專利名稱：：一種結核病診斷試劑及試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明屬診斷試劑領域，涉及結核病診斷試劑及試劑盒，具體涉及含結核分支桿菌Rvl985c蛋白的診斷試劑及試劑盒。
背景技術：
：結核病是當今全球面臨的主要公共健康問題之一，它的病原體是結核分枝桿菌，屬分枝桿菌屬。據報道，全世界每年約有800-1000萬新發結核病例，每年有200-300萬人因此而失去生命。結核病已成為引起成年人死亡的頭號傳染病。據WHO報道，全球三分之一的人口(約20億)已感染了結核桿菌，如不采取措施，近10年內還將有約3億人受結核桿菌感染。據第四次全國流行病學調查顯示，我國受結核桿菌感染人數超過4億，每年有13萬人死于結核病，是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病人數位居世界第二。特異性抗原診斷一直是確認病原體感染及評估感染狀況較為可靠的方法，且有早期診斷價值，已經在HBV、HCV、HIV等疾病的診斷方面獲得了廣泛的應用。目前，臨床結核病診斷廣泛使用皮膚檢測試劑結核分枝桿菌純蛋白衍生物(PPD)。然而，結核分枝桿菌純蛋白衍生物存在與環境分枝桿菌以及結核病疫苗即卡介苗(M.bovisBCG)菌株的交叉反應，其診斷價值被削弱。而血清學檢測具有快速、特異、簡便和廉價等特點，因此，研制出安全簡便的特異性血清學診斷試劑極為迫切。
發明內容本發明的目的是提供一種新型的結核病診斷試劑，具體涉及含結核分支桿菌Rvl985c蛋白的診斷試劑。本發明公開了一種基于血清學方法的結核桿菌檢測抗原Rvl985c蛋白。該來自于卡介苗基因組相對結核分枝桿菌缺失的區域(RD2區)，由結核分枝桿菌基因Rvl985c所編碼的蛋白。結核桿菌Rvl985c蛋白包含303個氨基酸，分子量32.8kDa，等電點pl為9.05。該蛋白具有序列1的氨基酸序列。所述的Rvl985c蛋白可由結核分枝桿菌或其它少數幾種分枝桿菌表達，該抗原感染人體后或經結核桿菌感染后，能被Th細胞所識別，刺激合成B細胞生長和分化因子。在Rvl985c抗原和B細胞分化因子的共同作用下B細胞活化和增值，并最終在淋巴器官的T細胞區中分化成為漿細胞，并產生針對該抗原的抗體，該抗體能夠特異地與Rvl985c蛋白發生免疫反應。通常抗體存在于體液或其它介質中，包括痰液、血清、尿液、腦髓液、肺泡灌洗液、胸腔積液等。抗體生物學實質是一類免疫球蛋白，主要分為IgG，IgM，IgA，IgD，IgE五類，其中具有診斷價值的主要是IgG和IgM。所述的Rvl985c蛋白能制成診斷試劑用于結核病的免疫反應檢測。本發明所涉及的可用于檢測的免疫反應包括凝集實驗，沉淀實驗，免疫熒光實驗，小吞噬實驗，E花環實驗，ELISA實驗，斑點免疫金滲濾實驗，膠體金免疫層析法等。典型診斷用免疫試驗是酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)，由于大多數蛋白都可與塑料或聚酯板非特異性結合，可通過將含抗體的待測樣品與包被Rvl985c抗原的塑料板相互作用，形成的抗原抗體復合物與酶聯的第二抗體進行反應，洗去未結合的酶標抗體，加入底物后產生帶有顏色的產物，在檢測儀上測得增加的光吸收值。本發明上下文中所述蛋白除了通常所指的一種氨基酸聚合物，還應該包括其類似物。所述類似物，是指其特性與所述蛋白相同，包括其同樣可以與抗體特異性地結合。通常包含一部分蛋白序列，代表性的是所述類似物具有相同的形狀、大小、柔韌性、電子排布等。上述抗原的典型類似物是肽。它可與上述蛋白序列同源。這種同源肽通常具有至少75%的同源性，優選至少90%、95%的同源性。其不同一般來自于氨基酸殘基的替換、插入、缺失和修飾，可發生在序列的N端、C端或其他任何位置上。具有代表性的是類似物可以結合到相同的抗體分子上，且類似物中處于等價位置上的氨基酸與原始肽中的那些抗原序列相同或保守。所述的修飾，通常指的是天然的轉錄后修飾或人工修飾。