其次，將待篩選賴氨酸去丙酰化酶或去丁酰化酶在特定的反應體系中 與Boc-Lys (Prop) -AMC或Boc-Lys (Buty) -AMC反應，特異性的賴氨酸去丙酰化酶或去丁酰 化酶將能夠切除賴氨酸側鏈的丙酰基(Prop)或丁酰基(Buty)，進而在胰酶的裂解作用下 釋放出AMC基團，通過測定釋放的AMC基團的熒光強度初步篩選特異的賴氨酸去丙酰化酶 或去丁酰化酶，并通過測定的熒光強度反映酶的活性強度；最后，經一系列的質譜分析和生 化分析確定候選的賴氨酸去丙酰化酶或去丁酰化酶為目標賴氨酸去丙酰化酶或去丁酰化 酶。以賴氨酸去丁酰化酶的篩選和活性測定為例，通過測定不同的待篩選酶對 Boc-Lys (Buty) -AMC催化后釋放的AMC基團的熒光強度，本發明首先確認了 HDAC3和HDAC6 為候選賴氨酸去丁酰化酶；隨后通過HDAC3及HDAC6對合成的賴氨酸丁酰化肽段去丁酰化 后的二級質譜分析以及體外生化試驗證明這兩種酶具有體外賴氨酸去丁酰化酶；最后，通 過體內的生化實驗和細胞學實驗確認HDAC3及HDAC6為賴氨酸去丁酰化酶。除了對賴氨酸去丙酰化酶和去丁酰化酶的篩選以及酶活性測定，本發明的基本原 理及實驗方法同樣能用于常規的酶活性分析及后繼的藥物篩選。此外，本發明還提出了一種用于篩選賴氨酸去丙酰化酶及酶活性測定的試劑盒， 該試劑盒包括a.標記有可釋放信號物質的賴氨酸丙酰化底物多肽；b.能夠根據底物多肽的丙酰化水平而改變其酶切活性的肽酶。本發明的另一種用于鑒定能抑制或增強去丙酰化酶活性的化合物的試劑盒，其包 括a.標記有可釋放信號物質的賴氨酸丙酰化底物多肽；b.賴氨酸去丙酰化酶；
c.能夠根據底物多肽的丙酰化而改變其酶切活性的肽酶。本發明的另一種用于篩選賴氨酸丙酰化酶及酶活性測定的試劑盒包括a.標記 有可釋放信號物質的底物多肽；b.能夠根據底物多肽的丙酰化水平而改變其酶切活性的 肽酶。其中，上述任一檢測試劑盒，所述可釋放信號物質是一種染料。所述的染料為一種 熒光物質，釋放的信號是熒光信號。所述白勺月太 Bl 來自于 Lysylendopeptidase> endoproteinase Lys~C> plasmin、 calpain、metalloendopeptidase 及 Armillaria meIlea protease。所述的丙酰化底物多肽含有一個丙酰化賴氨酸殘基。所述的肽酶為 Iysylendop印tidase。所述的賴氨酸丙酰化底物多肽是經7-amino-4-methyl-coumarin (AMC)或 para-nitroaniline (p-Na)熒光團標記的丙酰化/ 丁酰化賴氨酸，且熒光團與賴氨酸用肽 鍵相連。所述的底物多肽含有一個賴氨酸殘基。


圖1.組蛋白賴氨酸丁酰化是真核細胞中進化保守的翻譯后修飾。(A)乙酰輔酶A 和丁酰輔酶A結構，以及賴氨酸乙酰化和丁酰化酶促反應圖示圖。(B)五種真核細胞中組蛋 白的賴氨酸丁酰化。核心組蛋白賴氨酸丁酰化的免疫印跡檢測(上)及等量核心組蛋白的 考馬斯藍染色(下)。(C)細胞核及染色體中的賴氨酸丁酰化免疫熒光檢測。(D)經質譜分 析所得的五種真核細胞中核心組蛋白賴氨酸乙酰化，丙酰化和丁酰化位點示意圖。Ac 乙酰 基；Pr 丙酰基；Bu 丁酰基；0 未檢測到。圖2.蛋白賴氨酸去丁酰化酶的初步篩選與活性測定。(A)HDAC抑制劑影響組 蛋白賴氨酸丁酰化狀態。HeLa細胞分別用I，II，III，IV類HDAC抑制劑處理6小時后， 免疫印跡分析核心組蛋白賴氨酸丁酰化水平。HDAC抑制劑分別是2μ M trichostatin A(TSA) ；50mM T W. ^ ；50 μ M suberoyl anilide hydroxamic acid(SAHA) ；10ng/ml depsipeptide (FK288) ；30mM nicotinamide 禾口 200 μ M sirtinol。 (B)Boc-Lys(Buty)-AMC 的合成與分子結構(合成方法見具體實施方式
