專利名稱：一種硝西泮膠體金法檢測試紙及制備方法
一種硝西泮膠體金法檢測試紙及制備方法技術領域一種硝西泮膠體金法檢測試紙及制備方法，屬于生物學免疫方法的測定技 術領域。
技術背景硝西泮(Nitmzepam)為苯二氮卓類鎮靜安眠藥，化學名稱為1，3-二氫-7-硝基 -5-苯基-2H-l，4-苯并二氮卓-2-酮。曾用作動物飼料添加劑，作為生長促進劑，具 有使動物嗜睡少動，生長快且有改變肉質的作用。也用在屠宰和動物檢疫之前, 或將動物轉移屠宰之前，起鎮靜作用，以減輕動物緊張狀態，降低動物傷害和死 亡率。此類藥物常見嗜睡，可見無力、頭痛、暈眩、惡心、便秘，偶見皮疹、肝 損害、骨髓抑制等不良反應。若隨意在飼料中添加此類藥物，蓄積的藥物通過食 物鏈進入人體，將造成巨大的危害。為此許多國家將此類藥物列入禁用藥物名 單。目前，國內外有關硝西泮的檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜 法(GC)、薄層色譜法(TLC)、氣-質聯用法(GC-MS)、液-質聯用法(LC -MS)等， 但這些方法不僅需要昂貴的儀器設備，對檢材的要求也比較高，需要進一步的 提純處理才能進行，且不能適應高通量、現場的快速檢測。因此實現具有快速， 便攜優點的免疫檢測方法的多殘留檢測具有現實意義。 發明內容本發明的目的是提供一種硝西泮膠體金法檢測試紙及制備方法，為了克服 現有檢測技術的缺陷，提供一種便攜，快速適合進行現場檢測硝西泮的免疫層 析色譜檢領鵬(gold immunochromatogmphy assay; GICA)。本發明的技術方案 一種硝西泮膠體金法檢測試紙，由樣品墊、結合釋放 墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和塑料底板組成，塑料底板上依次粘貼樣品墊、結 合釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，結合釋放墊上包被了抗硝西泮多抗-膠體金 標記物，硝酸纖維素膜上依次包被有硝西泮偶聯抗原和羊抗兔IgG抗體，以硝西泮偶聯抗原作為測試線，以羊抗兔IgG抗體作為質控線。制備步驟為(1) 將硝西泮與牛血清蛋白分子進行偶聯，作為硝西泮偶聯抗原；(2) 用硝西泮偶聯抗原按常規方法免疫制得抗硝西泮多抗；(3) 用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；(4) 將3mL膠體金調至pH 9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.2mg/mL的抗硝 西泮多抗0.02mL，放置30min后加入5%牛血清蛋白BSA溶液使終濃度為1%，放置至少30min后，IOOOO轉離心50min，移去上清液后用含5%蔗糖的0.002mol/L pH9.0的硼酸鹽緩沖液3mL重懸，重復2次，最后用0.3mL緩沖液溶解，得到 穩定的抗硝西泮多抗-膠體金標記物；(5) 將抗硝西泮多抗-膠體金標記物包被在膠體金結合釋放墊上，將硝西泮偶 聯抗原和羊抗兔IgG抗體依此分別包被在硝酸纖維素膜上，硝西泮偶聯抗原作 為測試線和羊抗兔IgG抗體作為質控線，在37'C烘箱干燥；(6) 試紙條的組裝將樣品墊、結合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端 依次黏附在塑料底板上，即得到用于免疫檢測的硝西泮膠體金法檢測試紙。本發明檢測原理是利用樣品墊形成的毛細管虹吸效應，使被檢測物質首先 與膠體金標記的抗硝西泮多抗發生競爭形式的結合，其后果是，當膠體金標記 的抗硝西泮多抗過量時，多余的多抗漂移到測試線，與硝西泮偶聯抗原結合并 顯色；而與檢測物結合的膠體金標記的抗硝西泮多抗，其V區結合位點被檢測 物質占據，只能跨越測試線漂移到質控線以C區位點與羊抗兔IgG抗體非特異 性結合，同測試線進行比色而得到檢測結果。本發明的有益效果本發明應用層析式一步競爭法原理，試紙中上下線比 色來半定量檢測血清或尿液樣品中的硝西泮殘留量，在5-10min內，快速準確地 檢測出樣品是否含有硝西泮，以確定硝西泮是否超標，能夠滿足食品安全對硝 西泮殘留量檢測需求，適用于屠宰企業及政府檢測機構。本發明與現有技術相比，其效果不言而喻，即具有使用方便、經濟快捷、 制作容易、成本低廉的特點。
圖1本發明硝西泮膠體金法檢測試紙的側視圖。
具體實施方式
實施例l:硝西泮檢測試紙的制備(1) 將硝西泮與牛血清蛋白分子偶聯，作為硝西泮偶聯抗原，(2) 用硝西泮偶聯抗原免疫獲得抗硝西泮多抗(3) 用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；(4) 將3mL膠體金調至pH 9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.2mg/mL的抗硝 西泮多抗0.02mL，放置30min后加入5。/。牛血清白蛋白(BSA)溶液使終濃度為 1%,放置至少30min后，10000轉離心50min，移去上清液后用0.002mol/LpH 9.0 的硼酸鹽緩沖液(含5M蔗糖)3mL重懸解，重復2次，最后用0.3mL緩沖液溶解， 得到穩定的抗硝西泮多抗-膠體金標記物；(5) 將抗硝西泮多抗-膠體金標記物包被在膠體金結合釋放墊上，將硝西泮偶 聯抗原和羊抗兔IgG抗體依次分別包被在硝酸纖維素膜上，硝西泮偶聯抗原作 為(6)試紙條的組裝將樣品墊、結合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端 依次黏附在塑料底板上，即得到用于檢測的免疫層析試紙條。 