專利名稱:一種結核分枝桿菌快速檢測系統及方法
技術領域:
本發明屬于醫學分子生物學檢測技術領域,具體是指一種利用細菌學培養 技術以及膠體金檢測方法來對結核病人臨床樣本進行快速檢測的系統和方法。
背景技術:
結核病是由結核桿菌引起的慢性傳染病,主要發生于肺部,給人類健康和
社會發展帶來嚴重后果。世界衛生組織(WHO)指出全球每年有900萬新結核病 例,每年約有350萬死于結核,占各種傳染病死亡人數68. 3%,是各種傳染病 死亡總和的一半以上。在結核病發病分布上,非洲、亞洲是高發地區,患病率 常在500-700 / 10萬,發病率100-200 / 10萬,死亡率20—70 / IO萬。我國結核 病疫情居高不下,其中嚴重的傳染性肺結核病人約135萬,每年約13萬人死于結 核病。西方發達國家結核病疫情以10—15%遞減,每5-7年可使疫情減少50%。 但是,近幾年由于全球人口增長、流動和難民增加,人類免疫缺陷病毒(HIV)感 染流行,造成結核病巻土重來。鑒于此,世界衛生組織(WH0)在1993年宣布"全 球結核病緊急狀態",致使結核病再次成為全球最緊迫的公共衛生問題。結核 病也成為我國重點防治的疾病之一。
傳統的結核分枝桿菌檢測方法主要是利用羅氏固體培養基斜面培養,4 8 周后,觀察斜面是否存在結核菌菌落。但是,這種方法的主要問題就是結核菌 在固體培養基上生長比較慢,不能及時得到檢測結果。為了縮短結核病樣本檢 驗時間,突破結核菌生長慢、檢測時間滯后的技術瓶頸,研發人員開發了一系 列以液體培養基為基礎的結核菌培養檢測系統。
液體培養基的主要優勢就是樣本在液體培養基中繁殖速度,極大的縮短培
養時間。但是,由于樣本在液體狀態下培養,很難觀察培養結果,這個問題也 是科研人員需要突破的技術瓶頸。針對這個問題目前已出現了能較好解決上述 問題的BACTEC 460TB自動檢測系統、BACTEC MGIT 960檢測系統和3D檢測系統,
但上述介紹的結核菌檢測系統,都存在幾個問題首先,檢測系統的準確性太 低,各個系統幾乎都是利用細菌學檢測方法檢測培養基顏色變化來表征樣本中 是否存在陽性樣本,最終得出檢測結果;其次,檢測系統還需要配備一系列的 檢測設備,檢測成本比較高。
發明內容
本發明的目的是提供一種結核分枝桿菌快速檢測方法,本發明克服了上述 背景技術中存在的問題,無需大型儀器設備,僅僅需要一臺普通細菌培養箱就 可以滿足檢測條件,在中小型結核菌控制檢驗實驗室就可以使用,大大降低了 成本且檢測特異性好、靈敏性高。
本發明的另一個目的是提供了一種快速且培養陽性率高的結核菌液體培養 基和結核分枝桿菌快速檢測的膠體金免疫層析檢測試劑條。
本發明的技術方案如下 一種結核分枝桿菌快速檢測系統,包括結核菌液 體培養基和結核分枝桿菌檢測試劑條,結核分枝桿菌檢測試劑條利用膠體金免
疫層析技術對結核分枝桿菌特異性抗原MPB64進行特異性檢測,該試劑條依次 由樣品墊、標記墊、延展墊、吸收墊組成樣品墊用于承接吸收樣本;標記墊 上含有膠體金標記的MPB64蛋白單克隆抗體,其制備過程如下取膠體金標記 MPB64蛋白單克隆抗體溶液,均勻含浸在標記墊上,然后將標記墊放入冷凍干燥 機上凍干過夜,至完全干燥制得;
