專利名稱：毛細管電泳-多光子激發熒光柱上檢測儀的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于高靈敏度多光子熒光檢測技術，具體涉及一種毛細管 電泳一多光子激發熒光柱上檢測儀。
背景技術：
毛細管電泳(high-performance capillary electrophoresis, HPCE) 作為分離分析技術，具有分離效率高、分析時間短和進樣量小等優點，且 操作簡單，容易實現自動化。隨著分離模式的多元化和探測技術的創新，使得毛細管龜泳在生命科學、環境衛生和藥物等領域得到了廣泛應用。
多光子熒光(Multi-photon Excited fluorescence, MPF)技術作為 新的檢測技術，具有激發體積小(10—18L)、光損傷和光毒性小(采用近紅外 激光)、靈敏度高(zmol-ymol水平探測限)和背景噪聲低等特點。近幾年 來，多光子激發熒光技術在細胞化學成像和氨基酸、蛋白質、神經遞質等 生命活性物質分析應用中倍受重視。Shear和Song等人最先將毛細管電泳和多光子熒光技術結合在一起。 Song通過該技術在amol(l(T"mol)檢測了 Coumarine和DDCS(見Song J M,Inoue T，et al.Highly sensitive detection using laser two-photon excited fluorescence in capillary elec加ptoresis.Journal of chromatography A,1997，765:351—3f9)， Shear等人用 多光子系統研究熒光標記的神經遞質，探究囊泡的分泌，探測極限在1000 個分子以下(Shear J，Brown E B Webb W. Mutiphoton-excited fluorescence of fluoregen-labeled neurotransmitters. Analytical Chemistry, 1996， 68(10): 1778—1783)。
由于多光子熒光過程是指在一個分子極短的時間內相繼吸收長波長兩 個光子， 一般兩個光子吸收的時間差小于0. 1飛秒(1飛秒=10—15秒)，然后發射一個短波長的熒光光子，因此，要實現多光子激發熒光，在激發點 必須有足夠大的光子密度，故一般采用大數值孔徑的物鏡。而大數值孔徑 的物鏡的焦距大概只有150微米左右，對圓形毛細管，考慮到圓形毛細管 壁對激發光路和熒光收集光路的影響，所以一般采用柱后檢測。柱后檢測 存在的困難是i )、柱后檢測存在對焦點問題，將物鏡的焦點對準毛細管 出口中心，采用CCD檢測，增加了檢測系統的設備成本，而且實驗操作變 得復雜；ii)、柱后檢測存在雜物堆積問題，實驗中毛細管中流出的物質， 很容易堆積在檢測窗口處，不利于激發和熒光檢測；iii)、柱后檢測存在清 洗問題，由于毛細管一端是檢測窗口，使得毛細管清洗工作復雜，必須將 毛細管檢測端移離到清洗池，存在二次對焦難題。總之，傳統的檢測裝置 采用復雜的柱后檢測，實驗操作繁瑣，成本高，而且重復性較差，靈敏度 也受影響。發明內容本實用新型的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種毛細管電泳一多 光子激發熒光柱上檢測儀，該檢測儀具有系統結構簡單、成本低和操作簡 便的特點。本實用新型提供的毛細管電泳一多光子激發熒光柱上檢測儀，包括半導 體激光器、物鏡、計算機、采集卡、光電倍增管、二向色鏡、帶通濾光片、全反射鏡、鉑電極、直流高壓電源和第一緩沖池，其特征在于該檢測儀 還包括第二緩沖池和柱上檢測器，該柱上檢測器由圓形毛細管、方形毛細 管和特氟龍管構成，特氟龍管通過嫁接將方形毛細管和圓形毛細管連接起 來；方形毛細管和圓形毛細管的另一端部分別位于第一、第二緩沖池內； 半導體激光器發出的光束由依次二向色鏡和全反射鏡兩次反射后，進入物 鏡，聚焦到柱上檢測器，實現雙光子激發熒光，熒光同時被物鏡收集，經 過全反射鏡反射，依次透過二向色鏡和帶通濾光片，被光電倍增管探測并 實現放大，并通過采集卡送入計算機，由計算機完成熒光信號數據處理； 直流高壓電源的二個鉑電極分別位于第一、第二緩沖池內，直流高壓直接 加在柱上檢測器的兩端，樣品在柱上檢測器內實現分離和多光子熒光檢測。本實用新型通過嫁接的方法，采用特氟龍管，將方形毛細管和圓形毛 細管連接起來，其中圓形毛細管用于分離，方形毛細管用于柱上檢測。采 用毛細管電泳一多光子激發熒光柱上檢測儀，省去了用于聚焦的CCD監控
