專利名稱：一種利用FPLC測定脫氧胞苷激酶(dCK)活性方法
技術領域：
本發明屬于一種酶活力測定方法，具體涉及一種脫氧胞苷激酶(dCK)的酶活測定方法。
背景技術：
脫氧胞苷激酶(dCK)是細胞質內的四大激酶之一，它廣泛存在于哺乳動物體內及一 些細菌細胞內。細胞體內，dCK可以催化天然核苷的磷酸化，也可催化一些核苷類藥物的 磷酸化。研究表明，抗病毒核苷類藥物在人體內通過dCK催化進行磷酸化，產生與逆轉錄 酶結合的底物，而發揮藥效。但是，在一些患者體內細胞的dCK含量很低，無法催化核苷 類藥物的磷酸化，因而導致了病毒的抗藥性。因此，利用從各種來源提取dCK，并將其用 于核苷類似物的體外磷酸化，對核苷類藥物的發展來說是一個嶄新的領域。故對于從各種 來源純化的dCK進行酶活表征，是利用dCK進行催化反應的重要步驟。
自1970年以來，有多個專家對于dCK的酶活測定方法進行了研究，主要有放射性 同位素薄層層析色譜法、放射性同位素連續分光光度法以及非放射性反相HPLC色譜法。 其中，放射性同位素薄層層析色譜法的發明年代較早，對現代實驗室測量來說是落后且費 時的；放射性同位素連續分光光度法雖然是第一種方法的改進，但是同樣也需要用到放射 性同位素，大大增加了時間上和經濟上的成本；而非放射性反相HPLC色譜法是2004年 發表的利用高效液相色譜進行dCK酶活測定的一種新方法，簡單易懂，簡化了以往的復雜 操作，但是其對液相色譜柱要求較高。通過實驗發現，應用非放射性反相HPLC色譜法， 在相同條件下進行兩次實驗，所得的結果存在差異，實驗重復性不夠。
發明內容
本發明的目的是提供一種脫氧胞苷激酶(dCK)酶活測定方法，該方法克服了以往的 dCK酶活測定方法的繁瑣，耗時較長，重復性不高的缺陷。
本發明的利用蛋白質層析系統(FPLC)測定dCK酶活的方法，包括如下步驟
(1) 將反應混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中反應后，加入冰甲醇終止反應，冰浴后， 離心，取上清液；
(2) 用Tris-HCI緩沖液稀釋上清液，過濾，利用FPLC的反相液相色譜柱進行層析，通過 與空白對比測得CdA減少的量，計算dCK的活性。
所述步驟(1)中的反應液包括2-氯-2-脫氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化 鎂MgCl2、氯化鈉NaCl、氟化鈉NaF、 二硫代蘇糖醇DTT、 dCK，濃度分別為0.1 lmmoI/L CdA、 1 1Ommol/LUTP、 l 10mmol/LMgCl2、 10 20mmol/LNaCl、 10 20mmol/LNaF、 1 2mmol/LDTT，優選lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 10mmol/L MgCl2、 20mmol/LNaCl、 20mmol/L NaF 、 2mmol/L DTT 。
所述步驟(1)中的反應液用0.005 0.02mol/L的Tris-HCl (pH6.0 8.0)溶液定容， 優選0.01 moi/L的Tris-HCl (pH7.4);
所述的脫氧胞苷激酶(dCK)是指從小牛胸腺中提取的dCK;
所述步驟(1)中的反應是指30'C 4(TC， 120 150轉條件下，反應2 3小時，反 應后冰浴5 20分鐘，優選37°C，搖床轉速為150轉，反應時間為2小時，反應后冰浴 IO分鐘;
所述的歩驟(2)中的層析條件是反相液相色譜柱為RESOURCE" RPClml，洗脫液 A為0.05 0.02mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH6.0 8.0)，洗脫液B為乙腈，平衡為5 10 個柱床，沖洗為5 7個柱床，洗脫梯度為洗脫液B在10 20個柱床內由0%線性增加至 100%，流速為l 2ml，優選洗脫液A為O.Olmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，平衡為 10個柱床，沖洗為7個柱床，洗脫梯度為洗脫液B在20個柱床內由0%線性增加至100 %，流速為1ml;
所述的dCK酶活的計算方法dCK酶活U=CdA反應量(picomol)/蛋白含量(u g) *h， CdA反應量二CdA空白標準量一CdA剩余量；
所述的CdA剩余量的測定為內標法。
本發明提供的方法快速、簡便，結果可信，重復性高，為大批量測定氧胞苷激酶(dCK) 酶活，提供依據。
圖1為用快速蛋白質層析系統(FPLC)對小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反應混合液空白 進行反相色譜層析所得的色譜圖2為用快速蛋白質層析系統(FPLC)對小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反應混合液進行 反相色譜層析所得的色譜圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一歩闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限 定的范圍。
實施例1
1 、 dCK催化CdA的單磷酸化反應