延展墊上設有兩個條帶, 一條是檢測線T線,T線上固定MPB64蛋白另一單 克隆抗體,其制備過程如下將MPB64蛋白另一單克隆抗體用0.01M PBS稀釋 成濃度為2. 5±0. lmg/ml的抗體溶液,用點膜儀以1 u 1 /era的量噴于延展墊上 形成T線; 一條是控制線C線,C線上固定有免疫球蛋白多克隆抗體,其制備過 程如下將免疫球蛋白多克隆抗體用0.01M PBS稀釋成濃度為2±0. lmg/ml的 抗體溶液,和T線間隔為0.8cm的位置,用點膜儀以lu 1 /cm的量將抗體溶液 噴于延展墊上,形成C線,最后將設有T線和C線的延展墊置37t:烤箱中干燥 30min,充分干燥制得;
吸收墊用于拉動液體樣本通過整個試劑條完成檢測反應;上述樣品墊、標
記墊、延展墊、吸收墊依次設在底板上。
本發明的結核分枝桿菌快速檢測系統的結核菌液體培養基以Middle brook 7H9肉湯培養基為基礎成分,經高壓滅菌冷卻后,添加小牛血清白蛋白、生物素、 過氧化氫酶以及維生素B6,上述各個成分在液體培養基中的終濃度是小牛血 清白蛋白1-20 g/L;生物素0.01-1 mg/L;過氧化氫酶1-10 mg/L;維生素 B6 0.01-1 mg/L。
本發明的結核分枝桿菌快速檢測系統的結核菌液體培養基中小牛血清白蛋 白、生物素、過氧化氫酶以及維生素B6在液體培養基中的終濃度是小牛血清 白蛋白濃度2-10 g/L;生物素濃度0. 1-0. 5 mg/L;過氧化氫酶濃度2-5 mg/L; 維生素B6濃度0. 05-0. 3 mg/L。
本發明的結核分枝桿菌快速檢測系統的結核菌液體培養基中還添加有多粘 菌素B、萘啶酸、阿莫西林的一種或多種,培養基中的濃度是多粘菌素B濃度 0. 1-100 U/mL;萘啶酸0. 1-50濃度mg/mL;阿莫西林濃度0. 1-20 mg/mL。
本發明的結核分枝桿菌快速檢測系統中添加的多粘菌素B、萘啶酸、阿莫西 林在培養基中的濃度是多粘菌素B濃度20-60 U/mL;萘啶酸濃度10-30 mg/mL; 阿莫西林濃度1-10 mg/mL。
本發明的結核分枝桿菌快速檢測系統的延展墊采用硝酸纖維膜材料制成。
本發明的結核分枝桿菌快速檢測系統的檢測方法如下第一步樣本處理; 第二步結核菌液體培養基中培養接種后的液體培養基,放入到5%-10%C02 的培養箱中,35t:-38'C培養;第三步試劑條檢測樣本在液體培養基中培養
7-14天,吸取適量培養液,添加到試劑條的樣品墊上,試劑條室溫水平放置, 10min-15min讀出檢測結果。
本發明的結核分枝桿菌快速檢測系統的檢測方法中一個樣本利用2 3個試 劑條同時檢測。
本發明具有如下優點該系統突破了結核菌樣本中含量低,培養基培養生 長慢,細菌學檢測特異性、靈敏性不高的技術瓶頸;結合了菌體在液體培養基
中生長速率快,免疫學檢測特異性、靈敏性高的優勢,能夠快速、準確地檢測 出樣本中的結核分枝桿菌。
圖1是本發明的結核分枝桿菌快速檢測系統的試劑條結構示意圖; 圖2是本發明檢測過程中培養液在試劑條中的流向示意圖; 圖3是本發明的結核分枝桿菌快速檢測系統的檢測過程流程圖。
具體實施例方式
下面結合具體的實施例對本發明的結核分枝桿菌快速檢測系統及方法作進 一步的描述。
液體培養基是結核分枝桿菌快速檢測系統的重要組成部分,主要目的是為
