專利名稱：甲醛測定試劑(盒)及甲醛濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種甲醛測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定甲醛濃度的方法，屬
于食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
甲醛測定的測定方法主要有分光光度法、色譜法、電化學法、化學滴定法等
分光光度法測定的主要方法有乙酰丙酮法、鉻變酸法、MBTH法、付品紅法、AHMT法 等幾種。分光光度法的優點是操作簡便；缺點是靈敏度較低，有污染介質，對測定有干擾。
色譜法主要有氣相色譜、高效液相色譜法、離子色譜法等，直接利用色譜法較少， 一般是和其它分析儀器相連用，如GC-MS、HPLC-UV等。色譜法方法簡單、快速、直接，但是操 作繁瑣、試劑消耗量大、方法選擇性差等缺點。 電化學法包括示波極譜法、吸附伏安法和哥臘衍生試劑法，該法空氣中甲醛的靈 敏度和準確度都很高，適合于測定室內空氣中微量甲醛。 熒光分析法因具有快速、簡便、靈敏度高、重現性好等優點而受到人們廣泛的重
視，尤其是用于室內空氣環境中痕量甲醛的分析監測，其優點更為突出。化學發光分析法具
有靈敏度高，線性范圍寬，儀器設備簡單等優點。 化學滴定法主要包括電位滴定法、碘量法及酸堿滴定法。 綜合上述，沒有一個方法可以使用自動化儀器檢測甲醛的，酶法檢測甲醛的試劑， 酶法的優點是特異性高不受干擾、操作方便、成本低廉、可以大批量檢測，方法靈敏。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出 一 種利用酶倍增法(Enzymatic
DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法
(CoupleReaction)技術，計量/連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長
處吸光度的變化，得以測定甲醛濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的甲醛
測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進
行甲醛濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明甲醛濃度測定方法如下 甲醛+輔酶+水甲醛脫氡酶甲酶+還原型輔酶 甲酸+高鐵細胞色素甲酸脫氡酶二氧化碳+亞鐵細胞色素 二氧化碳+兒茶酚+輔酶+氯氯苯甲酸_1,2-加雙氧酶2-氯苯甲酸+還原型輔 酶+氧 這種方法應用甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase ;EC 1. 2. 1. 46)酶(偶) 聯甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase ;EC 1. 2. 2. 1 ;EC 1. 2. 2. 3)、氯苯甲酸_1， 2_加雙 氧酶(Chlorobenzoate 1， 2-dioxygenase ;EC 1. 14. 12. 13)酶促反應比色終點法。甲醛脫 氫酶酶解甲醛反應產生甲酸，再通過(偶)聯合甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-l，2-加雙氧酶的作用，最終二次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收 峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上 升的程度，可以測算甲醛的濃度大小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明甲醛測定試劑(盒)較為理想緩沖液100,1/L穩定劑500,1/L輔酶3mmol/L甲醛脫氫酶10000U/L甲酸脫氫酶12000U/L氯苯甲酸-1，2- 加雙氧酶12000U/L高鐵細胞色素7mmol/L兒茶酚7mmol/L氯化鎂9mmol/L本發明的甲醛領U定試劑(盒)可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1，2-加雙氧酶、高鐵 細胞色素、兒茶酚、氯化鎂。 試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l



緩沖液、穩定劑、輔酶、高鐵細胞色素、兒茶酚、氯化鎂。
試劑2
緩沖液、穩定劑、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2-加雙氧酶。 輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶、高鐵細胞色素、兒茶 酚、氯化鎂在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l
肆





緩沖液、穩定劑、輔酶、高鐵細胞色素、兒茶酚、氯化鎂。
試劑2
緩沖液、穩定劑、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶。 試劑3
緩沖液、穩定劑、甲醛脫氫酶。
輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶、高鐵細胞色素、兒茶 酚、氯化鎂在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定甲醛濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的甲醛測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500mmol/L 輔酶
甲醛脫氫酶 甲酸脫氫酶
氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶 高鐵細胞色素 兒茶酚










氯化,
:大
3mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L 7mmol/L 7mmol/L 9mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甲醛樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為
正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出甲醛的濃度大小。 實施例二 本實施例的甲醛測定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
高鐵細胞色素 7mmol/L
兒茶酚 7mmol/L
氯化鎂 9mmol/L
試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 甲醛脫氫酶 10000U/L 甲酸脫氫酶 12000U/L 氯苯甲酸-l，2-加雙氧酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甲醛樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢效 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出甲醛的濃度大小。
實施例三
本實施例的甲醛測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 輔酶
高鐵細胞色素 兒茶酚

















氯化鎂 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液
穩定劑
甲酸脫氫酶
氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩定劑 甲醛脫氫酶
IOO,I, 50mmol/L 3mmol/L 7mmol/L 7mmol/L 9mmol/L
100,1, 500,1/L 12000U/L 12000U/L
1
100,1/ 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定甲醛濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始
吸光度《0. 1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甲醛樣品與試劑1、試劑2、試劑3 的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測 時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出甲醛的濃度大小。 申請人:經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本發明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時間反應曲線應呈上 升曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達12mmol/L ;試劑測試的不準確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達O. 18±0. 09 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩定一年；——本發 明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
一種酶倍增法、酶比色法及酶聯法的甲醛的濃度測定方法，其方法如下甲醛+輔酶+水 甲醛脫氫酶 甲酸+還原型輔酶甲酸+高鐵細胞色素 甲酸脫氫酶 二氧化碳+亞鐵細胞色素二氧化碳+兒茶酚+輔酶+氯 氯苯甲酸-1，2-加雙氧酶 2-氯苯甲酸 +還原型輔酶+氧將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出甲醛的濃度大小測定結果。
2. —種甲醛測定試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。氯化鎂可以用其它氯鹽取代。
3. 根據權利要求2所述甲醛測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2-加雙氧酶、高鐵細 胞色素、兒茶酚、氯化鎂組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述甲醛測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2-加雙氧酶、高鐵細 胞色素、兒茶酚、氯化鎂組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶、高鐵細胞色素、兒 茶酚、氯化鎂組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2-加 雙氧酶組成。輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2-加雙氧酶、高鐵細胞色素、兒 茶酚、氯化鎂在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述甲醛測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶、高鐵細 胞色素、兒茶酚、氯化鎂組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶、高鐵細胞色素、兒 茶酚、氯化鎂組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶組成； 試劑3，由緩沖液、穩定劑、甲醛脫氫酶組成。輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1， 2_加雙氧酶、高鐵細胞色素、兒茶酚、氯化鎂在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述甲醛測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩定劑l-4000mmo1/ L或O. 1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙 二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。緩沖液 穩定劑 輔酶甲醛脫氫酶 甲酸脫氫酶氯苯甲酸_1，2-加雙氧酶 高鐵細胞色素兒茶酚 氯化鎂
全文摘要
本發明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯法技術的甲醛測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定甲醛濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、高鐵細胞色素、兒茶酚、氯化鎂、甲醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、氯苯甲酸-1，2-加雙氧酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出甲醛的濃度大小。
文檔編號G01N35/00GK101793781SQ200910028549
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優先權日2009年2月4日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司