(1) 將反應混合液包括lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 10mmol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/L DTT以及lmldCK用0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.4) 定容到5ml。
(2) 將反應混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，在37'C、 150rpc下，反應2小時。
(3) 反應完畢后將混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反應10分鐘，另蛋白 質完全沉淀。
(4) 從冰浴中取出混合液，放入離心機中10000rpc離心10分鐘，留取上清液等待 FPLC測定。
(5) 樣品空白的準備在反應混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入氣浴/水浴恒溫 振蕩器中，在37。C、 150rpc下，反應2小時。冰浴10分鐘后，離心留取上清液。
2、 FPLC測定dCK酶活
(1) 樣品的準備。取上述反應混合物清液0.5ml，用0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液 (pH7.4)稀釋至lml。將稀釋的混合液用0.45y的濾頭過濾，等待上樣。
(2) 反相液相色譜層析。用FPLC系統中反相液相色譜對上述處理過的樣品和樣品空 白進行層析，條件是反相層析柱RESOURCE RPC lml;洗脫液A: O.Olmol/L的Tris-HCl
緩沖液(pH7.0);洗脫液B:乙腈；上樣量5ml;平衡IO個柱床；沖洗7個柱床；洗
脫梯度洗脫液B在20個柱床內由0%線性轉變到100%;流速lml/min。
實施例2
1、 dCK催化CdA的單磷酸化反應
(l)將反應混合液包括lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 1 Ommol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/L DTT以及lmldCK用O.Olmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.0) 定容到5ml。(2) 將反應混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，在37。C、 150rpc下，反應2小時。
(3) 反應完畢后將混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反應10分鐘，另蛋白 質完全沉淀。
(4) 從冰浴中取出混合液，放入離心機中10000rpc離心10分鐘，留取上清液等待 FPLC測定。
(5) 樣品空白的準備在反應混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入氣浴/水浴恒溫 振蕩器中，在37"C、 150rpc下，反應2小時。冰浴10分鐘后，離心留取上清液。
2、 FPLC測定dCK酶活
(1) 樣品的準備。取上述反應混合物清液0.5ml，用0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液 (pH7.0)稀釋至lml。將稀釋的混合液用0.45u的濾頭過濾，等待上樣。
(2) 反相液相色譜層析。用FPLC系統中反相液相色譜對上述處理過的樣品和樣品 空白進行層析，條件是反相層析柱RESOURCE RPC ltnl;洗脫液A: 0.005mol/L的
Tris-HCl緩沖液(pH7.0);洗脫液B:乙腈；上樣量5ml;平衡IO個柱床；沖洗7個
柱床；洗脫梯度洗脫液B在IO個柱床內由0%線性轉變到100%;流速2ml/min。
實施例3
1、 dCK催化CdA的單磷酸化反應
(1) 將反應混合液包括0.5mmol/LCdA、 5mmol/LUTP、 10mmol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、20mmol/LNaF、2mmol/L DTT以及0.5mldCK用O.Olmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)
定容到5ml 。 、
(2) 將反應混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，在37。C、 120rpc下，反應3小時。
(3) 反應完畢后將混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反應10分鐘，另蛋白
質完全沉淀。
(4) 從冰浴中取出混合液，放入離心機中10000rpc離心10分鐘，留取上清液等待 FPLC測定。
(5) 樣品全白的準備在反應混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入氣浴/水浴恒溫 振蕩器中，在37。C、 150rpc下，反應2小時。冰浴10分鐘后，離心留取上清液。
2、 FPLC測定dCK酶活