裝置，不但簡化了傳統實驗設備，降低實驗設備成本，簡化了復雜操作的 柱后檢測方式，而且提高了探測靈敏度。本實用新型提供一種經濟的檢測 手段，適合多光子熒光檢測，特別適合于生物體內熒光基團的多光子激發 熒光檢測。它改變傳統的多光子激發熒光信號柱后檢測法，實驗表明，采 用本實用新型檢測儀既保留了圓形毛細管分離的效果，又簡化了實驗裝置 和實驗操作，同時提高了探測靈敏度。具體的試驗數據說明見具體實施方 式部分。


圖1為本實用新型毛細管電泳一多光子激發熒光柱后檢測儀的結構示意圖; 圖2為圖1中柱上檢測器的局部結構放大示意圖； 圖3為圓形柱后檢測多光子熒光毛細管電泳分離圖4為方形柱上檢測多光子熒光毛細管電泳分離圖；方形100微米； 柱上檢測，長度57/50厘米；電壓20 kV;其他同上；
圖5為本實用新型的毛細管電泳一多光子激發熒光柱上檢測儀得到的
多光子熒光毛細管電泳分離圖。75微米圓形一100微米方形一75微米圓形； 柱上檢測，長度57/50厘米；電壓20 kV;其他同上。
具體實施方式
本實用新型毛細管電泳一多光子激發熒光柱上檢測儀采用的是柱上檢測， 它包括光路和電泳二部分。
以下結合附圖和實例對本實用新型作進一步詳細的說明。
如圖1所示，光路部分包括半導體激光器l、物鏡3、計算機9、采集卡 10、光電倍增管ll、 二向色鏡12、帶通濾光片15和全反射鏡13。半導體 激光器1發出的光束由二向色鏡12和全反射鏡13兩次反射后，進入物鏡3， 聚焦到柱上檢測器14，實現雙光子激發熒光后，熒光同時被物鏡3收集， 經過全反射鏡13反射，透過二向色鏡12和帶通濾光片15，熒光被光電倍 增管ll探測并實現放大，送給釆集卡IO,由計算機9完成熒光信號數據處 理，實現定性和定量分析；
電泳部分包括鉑電極8、直流高壓電源2、第一41、第二緩沖池42和 柱上檢測器14。直流高壓通過插在二個緩沖池41, 42的鉑電極8，直接加 在柱上檢測器14的兩端，樣品在柱上檢測器14內實現分離和多光子熒光 檢測。
如圖2所示，柱上檢測器14由圓形毛細管5、方形毛細管6和特氟龍 管7構成。通過嫁接的方法，采用特氟龍管7，將方形毛細管6和圓形毛細 管5連接起來。柱上檢測器14的功能如下i)圓形毛細管用于電泳分 離；圓形毛細管具有中心對稱性，在高壓電場下，各個部分的電荷分布要
均勻，減少了分離物質的附著，有利于分離；ii)特氟龍管用于圓形和 方形毛細管連接；特氟龍管將圓形毛細管和方形毛細管結合起來，使之連 接處死體積幾乎為零，保證電泳分離的連續性；iii)方形毛細管用于熒 光探測；方形毛細管是內外都是平面，高倍物鏡可以直接將激發光束聚焦 到方形毛細管中間。與圓形毛細管不同，方形毛細管因為管壁是一個平面 結構，對聚焦光束和聚焦點幾乎沒有影響，可以實現多光子熒光激發和收集。 本實用新型采用方形毛細管柱上檢測代替傳統的圓形毛細管柱后檢 測。實驗操作簡單，不需要添加任何其他輔助設備，降低了實驗設備成本; 特別是實驗過程中方便清洗，而且從管口流出的雜質也不會造成檢測窗口 污染，有利于熒光的探測和收集。 實例
為了實驗論證本實用新型的可行性和科學性，我們實驗選擇多種苯胺 (9種，具體見表l)混和衍生后，采用多光子激發熒光方法，在三種不同 的分離和檢測狀態下，實現苯胺的分離和檢測采用傳統的圓形毛細管分 離柱后檢測和方形毛細管分離柱上檢測；采用本實用新型的毛細管電泳一 多光子激發熒光柱上檢測的分離檢測。
上述對比實驗如下，實驗證明，圓形毛細管分離效果要優于方形毛細 管，而它的檢測靈敏度不于方形毛細管，實驗具體如下