)。(C)賴氨酸去丁酰化酶的篩選與活性測 定(篩選與活性測定方法見具體實施方式
)。圖3. HDCA3體外催化賴氨酸去丁酰化。(A_C)HDAC3催化組蛋白H3多肽的賴氨酸 去丁酰化(多肽序列CSTGGK14ButyAPRK18ButyQLATK23ButyAARK)。A-C顯示合成的丁酰化組蛋 白H3多肽(A)，或與HDAC3孵育(B)，或與HDAC3加入2 μ M TSA孵育(C)后的MALDI-T0F 譜圖。每個主峰的分子量均標出，對應于去除一個、兩個或三個丁酰基團產物的肽譜峰用箭 頭標出。(D-F) HDAC3催化組蛋白Η4多肽的賴氨酸去丁酰化。實驗過程與(A-C)相同，除了 使用合成的丁酰化組蛋白Η4多肽為反應底物(多肽序列CSGRGK5ButyGGK8ButyGLGK12ButyGGA K)。(I)HDAC3體外催化核心組蛋白去丁酰化。來自HeLa細胞的核心組蛋白與加入或不加入 TSA(10 μ Μ)的重組HDAC3在37°C孵育3小時后，免疫印跡分析核心組蛋白賴氨酸丁酰化水 平。IOOng重組HDAC3和50pmol H3多肽用于上述分析。圖4. HDAC3體內催化組蛋白賴氨酸去丁酰化。(A)HeLa細胞轉染表達Flag_HDAC3，轉染后36小時，免疫印跡分析核心組蛋白賴氨酸丁酰化水平。(B)與(A)相同，除了轉染表 達酶失活突變體Flag-HDAC3S424A。(C)核內HDAC3促進組蛋白賴氨酸去丁酰化水平。HeLa 細胞轉染表達Flag-HDAC3和Flag_HDAC3S424A突變體，轉染36小時后，核心組蛋白H4K5 丁酰化水平的免疫熒光檢測。圖5. HDAC6體內體外催化組蛋白賴氨酸丁酰化。(A)體外HDAC6催化核心組蛋白 去乙酰化。提取的HeLa細胞核心組蛋白與HDAC6 (野生型或酶失活突變體)，加入或不加入 TSA (2 μ Μ)，在37°C孵育2小時，免疫印跡分析核心組蛋白賴氨酸丁酰化水平。(B)HDAC6體 內催化核心組蛋白賴氨酸去丁酰化。HeLa細胞轉染表達Flag-HDAC6，轉染后36小時，免疫 印跡分析核心組蛋白賴氨酸丁酰化水平。(C)HDAC6酶失活突變體不能在體內催化組蛋白賴 氨酸去丁酰化。所有實驗過程與(B)相同，除了使用了 Flag-HDAC6H216/611A酶活缺失突變 體。(D) I^ptomycin B (Iiffi)促進了 HDAC6對核心組蛋白賴氨酸去丁酰化。HeLa細胞轉染 表達 Flag-HDAC6 或 Flag-HDAC6H216/611A 突變體。轉染 36 小時后，Ieptomycin B (200nm) 處理細胞3小時，免疫印跡分析核心組蛋白賴氨酸丁酰化水平。(E-F)I^ptomycin B促進了 HDAC6對組蛋白H4K5和K12的去丁酰化。所有實驗過程與(D)相同，除了使用序列特異的 賴氨酸丁酰化抗體免疫印跡(E)或免疫熒光(F)檢測組蛋白H4特定位點的賴氨酸丁酰化 水平。