結核病臨床樣本中的結核菌繁殖提供豐富的營養物質,快速培養、富集結核菌, 為膠體金免疫層析試劑條對樣本定性檢測提供樣本。
液體培養基是以Middle brook 7H9肉湯培養基為基礎。其中,Middle brook 7H9肉湯培養基主要含有氨基酸、檸檬酸以及鎂離子、納離子、鉀離子等成分, 為結核菌的生長提供基本的營養物質以及穩定的PH生長環境;
為了促進結核菌在液體培養基中快速生長,Middle brook 7H9肉湯培養基 添加小牛血清復合物。小牛血清復合物的主要含有小牛血清白蛋白、生物素、 過氧化氫酶以及維生素B6;
考慮到結核病人樣本中結核菌在樣本中含量比較低,雜菌比較多,液體培 養基中營養物質豐富,并且,結核菌本身的特性就是生長速度非常慢,在短時 間繁殖很難與雜菌競爭營養物質,所以,我們針對結核病樣本中出現比較多的 雜菌開發了一種抑菌劑復合物,選擇性的抑制樣本中的雜菌在液體培養基中的 生長,為結核菌的生長減少壓力。
本發明結核分枝桿菌快速檢測系統中的結核分枝桿菌檢測試劑條是利用膠 體金免疫層析技術中的雙抗體夾心方法,對結核分枝桿菌分泌的MPB64蛋白進
行檢測。MPB64蛋白是人結核分枝桿菌特異性產出的細胞外分泌蛋白,MPB64 蛋白分泌最多,并且,MPB64在比較短的時間內大量分泌,所以,MPB64蛋白 在結核分枝桿菌快速檢測作為檢測目標分子提供有利的依據。在膠體金標記檢 測試劑條中,標記墊上的膠體金標記MPB64蛋白單克隆抗體與延展墊T線上固 定MPB64蛋白另一單克隆抗體,對MPB64蛋白進行特異性檢測。
實施例
一、首先制備需要用來檢測的試劑條,試劑條的結構如圖l和2所示,依 次由樣品墊8,標記墊6,延展墊4和吸收墊2組成,其制備過程如下
① 、膠體金的制備
本發明試劑條用抗體標記的膠體金顆粒是采用氯金酸化學還原法制備。先 將lOOmlO. 01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰,迅速加入1. 3ml 1%檸檬酸三鈉溶液, 加熱至出現紅色后繼續煮沸7 10min。最后將體積定容至100ml,室溫放置冷 卻,就得到lOOmL膠體金溶液。
② 、膠體金一抗體結合物制備
a、 取膠體金顆粒溶液100ml,在磁力攪拌器攪拌的狀態下,用0.2M K2C03 溶液調解膠體金顆粒溶液的pH值至8. 2。
b、 利用0. 01M PBS溶液將標記用MPB64蛋白單克隆抗體5稀釋成lmg/ml 抗體溶液。取5支試管各加入lml膠體金溶液,分別在前4管中加入30 u 1、 40 II 1、 45 ul、 50ul待標記抗體,最后一管作為對照,混勻均勻后,室溫放置 5min。然后,前4管中各加入100ul濃度為10X的NaCl溶液。混勻后室溫放 置10min,和對照管對比,以沒有變藍色的一管所加入的抗體量作為最佳抗體標 記使用量。
c、 根據體積和標記使用量計算標記所需抗體的量,將lmg/ml的單克隆抗 體緩慢加入膠體金溶液中,室溫下攪拌20min。
d、 加10XBSA溶液,至終濃度為1%,室溫攪拌5min。
e、 7000rpm/min離心25min,小心吸去上清,用120mL膠體金保存液懸浮
沉淀,從而得到120mL膠體金標記MPB64蛋白單克隆抗體5。
