專利名稱：用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程技術領域的石蠟切片制樣方法，具體是一種用于原 子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法。
背景技術：
石蠟切片技術是細胞生物學最常用的技術之一，包括固定、脫水、包埋、切 片、脫蠟、染色等幾個主要步驟，常用于在光學顯微鏡下作組織和細胞的形態學 檢測。石蠟切片染色之前需要完全脫蠟，以便染色劑著色(見鄭國鋁，谷祝平著 生物顯微技術，第二版，北京高等教育出版社，1993)。常用的脫蠟試劑是二 甲苯，處理時間根據樣品材料的不同和實驗條件等因素不同而有差異， 一般是
15 60min。但是當石蠟切片用原子力顯微鏡(AFM)來觀察時，在脫蠟之前切片 表面不能清晰顯示組織和細胞結構，而完全脫蠟后部分表面已被破壞，且粗糙度 太大，因此必須發展適合原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法。
經對現有技術的文獻檢索發現，榮瑋等在《解剖學雜志》上(2006， 29(1) P.92)上發表的"關于石蠟切片在染色中脫蠟的探討"中提出加熱二甲苯或者 烘烤切片以加快脫蠟的方法，鄧昂在《華中醫學雜志》上(2002， 26(5)P.262) 發表的"病理切片中松節油代替二甲苯脫蠟"中提出了用松節油來代替常用的二 甲苯對石蠟切片進行脫蠟，有助減輕二甲苯對操作人員的毒性。上述這些方法都 是對現有石蠟切片脫蠟方法的改善，以更好的適應光學顯微鏡的觀察。但目前尚 無針對原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法的報道，因此非常有必要發展適合 于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片樣品制備技術，尤其是切片脫蠟技術。

發明內容
本發明針對現有技術的上述不足，提供一種用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切 片脫蠟方法，使其具備步驟簡單，操作簡便，所得的切片表面粗糙度合適，能夠 展現組織和細胞的精細結構，適合于原子力顯微鏡觀察。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下步驟
第一步，按體積比為1: 1的比例將二甲苯和無水乙醇混勻，注滿兩個染色 缸，將貼附于載玻片表面的石蠟切片全浸入第一個裝滿二甲苯和無水乙醇混合液 的染色缸中處理1 min，其間輕輕搖動一次。
第二步，將第一個染色缸中的石蠟切片取出，立即浸入裝滿二甲苯的染色缸 中，在室溫25 'C的條件下處理15 min 30 min。其間每隔5 min輕輕搖動染 色缸一次。
第三步，將切片取出，立即浸入第二個裝滿二甲苯和無水乙醇混合液的染色 缸中處理2 min，其間輕輕搖動一次。
第四步，將切片取出，立即浸入裝滿無水乙醇的染色缸中處理2min，取出 晾干，即獲得適合于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片。
在上述發明中，石蠟切片經過二甲苯的脫蠟處理，組織和細胞的精細結構已 暴露出來，可以供原子力顯微鏡觀察和形態分析，分辨率在亞細胞的水平，能夠 分辨細胞膜、細胞核以及胞內基質，還包括細胞間質和胞外基質。尤其細胞核形 態完整，且凸出于細胞基質，在原子力顯微鏡下易于分辨和識別。本方法步驟簡 單，操作方便。


圖1為不同脫蠟時間的石蠟切片在原子力顯微鏡空氣中觀察的圖像 其中A是未經脫蠟的石蠟切片樣品，B是本發明實施例l中制備的樣品， 切片脫蠟時間為15 min， C是脫蠟時間為65 min的樣品。
圖2為本發明實施例2中制備的樣品在原子力顯微鏡空氣中觀察的圖像。
具體實施例方式
下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下 進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限 于下述的實施例。
實施例1