l.圓形毛細管柱后檢測電泳圖譜如圖3，物鏡將近紅外光束聚焦在毛 細管陰極端的出口中心，通過CCD實現對焦。實驗參數圓形75微米；長
度50厘米；電壓18kV;緩沖液25mmol/L硼砂，用lmol/LNaOH溶液調節到pH 11; FITC和苯胺分子數比為10比1混和，漩渦混勻，于暗 處室溫25'C衍生反應12小時；苯胺濃度依次是2. 69、 3. 43、 2. 39、 2. 49、 2.63、 2.74、 3.36、 2.64、 2.95 X 1(Tmol/L;虹吸進樣15 cm， 60s。
2. 方形毛細管柱上檢測如電泳圖譜如圖4，物鏡直接透過方形毛細管 管壁，聚焦在方形毛細管中心。實驗參數方形毛細管的管壁厚度為130 微米，其內腔的邊長為100微米；柱上檢測，長度57/50厘米；電壓20kV; 其他同圖3。
3. 方圓結合的柱上檢測——毛細管電泳一多光子激發熒光柱上檢測電 泳圖譜如圖5。它采用特氟龍管將圓形毛細管和方形毛細管連接起來，圓 形毛細管用來分離待測物，方形毛細管作為探測窗口，物鏡將近紅外光束 直接透過方形毛細管的方形平面，聚焦在方形毛細管中央，實現多光子激 發熒光和熒光收集。實驗參數75微米圓形一100微米方形一75微米圓形; 柱上檢測，長度57/50厘米；電壓20 kV;其他同上。
實驗電泳圖譜比較說明，采用本實用新型能夠提高分離效率和靈敏度。 表1苯胺中英文對照及其編號
編號名稱英文名稱
1對甲苯胺p-Toludine
2苯胺Aniline
3對氯苯胺p-CWoroaniline
4對乙氧基苯胺p-ethoxyaniline
4一溴苯胺4-Bromoaniline
63 —溴苯胺3-Bromoaniline
了間氨基苯酚m- aminopheol
8鄰氨基苯酚o-aminopheol
9對苯二胺1 ，4-diaminobenzene
備注編號按照其電泳圖譜中峰次順序標定
權利要求1、一種毛細管電泳-多光子激發熒光柱上檢測儀，包括半導體激光器(1)、物鏡(3)、計算機(9)、采集卡(10)、光電倍增管(11)、二向色鏡(12)、帶通濾光片(15)、全反射鏡(13)、鉑電極(8)、直流高壓電源(2)和第一緩沖池(41)，其特征在于該檢測儀還包括第二緩沖池(42)和柱上檢測器(14)，該柱上檢測器14由圓形毛細管(5)、方形毛細管(6)和特氟龍管(7)構成，特氟龍管(7)通過嫁接將方形毛細管(6)和圓形毛細管(5)連接起來；方形毛細管(6)和圓形毛細管(5)的另一端部分別位于第一、第二緩沖池(41、42)內；半導體激光器(1)發出的光束由依次二向色鏡(12)和全反射鏡(13)兩次反射后，進入物鏡(3)，聚焦到柱上檢測器(14)，實現雙光子激發熒光，熒光同時被物鏡(3)收集，經過全反射鏡(13)反射，依次透過二向色鏡(12)和帶通濾光片(15)，熒光被光電倍增管(11)探測并實現放大，并通過采集卡(10)傳送給計算機，由計算機(9)完成熒光信號數據處理；直流高壓電源(2)的二個鉑電極(8)分別位于第一、第二緩沖池(41、42)內，直流高壓直接加在柱上檢測器(14)的兩端，樣品在柱上檢測器(14)內實現分離和多光子熒光檢測。
專利摘要本實用新型公開了一種毛細管電泳-多光子激發熒光柱上檢測儀，該檢測儀包括半導體激光器、物鏡、計算機、采集卡、光電倍增管、二向色鏡、帶通濾光片、全反射鏡、鉑電極、直流高壓電源、第一、第二緩沖池和柱上檢測器。柱上檢測器采用特氟龍管，將方形毛細管和圓形毛細管連接起來，其中圓形毛細管用來分離(實驗證明方形毛細管分離效果沒有圓形的好)，而方形毛細管用于柱上檢測。熒光柱上探測的方形毛細管與用于分離的圓形毛細管結合起來，實現柱上檢測，不但簡化了傳統實驗設備，降低實驗設備成本，簡化了復雜操作的柱后檢測方式，而且提高了探測靈敏度。
文檔編號G01N27/453GK201016928SQ20072008371
公開日2008年2月6日 申請日期2007年3月8日 優先權日2007年3月8日
發明者劉筆鋒, 勝 陳, 駱清銘 申請人:華中科技大學