具體實施例方式質粒，抗體和其他試劑編碼HDAC3，HDAC6cDNA的質粒及其對應酶失活突變體質 粒 HDAC3S424A 和 HDAC6H216/6IlA 由 H. Lee Moffitt 癌癥中心的 Edward Seto 惠贈。質粒 信息見之前報道(21_22)。抗丁酰賴氨酸抗體和抗組蛋白位點特異性丁酰賴氨酸的抗體有本發 明人自己制備。其它用到的抗體有抗乙酰化賴氨酸抗體(ImmunoChemPharmaceuticals， Burnaby, British Columbia, Canada)；抗組蛋白 H3 抗體，抗組蛋白 H4 抗體(Abcam， Cambridge, UK)；抗 HA 抗體(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)；抗 Flag 抗體 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。重組 HDACl，HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAClO 和 HDACll 購至 BPSBioscience Inc. (BPS Bioscience Inc.，San Diego, CA)。丁酰輔酶 A，乙酰輔酶 A，Leptomycin B 和乙酸購自 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO) ο HPLC 級乙腈，水和乙醇購自 EMD Chemicals Inc. (Gibbstown，NJ)。帶有一個 或幾個丁酰化賴氨酸的多肽由吉爾生化合成O^L Biochem Ltd.，Shanghai, P. R. China)。Boc-Lys (Buty)-AMC 的合成在 23°C 下，向含有 Boc-Lys-AMC(50mg，0. 124mmol, 1.0當量)和三乙胺(35μ ，0·248πιπιΟ1，2·0當量)的二氯甲烷(ImL)溶液中加入丁酰 氯(16yL，0. 149mm0l，1.2當量)。攪拌過夜。反應液用二氯甲烷(ImL)稀釋，然后用 飽和碳酸氫鈉溶液OmLX^和水QmL)洗滌。有機相用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮后獲得 Boc-Lys(Buty)-AMC0組蛋白去丁酰化酶的篩選及酶活性檢測及酶的確認組蛋白去丁酰化酶的篩 選與酶活性檢測采用修飾基團催化切除后測定激發熒光的方法。首先，發明人發展了 一種基于熒光強度測定的賴氨酸去丁酰化酶的篩選及酶活性測定的方法。該方法與用 于測定賴氨酸去乙酰化酶的方法類似(23_24)。將本發明人合成的Boc-Lys (Buty)-AMC和 Boc-Lys (ftx)p)-AMC用于熒光測定的底物。為篩選和測定賴氨酸去丁酰化酶及酶活性，隨后將待篩選的重組去乙酰化酶Ong或200ng)與85 μ 1 ddH20,10 μ 1 IOX HDAC反 應緩沖液(25mM Tris-CKpH 8. 0), 137mM NaCl,2. 7mM KCl, ImM MgCl2)禾Π 5 μ 1 4mM Boc-Lys(Buty)-AMC混合。混合物在37°C反應30分鐘。向反應體系中加入10 μ 1發明人 自制的Lysine Developer終止反應，并在37°C孵育30分鐘。胰酶裂解后產生的熒光強度 通過 SPECTRAFluor Plus 熒光微孔板閱讀儀(MTX Lab Systems Inc.