③ 、標記墊6的處理
先將15mmX 300mm的玻璃纖維膜擺放在不銹鋼盤上,取90mL敗體金標記 MPB64蛋白單克隆抗體溶液,均勻含浸在玻璃纖維膜上,然后將不銹鋼盤放入冷 凍干燥機上凍干過夜,至完全干燥制得標記墊6。
④ 、延展墊4上固定檢測用抗體
選用硝酸纖維膜作為延展墊4的材料,檢測用抗體固定在硝酸纖維膜上, 具體操作如下
a、 T線ll抗體的固定
將MPB64蛋白另一單克隆抗體3用0. 01M PBS稀釋成濃度為2. 5±0. lmg/ml 的抗體溶液,用點膜儀以lu 1/cm的量噴于硝酸纖維膜上,形成T線ll,即檢 測線。
b、 C線10抗體的固定
將免疫球蛋白多克隆抗體1用0. 01M PBS稀釋成濃度為2±0. lmg/ml的抗 體溶液。和T線11間隔為0. 8cm的位置,用點膜儀以1 " 1 /cm的量將抗體溶 液噴于硝酸纖維膜上,形成C線IO,即控制線。
c、 把固定有抗體的硝酸纖維膜置37'C烤箱中干燥30min,充分干燥制得延 展墊4。
、組裝
a、 在PVC底板12中間位置粘貼處理后的延展墊4。
b、 在PVC底板12上固定延展墊4位置的頂端,粘附吸收墊2,底端粘附標 記墊6。吸收墊2和標記墊6 —般要覆蓋延展墊4邊沿約2mm左右。
c、 標記墊6下方粘附樣品墊8,樣品墊8覆蓋膠體金墊約2ram。
d、 組裝后的試紙用切割機切成0. 5cm寬的試劑條待用。 在實際使用中, 一般試劑條是預先制備好的成品,可直接取出使用,不需
要現場新鮮制備。
二、結核菌液體培養基的制備-
① 、配置小牛血清復合物,其配制過程如下
配制100mL小牛血清復合物,按照各成分濃度小牛血清白蛋白8.0g/L、生 物素0. 3mg/L,過氧化氫酶3. 0 mg/L、維生素B6 0. 12mg/L配制;
先量取100mL純化水,倒入燒杯中,然后稱取0.8g小牛血清白蛋白、生物 素0.03mg、過氧化氫酶0.3 mg、維生素B6 0. 012mg,依次加入純化水中。利用 攪拌器攪拌20min,使小牛血清復合物各個成分充分溶解。
小牛血清復合物充分溶解后,在無菌環境下,利用0.22um的濾膜,過濾除 菌。過濾好的小牛血清復合物進行無菌檢驗,無菌檢驗合格后,方可使用。然 后配制500mL液體培養基
② 、配制450mL Middle brook 7H9肉湯培養基
稱取2. 36gMiddle brook 7H9肉湯培養基干粉,加入450mL純化水,電爐 加熱使之完全溶解。然后,利用高壓滅菌鍋12rC高壓滅菌20min。
③ 、添加小牛血清復合物
高壓滅菌后的450mL Middle brook 7H9肉湯培養基,放置室溫冷卻,待培 養基冷卻到45。C左右,在無菌條件下,添加上述配置好的50mL小牛血清復合物, 混合均勻。
④ 、添加抑菌劑復合物
抑菌劑復合物按照在培養基中的終濃度是多粘菌素B 35U/mL、萘啶酸 20mg/mL、阿莫西林8. 5mg/mL分別先利用一定量的預溶劑溶解,再添加到液體培 養基屮,混合均勻。將上述配置好的液體培養基放置備用。
三、結核分枝桿菌快速檢測系統檢測過程
整個檢測操作建議在生物安全級別3級以上的實驗室中操作,其過程如圖3 所示
第一步痰液堿處理