修飾可提供化學部分的改變，包括氨基、乙酰基、羥基、鹵素基團和碳水化合物基團。具有代表性的是一種是氨基酸側鏈的修飾，即形成一個或多個非天然氨基酸。所述的蛋白和多肽可以通過天然分離獲得，也可以通過人工合成。一種具有代表性的方法是用較長的融合蛋白制備上述肽段，此融合蛋白包含上述代表性的肽段序列。所述肽也可由多肽經過物理或化學裂解所產生。此外，本說明書中涉及所有氨基酸序列都是從N端到C端的。本發明的另一重要目的是提供一種快速檢測結核感染的方法，主要包括以下步驟a)使用Rvl985c抗原包被96孔板或其他吸附蛋白介質；b)采集待測樣品，通常是受試者的血清，稀釋一定倍數；c)將稀釋后樣品加入介質中與Rvl985c反應；d)加入酶聯或膠體金等染料偶聯試劑，該試劑能與Rvl985c抗原抗體復合物特異反應。典型的試劑如酶聯Rvl985c多肽，ProteinA，抗IgG、IgM二抗等；e)直接顯色或加入顯色劑顯色；f)肉眼或儀器讀取顏色的改變，以超過一定域值的顏色改變判定為陽性檢測。具體可參照實施方案1和2。值得注意的是，該方法至少使用Rvl985c—種抗原用于檢測相應抗體，但不局限于該種抗原。與其他有較高診斷價值的結核抗原，如LAM，38kDa，30kDa,16KDa，A60等抗原一起使用，可以提高檢測的陽性檢出率。實施例1中，聯合使用LAM和38KDa抗原，可使陽性檢測率從59%提高到75%，同時檢測保持很高的特異性。本發明的再一個目的是提供一種快速檢測結核病的診斷試劑盒。它包含上述重組蛋白Rvl985c和Rvl985c抗體的陽性對照試劑，這類試劑可以是含Rvl985c陽性抗體的動物血清或通過雜交瘤細胞培育出的Rvl985c單克隆抗體。如待測者體液中抗體的滴度超過了陽性對照試劑，則判定為陽性。本發明的試劑盒中，除了有重組抗原Rvl985c和其特異性抗體外，還應有用于檢測的各種試劑和器具，包括各種緩沖液、稀釋液、反應液和終止液。在本發明的一個實施例中，結核檢測試劑盒還包括如下試劑和物品1)包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液)，pH9.6:1.59gNa2C03，2.93gNaHC(k2)洗滌液(PBST),pH7.4:8gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2P04，2.9gNa2HP0412H20，0.5mlTween-20，1LH20。3)封閉液(0.1%BSA/PBS)，pH7.4:8gNaCl，0.2gKC1，0.2gKH2P04，2.9gNa2HP0,12H20，0.lgBSA(牛血清白蛋白)，1LH20。4)底物緩沖液，0.2MNaH2P04(28.4克/L)25.7ml，0.1M檸檬酸(19.2克/L)24.3ml，加蒸餾水50ml。55)顯色液20ml底物緩沖液，8mg0PD，25ul30%H202。6)終止液(2MH2S04),200ml:21.32mlH2S04，178.68mlH20。7)過氧化物酶標記山羊抗人IgG和IgM。8)96孔酶標板(NalgeNuncInternational)本發明提供了特異性和敏感性俱佳的結核快速檢測試劑，可對受試者血液或體液作出是否感染結核分支桿菌的快速診斷，從免疫膠體金的15分鐘到ELISA的5個小時不等。作為診斷試劑用于被臨床證實的活動性結核時，單獨使用Rvl985c抗原檢測敏感性達到59%，特異性96%;與其他診斷抗原(如與對照抗原LAM/38kDa)合并使用使，可進一步提高診斷敏感性，達75%，具有較高臨床應用價值。本發明的檢測只需要單份血清樣品，化驗簡單、快速、不需要專業實驗室設備，成本低廉，當天可得到結果，非常適合廣大鄉鎮農村醫院和戰地條件下的結核感染檢測。圖1是1985c抗原ELISA檢測結果。