，Vienna, VA)在 Ex =350-380nm和Em = 440-460nm處測定。只有能催化去除丁酰基或丙酰基的酶才能產生 熒光信號，而熒光強度代表該酶去賴氨酸丁酰化或丙酰化的酶活性。組蛋白賴氨酸去丁酰化酶的質譜分析將初步篩選出的賴氨酸去丁酰化酶和合成 的賴氨酸丁酰化多肽在 ο μ 1 HDAC反應緩沖液中37°C反應2小時。在一個典型的實驗中， 需用IOOng候選賴氨酸去丁酰化酶和50pmol多肽底物。為進一步確認候選賴氨酸去丁酰 化酶的體外催化能力，加入2μ M TSA以抑制賴氨酸去丁酰化酶活性。反應后的底物多肽最 后經過μ C18Zip Tips純化，進行MALDI-T0F質譜分析。組蛋白賴氨酸去丁酰化酶的生物化學及細胞學確認為分析候選組蛋白賴氨酸去 丁酰化酶的體外活性，將初步篩選出的重組賴氨酸去丁酰化酶與從真核細胞中分離的6 μ g 核心組蛋白在15 μ 1 HDAC反應緩沖液中37°C反應2小時，反應產物經SDS-PAGE后用抗賴 氨酸丁酰化的抗體的免疫印跡檢測核心組蛋白賴氨酸丁酰化的變化。為確認候選組蛋白賴 氨酸去丁酰化酶的體內活性，將含編碼候選組蛋白賴氨酸去丁酰化酶cDNA的質粒(野生型 及酶失活突變體)轉染至真核細胞中。轉染36小時后，細胞經裂解并SDS-PAGE后后用抗 賴氨酸丁酰化的抗體的免疫印跡檢測核心組蛋白賴氨酸丁酰化的變化，或將細胞固定后用 組蛋白位點特異性賴氨酸丁酰化的抗體進行免疫熒光分析。結果HDAC3和HDAC6是候選組蛋白賴氨酸去丙酰化酶與去丁酰化酶組蛋白賴氨酸乙酰化是一種可逆的翻譯后修飾，其修飾狀態與乙酰轉移酶(HATs) 和去乙酰化酶(HDACs)的動態調節作用的緊密聯系。考慮到賴氨酸乙酰化和賴氨酸丙酰化 及丁酰化的相似性，我們假設一些HDACs可能同樣行使去賴氨酸丙酰化和去賴氨酸丁酰酶 的作用。為檢驗這個假設，我們首先分析了組蛋白賴氨酸丙酰化和丁酰化是否會在加入 HDAC抑制劑的細胞中選擇性增強。以組蛋白丁酰化的變化為例，組蛋白丁酰化水平在加入 I、II及VI類HDACs抑制劑后大幅增加(TSA、NaBu、SAHA和；但III類HDAC抑制劑 的處理卻幾乎不對組蛋白丁酰化水平產生影響(Nicotinamide和sirtinol)(圖2A)。這 個結果暗示了 I、II和VI類HDACs可能是主要的組蛋白賴氨酸去丁酰化酶。為了篩選具體哪種I、II和VI類HDACs優先催化了組蛋白賴氨酸去丁酰化反 應，發明人開發了一種賴氨酸去乙酰化酶的篩選及酶活性測定的熒光強度檢測法(見具體實施方式
)。在本檢測中，將所有可能的I、II和VI類HDACs與合成的HDAC熒光 底物Boc-Lys (Buty) -AMC進行孵育(圖2B)，只有具備賴氨酸去丁酰化酶活性的HDACs 能夠將賴氨酸側鏈的丁酰基去除，隨后經胰酶裂解產生的AMC基團在熒光試劑作用下 激發出可檢測的熒光信號，同時熒光信號的強弱反應了酶活性的高低。該測試類似于 用Boc-Lys(Ac)-AMC檢測賴氨酸乙酰化的方法(23_24)。該檢測方法顯示所有低劑量的 HDCAs (2ng)對Boc-Lys (Buty) -AMC賴氨酸側鏈的丁酰基的去除幾乎沒有影響，然后當提高