首先,進行痰液消化,將采集的咳痰加入2倍量的4%氫氧化鈉溶液,充分
混勻,在常溫下靜置15分鐘,然后,在"消化液"中添加10倍量的pH值為6. 8 的無菌磷酸緩沖液,混勻后,在3000Xg離心20分鐘,最后,取lmL沉淀物利 用等量的無菌緩沖液懸浮,取0.5 mL接種到制備好的液體培養基中。 第二步液體培養基中培養
接種后的液體培養基,放入到5y。C02的培養箱中,36士rC培養,每天觀察 樣本培養狀態;
第三步試劑條檢測
樣本在液體培養基中培養到變渾濁或者培養到7天時,吸取lOOuL培養液, 添加到試劑條的樣品墊8上,在室溫條件下,水平放置15min。如圖2所示,由 于毛細管層析的作用,促使液體在試劑條上按照液流方向9移動。當培養液流 到標記墊6,膠體金標記的MPB64蛋白單克隆抗體5溶出,和樣本中的抗原MPB64 7形成含有金顆粒標記的免疫復合休。免疫復合體再通過層析作用移動到延展墊 4, T線11固定的MPB64蛋白另一單克隆抗體3特異性捕獲含有膠體金顆粒的免 疫復合體,含有金顆粒的免疫復合體不斷在T線11聚集,形成一條肉眼可以看 見的紫紅色條帶。由于層析作用,樣本液體在延展墊4上繼續向試劑條的另外 一端流動,當流動到C線10的位置,C線10固定的免疫球蛋白多克隆抗體非特 異性捕獲T線11反應剩余的金顆粒標記免疫復合體或膠體金標記的抗MPB64蛋 白單克隆抗體5,在C線10的位置形成肉眼可以觀察到的紫紅色條帶。
最后通過判斷試劑條上出現的檢測線的有無,來定性判決結果。當檢測后, 若出現C線10,則表示試劑條檢測功能正常,若僅僅出現C線10,表示樣本是 陰性;若C線lO和T線ll同時出現,表示樣本是陽性。
一般一個樣本,為了檢測結果的重復性,可利用2 3個試劑條同時檢測。
本系統兼容性好,在實際檢測中對結核病臨床樣本要求不是很嚴格,大部 分樣本均可以檢測,例如血液、血清、尿液、腦脊液、胸膜液以及機體組織。
不局限與上述實施例中的痰液樣本。只是不同的樣本處理方法不同痰液樣本 一般利用NALC-Na0H堿處理,當然也可以利用胰酶消化的方法;血液、血清、 尿液、腦脊液或胸膜液則可以直接接種液體培養基中培養。
權利要求
1、一種結核分枝桿菌快速檢測系統,包括結核菌液體培養基和結核分枝桿菌檢測試劑條,其特征在于結核分枝桿菌檢測試劑條利用膠體金免疫層析技術對結核分枝桿菌特異性抗原MPB64進行特異性檢測,該試劑條依次由樣品墊、標記墊、延展墊、吸收墊組成樣品墊用于承接吸收樣本;標記墊上含有膠體金標記的MPB64蛋白單克隆抗體,其制備過程如下取膠體金標記MPB64蛋白單克隆抗體溶液,均勻含浸在標記墊上,然后將標記墊放入冷凍干燥機上凍干過夜,至完全干燥制得;延展墊上設有兩個條帶,一條是檢測線T線,T線上固定MPB64蛋白另一單克隆抗體,其制備過程如下將MPB64蛋白另一單克隆抗體用0.01M PBS稀釋成濃度為2.5±0.1mg/ml的抗體溶液,用點膜儀以1μl/cm的量噴于延展墊上形成T線;一條是控制線C線,C線上固定有免疫球蛋白多克隆抗體,其制備過程如下將免疫球蛋白多克隆抗體用0.01M PBS稀釋成濃度為2±0.1mg/ml的抗體溶液,和T線間隔為0.8cm的位置,用點膜儀以1μl/cm的量將抗體溶液噴于延展墊上,形成C線,最后將設有T線和C線的延展墊置37℃烤箱中干燥30min,充分干燥制得;吸收墊用于拉動液體樣本通過整個試劑條完成檢測反應;上述樣品墊、標記墊、延展墊、吸收墊依次設在底板上。