具體實施例方式實施例1制備結核檢測試劑及試劑盒本發明的試劑盒中，含有重組抗原Rvl985c和其特異性抗體，還含有用于檢測的各種試劑和器具，包括各種緩沖液、稀釋液、反應液和終止液，具體包括如下試劑和物a1)包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液)，pH9.6:1.59gNa2C03，2.93gNa線.2)洗滌液(PBST)，pH7.4:8gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2P04，2.9gNa異12H20，0.5mlTween-20，1LH20。3)封閉液(0.1%BSA/PBS)，pH7.4:8gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2P04，2.9gNa2HP0412H20,0.lgBSA(牛血清白蛋白)，1LH20。4)底物緩沖液，0.2MNaH2P04(28.4克/L)25.7ml，0.1M檸檬酸(19.2克/L)24.3ml，加蒸餾水50ml。5)顯色液20ml底物緩沖液，8mg0PD，25ul30%HA。6)終止液(2MH2S04),200ml:21.32mlH2S04，178.68mlH20。7)過氧化物酶標記山羊抗人IgG和IgM。8)96孑L酶標板(NsilgeNuncInternational)實施例2ELISA實驗檢測肺結核檢測的樣本為血清，采集全血加入2.0mg/ml的EDTA抗凝劑后，離心3000rpm，10min后，收集上清部分。保存時可以分裝入凍存管存放入-70度冰箱。此實施例樣本分為兩組肺結核患者和健康者對照。肺結核患者是從2007年5月起在濟南的山東省肺科醫院、重慶的肺科醫院組織招募的。健康對照者一部分來源于上述醫院(非結核病患者或醫務人員)，另一部分是2008年4月在復旦大學、上海華山醫院組織招募的非結核病患者或醫務人員。兩組人群的收錄標準如下肺結核患者臨床痰涂片或結核分枝桿菌培養陽性，臨床檢査與X射線檢查結果相符，HIV檢測陰性。健康者接種過BCG疫苗，無發熱，近期無結核病人接觸史的健康人群。HIV檢測陰性。表1是樣本統計資料。表l肺結核病人(p)健康對照(H)人數14668所在城市重慶(126)濟南(20)上海(31)濟南(37)年齡分布15752062檢測步驟(1)包被Rvl985c抗原溶解于包被緩沖液中(5ug/ml);100ul/孔;4。C過夜(2)洗板洗漆液300ul/孔，3min，洗3次；(3)封閉封閉液，300ul/孔，37°C孵育lh;(4)洗板洗滌液300ul/孔，3min，洗3次；(5)加血清按IgG1:500，IgMl:100稀釋后的待測血清,100ul/孔，3TC孵育lh;7(6)洗板洗漆液300ul/孔，3min，洗5次；(7)加酶標二抗新鮮稀釋的酶標抗體(1:10000)100ul/孔，37°C孵育lh;(8)洗板洗滌液300ul/孔，3min，洗5次；(9)顯色新鮮配置的顯色液，100ul/孔，37°C5-10min(10)終止2MH2S04，50ul/孔;(11)測定酶標儀調至492nm，以第一個空白PBS對照孔調零后測各孔OD值。統計和判定以健康對照者血清標本的平均OD值加上2倍標準方差(standarddeviationSD)作為判斷標準，若病人血清標本OD值大于此標準，即判斷為陽性，反之則為陰性。利用SPSS(StatisticsPackageforSocialScience)對結核病人和健康對照者兩組之間進行統計分析，采用非配對分組t-檢驗(ind印endentgroupt-test)進行組別間差別的顯著性測定，若P〈0.05，為樣品間存在顯著性差異；若P〈0.01，為樣品間存在極顯著性差異。PathozymeMycoG對照實驗-所述的PathozymeMycoG是英國OmegaDiagnostics公司生產的檢測人血清中由于分枝桿菌感染而產生IgG抗體的試劑。MycoG應用有較高診斷價值的LAM和38KDa抗原，其檢測特異性極高，敏感性較好，已被國際上部分機構和醫院所采用。