7HDACs的劑量至200ng時，HDAC3和HDAC6顯示出有比其它HDACs高得多的活性將丁酰基團 Boc-Lys (Bu) -AMC中移除(圖2C)。上述結果暗示了 HDAC3和HDAC6是潛在的去丁酰化酶， 并體現出高的酶活性。HDAC3體外催化組蛋白賴氨酸去丁酰化為確認HDAC3體外賴氨酸去丁酰化酶活性，對合成的組蛋白H3和H4賴氨酸丁酰 化多肽進行了體外賴氨酸去丁酰化反應(H3多肽序列CSTGGK14ButyAPRK18ButirQLATK23ButyA ARK ；H4多肽序列CSGRGK5ButyGGK8ButirGLGK12ButyGGAK)，反應產物經質譜分析確定質量位移。 結果表明，在沒有HDAC3的催化作用下，合成多肽H3K14,18,23Buty和H4K5,8,12Buty的分子量分別 是2182Da和17^Da(圖3A和3D)；當在添加HDAC3后，合成多肽的肽譜峰有漸次丟失的 70Da質量差，這個質量差與多肽分別丟失1個、2個或3個丁酰基團相一致(圖和3E)。 然而，當HDAC3活性被TSA抑制后，合成多肽丟失的質量位移又被恢復(圖3C和3F)。隨后，發明人進一步檢測了重組HDAC3在體外對真核細胞中核心組蛋白的賴氨酸 去丁酰化能力。正如預期，HDAC3在體外顯著降低了組蛋白H3和H4的賴氨酸丁酰化水平， 而當HDAC3活性被TSA抑制后，組蛋白H3和H4的賴氨酸丁酰化水平恢復到正常水平(圖 3G)。這些體外實驗確認了 HDAC3是組蛋白賴氨酸去丁酰化酶。HDAC3是體內的組蛋白賴氨酸去丁酰化酶為檢測HDAC3是否為體內的組蛋白賴氨酸去丁酰化酶，我們在HeLa細胞中引入了 HDAC3劑量依賴的異位表達，然后通過免疫印跡檢測組蛋白賴氨酸丁酰化水平。結果表明， 組蛋白賴氨酸丁酰化隨著野生型HDAC3的過表達而降低(圖3A)，但HDAC3酶失活突變體 HDAC3 S424A的過表達卻不能引起組蛋白賴氨酸丁酰化水平的下降(圖;3B)。在細胞層次 上，和未轉染的細胞相比，體內過表達的HDAC3顯著降低了組蛋白H4K5的賴氨酸丁酰化，而 其酶失活突變體HDAC3 S424A的表達卻不能使H4K5去丁酰化(圖3C，箭頭所示)。由此確 認了 HDAC3是體內的組蛋白賴氨酸去丁酰化酶。HDAC6在體內和體外催化了組蛋白賴氨酸去丁酰化以B0c-Lys(Buty)-AMC為底物的熒光強度檢測顯示了具有顯著的賴氨酸去丁酰 化酶活性(圖2B)。為進一步確認HDAC6的作用，發明人隨后檢測了 HDAC6體外催化組蛋白 賴氨酸去丁酰化的能力。結果表明，重組的HDAC6顯著降低了組蛋白H3和H4的賴氨酸丁 酰化水平。然而，被TSA抑制了活性的HDAC6則組蛋白賴氨酸丁酰化水平無影響。此外，酶 失活突變的HDAC6 H216/611A無法催化組蛋白賴氨酸去丁酰化反應(圖4A)，暗示了組蛋白 賴氨酸去丁酰化需要HDAC6的酶活性。為檢測HDAC6的體內催化作用，發明人在細胞中引入了過表達的野生型及酶失活 突變體的HDAC6 H216/611A。結果表明野生型HDAC6的過表達促進了組蛋白賴氨酸的去丁 酰化(圖4B)，而HDAC6 H216/6 IlA則無此作用(圖4C)。HDAC6通常被認為是胞質的去乙酰化酶，但是該蛋白能夠動態穿梭于胞質和細 胞核中(26)。最近的研究表明HDAC6能與染色質相結合，標記不同的DNA片段β7)，暗示了了 HDAC6在細胞核中的功能。當利用核輸出抑制劑1印tomycine B處理細胞時，發明人觀察到 了 HDAC6被滯留在核中。所有這些結果增強了 HDAC6動態定位于細胞核，行使組蛋白賴氨 酸去丁酰化的可能。為確認核內HDAC6對組蛋白賴氨酸去丁酰化作用，在1印tomycin B處理或不處理下檢測了過表達的HDAC6及HDAC6H216/6IlA對組蛋白賴氨酸丁酰化的影響。