將貼附在載玻片表面的石蠟切片浸入體積比為1:1的二甲苯和無水乙醇混 合液中處理lmin，立即轉入二甲苯中處理15min，其間輕輕搖晃兩次。到時間 后，再轉入體積比為1:1的二甲苯和無水乙醇混合液中處理2min，最后轉入無 水乙醇中處理2min，取出晾干，供原子力顯微鏡觀察。
將上述方法脫蠟的石蠟切片在原子力顯微鏡下觀察，所得圖像見圖1A，可 見切片表面粗糙度合適，細胞輪廓清晰，胞內有凸出的細胞核，細胞間有基質。 掃描范圍50umX50ym。如果是未經脫蠟處理的石蠟切片直接用原子力顯微鏡 觀察，因為表面被一層石蠟覆蓋，不能顯示組織和細胞的結構，見圖1B。如果 是脫蠟時間在60 min以上，切片將被完全脫蠟，則表面結構已被部分破壞，粗 糙度很大，難以觀察到組織和細胞的精細結構，見圖1C。
實施例2
將貼附在載玻片表面的石蠟切片浸入體積比為1:1的二甲苯和無水乙醇混 合液中處理lmin，立即轉入二甲苯中處理30min，其間輕輕搖晃三次。到時間 后，再轉入體積比為1:1的二甲苯和無水乙醇混合液中處理2 min，最后轉入無 水乙醇中處理2min，取出晾干，供原子力顯微鏡觀察。
將上述方法脫蠟的石蠟切片在原子力顯微鏡下觀察，所得圖像見圖2，可見 切片表面粗糙度合適，細胞輪廓清晰，排列分散，胞內有一個或兩個凸出的細胞 核，細胞間有基質填充。掃描范圍50iimX50um。
權利要求
1、一種用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，其特征在于包括如下步驟第一步，按體積比為1∶1的比例將二甲苯和無水乙醇混勻，注滿兩個染色缸，將貼附于載玻片表面的石蠟切片全浸入第一個裝滿二甲苯和無水乙醇混合液的染色缸中處理；第二步，將第一個染色缸中的石蠟切片取出，立即浸入裝滿二甲苯的染色缸中，在室溫下處理；第三步，將切片取出，立即浸入第二個裝滿二甲苯和無水乙醇混合液的染色缸中處理；第四步，將切片取出，立即浸入裝滿無水乙醇的染色缸中處理，取出晾干，即獲得適合于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片。
2、 根據權利要求1所述的用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，其 特征是，第一步中，所述處理，其時間為l min，其間輕輕搖動一次。
3、 根據權利要求1所述的用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，其 特征是，第二步中，所述室溫，是指25 °C。
4、 根據權利要求1或3所述的用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法， 其特征是，第二步中，所述處理，其時間為15 min 30 min，其間每隔5 min 輕輕搖動染色缸一次。
5、 根據權利要求4所述的用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，其 特征是，第三步中，所述處理，其時間為2min，其間輕輕搖動一次。
6、 根據權利要求1所述的用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，其 特征是，第四步中，所述處理，其時間為2 min。
全文摘要
一種用于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片脫蠟方法，屬于生物工程技術領域。本發明步驟為按體積比為1∶1的比例將二甲苯和無水乙醇混勻，注滿兩個染色缸，將貼附于載玻片表面的石蠟切片全浸入第一個裝滿二甲苯和無水乙醇混合液的染色缸中處理；將第一個染色缸中的石蠟切片取出，立即浸入裝滿二甲苯的染色缸中，在室溫下處理；將切片取出，立即浸入第二個裝滿二甲苯和無水乙醇混合液的染色缸中處理；將切片取出，立即浸入裝滿無水乙醇的染色缸中處理，取出晾干，即獲得適合于原子力顯微鏡觀察的石蠟切片。本發明方法步驟簡單，所用試劑僅兩種，操作簡便，適合供原子力顯微鏡觀察的各種組織和細胞石蠟切片的脫蠟。
文檔編號G01N1/28GK101196444SQ200710172159
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月13日 優先權日2007年12月13日
發明者孫潔林, 彤 季, 李鑫輝, 鈞 胡 申請人:上海交通大學