按照標準說明書操作流程，對上述結核病人和健康對照者214例樣本進行檢測。結果顯示，Rvl985c在肺結核病人中的血清IgG敏感性為49%(71/146人)，特異性為97%(2/68人)，對病人和健康對照的陽性檢出率進行t檢驗，t〈0.001，有極顯著差異；Rvl985c在肺結核病人中的血清IgM敏感性為20%(29/145人)，特異性為97%(2/68人)，對病人和健康對照的陽性檢出率進行t檢驗，t=0.001，表明肺結核病人與健康人群Rvl985c抗體IgG和IgM水平均有顯著性差異，即結核病人顯著高于健康人。聯合IgG和IgM考慮，本方法檢測結核病人的敏感性為59%(85/145人)，特異性為96%(3/68人)。對照方法PathozymeMycoG檢測的敏感性為35%(51/146人)，特異性為98.5%(1/68人)。與對照方法相比，本方法具有更高的檢測敏感性，能多檢出14%的陽性患者，同時特異性與對照方法相當，都大于95%。如與對照抗原LAM/38kDa一同使用，可進一步提高檢測敏感性，達到75%(109/146)，同時特異性仍然保持較高94%(4/68)。表2是抗原Rvl985c抗原在結核患者中的檢測結果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例3膠體金標記檢測1.取0.01%HAuC14水溶液lOOml，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min30min，直至顏色變紅且不變。2.將Rvl985c抗原與制備好的膠金以1:2比例混合，加入終濃度為1%的BSA作為穩定劑，加入終濃度為0.1%的疊氮鈉作為防腐劑。3.于硝酸纖維膜上加入Rvl985c抗原10ul，放置過夜。4.第二天加入封閉液(iy。BSA溶液)5min5.加入稀釋后待測血清，可采用1:10稀釋6.PBS洗一遍后加入上述標記好膠體金抗原7.反應5-15分鐘后判讀結果，經肉眼觀察，如有紅色條帶即判定為陽性，否則為陰性。結果顯示，15分鐘可判定結果，作為診斷試劑用于被臨床證實的活動性結核時，單獨使用Rvl985c抗原檢測敏感性達到59%，特異性96%;與其他診斷抗原(如與對照抗原LAM/38kDa)合并使用使，可進一步提高診斷敏感性，達75%。由結核分枝桿菌基因Rv1985c所編碼的蛋白序列表SEQUENCELISTING<110〉復旦大學附屬華山醫院，復旦大學<120〉一種結核病診斷試劑及試劑盒<130〉11<160〉1<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉303<212〉PRT<213>結核桿菌<400〉1MetValAspProGinLeuAspGlyProGinLeuAlaAlaLeuAlaAla151015ValValGluLeuGlySerPheAspAlaAlaAlaGluArgLeuHisVal202530ThrProSerAlaValSerGinArglieLysSerLeuGluGinGinVal354045GlyGinValLeuValValArgGluLysProCysArgAlaThrThrAla505560GlylieProLeuLeuArgLeuAlaAlaGinThrAlaLeuLeuGluSer65707580GluAlaLeuAlaGluMetGlyGlyAsnAlaSerLeuLysArgThrArg859095lieThrlieAlaValAsnAlaAspSerMetAlaThrTrpPheSerAla100105110ValPheAspGlyLeuGlyAspValLeuLeuAspValArglieGluAsp115120125GinAspHisSerAlaArgLeuLeuArgGluGlyValAlaMetGlyAla130135140ValThrThrGluArgAsnProValProGlyCysArgValHisProLeu0GlyGluMetArgTyrLeuProValAlaSerArgProPheValGinArg由結核分枝桿菌基因Rv1985c所編碼的蛋白序列表HisLeuSerAspGlyPheThrAlaAlaAlaAlaAlaLysAlaProSer180185190LeuAlaTrpAsnArgAspAspGlyLeuGinAspMetLeuValArgLys195200205AlaPheArgArgAlalieThrArgProThrHisPheValProThrThr210215220GluGlyPheThrAlaAlaAlaArgAlaGlyLeuGlyTrpGlyMetPhe225230235240ProGluLysLeuAlaAlaSerProLeuAlaAspGlySerPheValArg245250255ValCysAsplieHisLeuAspValProLeuTyrTrpGinCysTrpLys260265270LeuAspSerProlielieAlaArglieThrAspThrValArgAlaAla275280285AlaSerGlyLeuTyrArgGlyGinGinArgArgArgArgProGly290295300li權利要求1、一種結核病診斷試劑，其特征在于含有序列1的結核桿菌Rv1985c蛋白抗原，及所述的Rv1985c所代表的蛋白或其類似物。2、按權利要求1所述的結核病診斷試劑，其特征在于所述的結核桿菌Rvl985c蛋白包含303個氨基酸，分子量32.8kDa，等電點pl為9.05。3、按權利要求1所述的結核病診斷試劑，其特征在于所述的結核桿菌Rvl985c蛋白作為抗原由結核分枝桿菌或其它分枝桿菌表達，經抗原或結核桿菌感染人體后，使B淋巴細胞產生相應抗體，該抗體與所述的Rvl985c蛋白抗原特異結合。4、按權利要求1所述的結核病診斷試劑，其特征在于所述的抗體通過抗原抗體免疫反應被檢測。5、按權利要求4所述的結核病診斷試劑，其特征在于所述的抗原抗體免疫反應包括定量或定性的沉淀實驗，免疫熒光實驗，小吞噬實驗，E花環實驗，ELISA實驗，斑點免疫金滲濾實驗和膠體金免疫層析法實驗。6、一種快速檢測結核感染的方法，其特征在于，通過抗原抗體免疫反應檢測至少包含如權利要求3所述抗體水平的高低來診斷結核病感染情況，包括以下步驟1)使用Rvl985c抗原包被96孔板或其他吸附蛋白介質；2)采集待測樣品，通常是受試者的血清，稀釋一定倍數；3)將稀釋后樣品加入介質中與Rvl985c反應；4)加入酶聯或膠體金染料偶聯試劑，該試劑能與Rvl985c抗原抗體復合物特異反應；5)直接顯色或加入顯色劑顯色；6)肉眼或儀器讀取顏色的改變，以超過一定域值的顏色改變判定為陽性檢測。7、按權利要求6所述的快速檢測結核感染的方法，其特征在于所屬步驟4的試劑選自酶聯Rvl985c多肽，ProteinA，抗IgG或IgM二抗。8、一種快速檢測結核病的試劑盒，其特征在于包含如權利要求1所述的抗原所述試劑盒通過酶聯免疫吸附實驗進行檢測。全文摘要本發明屬診斷試劑領域，涉及含結核分支桿菌Rv1985c蛋白的診斷試劑及試劑盒。本發明可對受試者血液或體液作出是否感染結核分支桿菌的快速診斷，從免疫膠體金的15分鐘到ELISA的5個小時不等。作為診斷試劑用于被臨床證實的活動性結核時，單獨使用Rv1985c抗原檢測敏感性達到59％，特異性96％；與其他診斷抗原(如與對照抗原LAM/38kDa)合并使用使，可進一步提高診斷敏感性，達75％，具有較高臨床應用價值。本發明的檢測只需要單份血清樣品，化驗簡單、快速、不需要專業實驗室設備，成本低廉，當天可得到結果，非常適合廣大鄉鎮農村醫院和戰地條件下的結核感染檢測。文檔編號G01N33/68GK101661044SQ200810042130公開日2010年3月3日申請日期2008年8月27日優先權日2008年8月27日發明者舒張,穎張,張文宏,森王,王洪海,蘇曉迪,邵凌云,陳嘉臻申請人:復旦大學附屬華山醫院;復旦大學