單獨加入 Ieptomycin B，或單獨過表達HDAC6都產生明顯的組蛋白H3和H4賴氨酸去丁酰化。然而， Ieptomycin B處理和HDAC6過表達的協同作用能顯著降低組蛋白的賴氨酸丁酰化水平。反 之，HDAC6H216/611A與1印tomycin B基本沒有協同效應(圖4D)。通過檢測組蛋白H4特 異性位點的賴氨酸丁酰化水平，觀察到在leptomycine B作用下，過表達HDAC6能顯著降低 H4K5和H4K12 丁酰化水平(圖4E)。這個結果與用1印tomycin B作用于過表達HDAC6與 HDAC6 H216/611A細胞后，用抗組蛋白H4K5和H4K12 丁酰化的序列特異性抗體標記的免疫 熒光染色結果相一致(圖4F)。綜上所述，發明人確認了在細胞核中的HDAC6能夠在體內催 化組蛋白賴氨酸去丁酰化。參考文獻1.ffolffe, A. 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權利要求
1.一種用來檢測含有去丙酰化酶的樣品中去丙酰化酶活性的方法，其特征在于，所述 方法包括a.標記有可釋放信號物質的賴氨酸丙酰化底物多肽；b.賴氨酸去丙酰化酶；c.一種可將修飾性賴氨酸丙酰化多肽從對應的非修飾性多肽區別開來的檢測方法。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，可釋放信號物質是一種染料。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，染料為一種熒光物質，釋放的信號是熒光信號。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，可釋放信號物質可吸收紫外光，并能被高 效液相色譜的紫外檢測儀所檢測。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，檢測方法為質譜檢測。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，檢測方法為將修飾性賴氨酸丙酰化多肽 從對應的非修飾性多肽區別開來的色譜法檢測。
7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，色譜法檢測為高效液相色譜法檢測。
8.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，色譜儀為微流設備，包括但不限于微 流芯片O
9.根據權利要求1-8所述的任一檢測方法，其特征在于，當賴氨酸修飾為丁酰化而不 是丙酰化時，所述的檢測方法可用來篩選賴氨酸丁酰化酶/去丁酰化酶及酶活性的檢測。
全文摘要
本發明涉及一種賴氨酸去丙酰化酶及去丁酰化酶的篩選及活性測定方法，該方法的基本思路是底物的賴氨酸丙酰化或丁酰化修飾程度可通過底物對去催化酶的靈敏度反應出來。該方法具體包括a.標記有可釋放信號物質的賴氨酸丙酰化底物多肽；b.賴氨酸去丙酰化酶；c.一種可將修飾性賴氨酸丙酰化多肽從對應的非修飾性多肽區別開來的檢測方法。本發明方法不但能用于去修飾性酶的篩選和酶活性的測定，還可以篩查影響這些酶的活性的底物，進而可用于某些疾病的快速診斷中。
文檔編號G01N30/02GK102140494SQ20101010303
公開日2011年8月3日 申請日期2010年1月29日 優先權日2010年1月29日
發明者趙英明 申請人:趙英明