實施例2:試紙要求 (l)陰性參考品符合率用磷酸鹽緩沖液(PBS: 0.01mol/L、 pH7.4)配制濃度為10ng/mL的鹽酸異丙 嗪標準品溶液進行10次平行檢測，以正常或矯正目力觀察結果，反應時間在 5min時觀察結果，應為陰性。用磷酸鹽緩沖液(PBS: 0.01mol/L、 pH7.4)配制濃度為10ng/mL的巴比妥標 準品溶液進行10次平行檢測，以正常或矯正目力觀察結果，反應時間在5min 時觀察結果，應為陰性。P)陽性參考品符合率用磷酸鹽緩沖液(PBS: 0.01mol/L、 pH 7.4)配制濃度為10、 50、 100ng/mL 的硝西泮標準品進行平行檢測，各濃度進行10次平行實驗，反應時間在5min 時觀察結果，不得出現陰性。(3)最低檢出量用磷酸鹽緩沖液(PBS: 0.01mol/L、 pH 7.4)分別配制濃度為0、 2、 5、 10、 20、 50、 100ng/mL的硝西泮標準品溶液，各濃度進行10次平行實驗，反應時間 在5min時，以正常或矯正目力觀察結果，最低檢出量不高于5ng/mL。H)再現性用磷酸鹽緩沖液(PBS: 0.01mol/L、 pH7.4)分別配制濃度為10ng/mL的硝西 泮標準品溶液，進行10次平行實驗，反應時間在5min時，以正常或矯正目力 觀察結果，結果一致，顯色度均一。(5)穩定性測試37"C放置10天后，各項指標應符合以上要求。 實施例3:試紙使用方法(1) 樣品制備血清抽取待檢動物血液，離心或靜置后取透明上清液使用；若血清有過 度溶血現象，將血清用蒸餾水稀釋一倍后再進行實驗，否則試劑片紅色太深， 影響測試結果。尿液用尿液直接進行測試，如渾濁，先離心取上清液或以蒸餾水l : l稀釋。(2) 操作將試紙箭頭端浸泡在待測樣本中，不要超過樣品墊lcm。浸入30sec取出放 平，10min讀取結果。(3) 檢測結果陰性兩條帶都顯色，且測試線顏色深于質控線顏色，說明樣品中不含硝西泮。 兩條帶都顯色，且測試線顏色與質控線顏色相同或接近，說明樣品的硝西泮含量低于5ppb(5ng/mL)。陽性 兩條帶都顯色，但測試線顏色淺于質控線顏色，說明檢測樣品中硝西泮含量超過5ppb(5ng/mL)。測試線不顯色，質控線顯色，說明樣品中的硝西泮含量高于 10ppb(10ng/mL)。
權利要求
1、一種硝西泮膠體金法檢測試紙，其特征在于由樣品墊、結合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和塑料底板組成，塑料底板上依次粘貼樣品墊、結合釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，結合釋放墊上包被了抗硝西泮多抗-膠體金標記物，硝酸纖維素膜上依次包被有硝西泮偶聯抗原和羊抗兔IgG抗體，以硝西泮偶聯抗原作為測試線，以羊抗兔IgG抗體作為質控線。
2、 權利要求1所述硝西泮膠體金法檢測試紙的制備方法，其特征在于制備步驟為(1) 將硝西泮與牛血清蛋白分子進行偶聯，作為硝西泮偶聯抗原；(2) 用硝西泮偶聯抗原按常規方法免疫制得抗硝西泮多抗；(3) 用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；(4) 將3mL膠體金調至pH 9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.2mg/mL的抗硝 西泮多抗0.02mL，放置30min后加入5%牛血清蛋白BSA溶液使終濃度為1%， 放置至少30min后，10000轉離心50min,移去上清液后用含5%蔗糖的0.002mol/L pH9.0的硼酸鹽緩沖液3mL重懸，重復2次，最后用0.3mL緩沖液溶解，得到 穩定的抗硝西泮多抗-膠體金標記物；(5) 將抗硝西泮多抗-膠體金標記物包被在膠體金結合釋放墊上，將硝西泮偶 聯抗原和羊抗兔IgG抗體依此分別包被在硝酸纖維素膜上，硝西泮偶聯抗原作 為測試線和羊抗兔IgG抗體作為質控線，在37'C烘箱干燥；(6) 試紙條的組裝將樣品墊、結合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端 依次黏附在塑料底板上，即得到用于免疫檢測的硝西泮膠體金法檢測試紙。
全文摘要
一種硝西泮膠體金法檢測試紙及制備方法，屬于生物學免疫方法的測定技術領域。本發明檢測試紙由樣品墊、結合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和塑料底板組成，塑料底板上依次粘貼樣品墊、結合釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，結合釋放墊上包被了抗硝西泮多抗-膠體金標記物，硝酸纖維素膜上依次包被有硝西泮偶聯抗原和羊抗兔IgG抗體，以硝西泮偶聯抗原作為測試線，以羊抗兔IgG抗體作為質控線。本發明具有使用方便、經濟快捷、制作容易、成本低廉的特點。
文檔編號G01N33/558GK101329338SQ20081002225
公開日2008年12月24日 申請日期2008年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者劉麗強, 彭池方, 李秋生, 胡擁明, 胥傳來, 緩 袁 申請人:江南大學