(1)樣品的準備。取上述反應混合物清液0.5ml，用0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液 (pH7.0)稀釋至lml。將稀釋的混合液用0.45u的濾頭過濾，等待上樣。
(2)反相液相色譜層析。用FPLC系統中反相液相色譜對上述處理過的樣品和樣品空白進 行層析，條件是反相層析柱RESOURCE RPC lml;洗脫液A: 0.01 mol/L的Tris-HCl
緩沖液(pH7.0);洗脫液B:乙腈；上樣量5ml;平衡IO個柱床；沖洗7個柱床；洗
脫梯度洗脫液B在20個柱床內由0%線性轉變到100%;流速lml/min。
權利要求
1.利用蛋白質層析系統(FPLC)測定脫氧胞苷激酶(dCK)酶活的方法，包括如下步驟(1)30℃～40℃，將反應混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，120～150轉/min，反應2～3小時，加入冰甲醇終止反應，冰浴5～20分鐘后，離心，取上清液；(2)用Tris-HCl緩沖液稀釋上清液，過濾，利用FPLC的反相液相色譜柱進行層析，通過與空白對比測得CdA減少的量，計算dCK的活性。
2. 根據權利要求l所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于所述步驟(1)中的 反應液包括2-氯-2-脫氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化鎂MgCl2、氯化鈉NaCl、 氟化鈉NaF、二硫代蘇糖醇DTT、c!CK，濃度分別為0.1 lmmol/LCdA、 1 1Ommol/LUTP、 l 10mmol/LMgCl2、 10 20mmol/L NaCl、 10 20mmol/LNaF、 l 2mmol/L DTT。
3. 根據權利要求2所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于反應液濃度為lmmol/L CdA、 1Ommol/LUTP、 10mmoI/L MgCl2、 20mmol/LNaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/LDTT。
4. 根據權利要求l所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于所述步驟(1)中的 反應液用0.005 0.02mol/L的Tris-HCl (pH6.0 8.0)溶液定容。
5. 根據權利要求4所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于定容液為0.01 mol/L 的Tris-HCl (pH7.4)。
6. 根據權利要求l所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于所述的脫氧胞苷激 酶(dCK)是指從小牛胸腺中提取的dCK。
7. 根據權利要求l所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于所述步驟(1)中的 反應是指37'C， 150轉/min，反應2小時，冰浴10分鐘。
8. 根據權利要求1所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于所述的步驟(2)中 的層析條件是反相液相色譜柱為RESOURCE RPC lml，洗脫液A為0.05 0.02mol/L的 Tris-HCl緩沖液(pH6.0 8.0)，洗脫液B為乙腈，平衡為5 10個柱床，沖洗為5 7個 柱床，洗脫梯度為洗脫液B在10 20個柱床內由0%線性增加至100%,流速為1 2ml。
9. 根據權利要求8所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于洗脫液A為O.Olmol/L 的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，平衡為10個柱床，沖洗為7個柱床，洗脫梯度為洗脫液B 在20個柱床內由0%線性增加至100%，流速為lml。
10. 根據權利要求l所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于所述的dCK酶活 的計算方法dCK酶活U=CdA反應量(picomol) /蛋白含量(μg) h， CdA反應量= CdA空白標準量一CdA剩余量，CdA剩余量的測定為內標法。
全文摘要
本發明涉及一種利用蛋白質層析系統(FPLC)測定脫氧胞苷激酶(dCK)酶活的方法，包括步驟(1)30℃～40℃，將反應混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，120～150轉/min，反應2～3小時，加入冰甲醇終止反應，冰浴5～20分鐘后，離心，取上清液；(2)用Tris-HCl緩沖液稀釋上清液，過濾，利用FPLC的反相液相色譜柱進行層析，通過與空白對比測得CdA減少的量，計算dCK的活性。該方法快速、簡便，結果可信，重復性高，為大批量測定氧胞苷激酶(dCK)酶活，提供依據。
文檔編號G01N30/89GK101201338SQ20071004473
公開日2008年6月18日 申請日期2007年8月9日 優先權日2007年8月9日
發明者朱利民, 柴艷倩 申請人:東華大學