2、 如權利要求1所述的結核分枝桿菌快速檢測系統,其特征在于所述的 結核菌液體培養基以Middle brook 7H9肉湯培養基為基礎成分,經高壓滅菌冷 卻后,添加小牛血清白蛋白、生物素、過氧化氫酶以及維生素B6,上述各個成分 在液體培養基中的終濃度是小牛血清白蛋白1-20 g/L;生物素0.01-1 mg/L; 過氧化氫酶1-10 mg/L;維生素B6 0. 01-1 mg/L。
3、 如權利要求2所述的結核分枝桿菌快速檢測系統,其特征在于所述的結核菌液體培養基中小牛血清白蛋白、生物素、過氧化氫酶以及維生素B6在液體 培養基中的終濃度是小牛血清白蛋白濃度2-10 g/L;生物素濃度O. 1-0.5 mg/L;過氧化氫酶濃度2-5 mg/L;維生素B6濃度0. 05-0. 3 mg/L。
4、 如權利要求2或3所述的結核分枝桿菌快速檢測系統,其特征在于結核 菌液體培養基中還添加有多粘菌素B、萘啶酸、阿莫西林的一種或多種,培養基 中的濃度是多粘菌素B濃度0. 1-100 U/mL;萘啶酸0. 1-50濃度mg/mL;阿莫西林濃度0. 1-20 mg/mL。
5、 如權利要求4所述的結核分枝桿菌快速檢測系統,其特征在于添加的 多粘菌素B、萘啶酸、阿莫西林在培養基中的濃度是多粘菌素B濃度20-60 U/mL; 萘啶酸濃度10-30 mg/mL;阿莫西林濃度1-10 mg/mL。
6、 如權利要求1所述的結核分枝桿菌快速檢測系統,其特征在于延展墊 采用硝酸纖維膜材料制成。
7、 利用權利要求1或2所述的結核分枝桿菌快速檢測系統的檢測方法如下第一步樣本處理;第二步結核菌液體培養基中培養接種后的液體培養基, 放入到5%-10%CO2的培養箱中,35。C-38。C培養;第三步試劑條檢測祥本在 液體培養基中培養7-14天,吸取適量培養液,添加到試劑條的樣品墊上,試劑 條室溫水平放置,10min-15min讀出檢測結果。
8、 如權利要求7所述的結核分枝桿菌快速檢測系統的檢測方法如下,其特 征在于 一個樣本利用2 3個試劑條同時檢測。
全文摘要
本發明屬于醫學分子生物學檢測技術領域,具體涉及一種結核分枝桿菌快速檢測系統,包括結核菌液體培養基和結核分枝桿菌檢測試劑條,結核分枝桿菌檢測試劑條利用膠體金免疫層析技術對結核分枝桿菌特異性抗原MPB64進行特異性檢測,該試劑條依次由樣品墊、標記墊、延展墊、吸收墊組成。同時還公開了一種利用上述系統的檢測方法,具體步驟如下第一步樣本處理;第二步接種后的液體培養基,放入到5%-10%CO2的培養箱中,35℃-38℃培養;第三步樣本在液體培養基中培養7-14天,添加到試劑條的樣品墊上10min-15min讀出檢測結果。本發明具有成本低且檢測特異性好、靈敏性高的優點。
文檔編號G01N33/558GK101382549SQ200810161998
公開日2009年3月11日 申請日期2008年9月24日 優先權日2008年9月24日
發明者于明東, 伍傳麗, 馮艷飛, 瑭 唐, 朱芳宏, 陳功祥 申請人:杭州創新生物檢控技術有限公司