專利名稱：檢測細胞羥基自由基的熒光探針及合成方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測技術及臨床醫學檢測領域，涉及檢測細胞羥基自由基的熒光探針；同時涉及該熒光探針的合成方法；另外，還涉及該熒光探針的用途。
背景技術：
生命活動的代謝過程中產生各種自由基，生物體的衰老及許多疾病的發生與自由基都有重要關系。自由基能夠介導生命活動的許多重要反應過程，參與細胞免疫功能，對組織細胞的化學結構發生破壞性修飾，損傷正常組織細胞的形態和膜功能(Witz G.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1991，198675；Feig D.I.，Reid T.M.，Leob L.A.，Cancer Res.1994，541890s；Finkl T.，Hol brook N.J.，Nature 2000，408239)。羥自由基是一種氧化能力很強的自由基，它能夠很容易地氧化各種有機物和無機物，氧化效率高，反應速率快，是造成組織脂質過氧化、核酸斷裂、蛋白質和多糖分解的活性氧，與機體的衰老、腫瘤、輻射損傷和細胞吞噬有關(de Lara C.M.，JennerT.J.，Townsend K.M.S.，Marsden S.J.，O’Neill P.，Radiat.Res.1995，14443；StadtmanE.R.，Annu.Rev.Biochem.1993，62797；Tien M.，Svingen B.A.，Arch.Biochem.Biophys.1982，216142)。
自由基壽命短、含量低、種類多，對其檢測是生命科學與化學分析領域最困難的問題之一。羥基自由基作為一種生命活動過程中產生的目前己知氧化性最強的自由基，其檢測尤為重要。國內外文獻報道的檢測羥自由基的主要方法有電子自旋共振法(Huycke M.M.，Moore D.R.，Free Rad.Bio.Med.2002，33818)，高效液相色譜法(Kaur H.，Hsllinell B.，Anal.Biochem.1994，22011)，熒光法(Ou B.，Hampsch-Woodill，M.，Flanagan J.，Deemer E.K.，Prior R.L.，Huang D.，J.Agric.Food Chem.2002，502772；Shinichiro T.，Hideaki I.，Shota T.，TatsuyaS.，Fumiaki H.，Mitsunobu N.，Tetsuo N.，Neurosci Res.2005，53304)。熒光檢測法靈敏度高、選擇性好、響應速度快，較其它方法顯示出較強的優越性，結合共聚焦顯微成像技術，能夠實現活體細胞和組織內的活性氧“實時、可見、定量”的檢測。目前已報道用于細胞內一氧化氮和過氧化氫檢測成像的熒光探針(Sasaki E.，Kojima H.，Nishimatsu H.，Urano Y.，Kikuchi K.，Hirata Y.，Nagano T.，J.Am.Chem.Soc.2005，127，3684；Xu K H.，Tang B.，Huang H.，Yang G.W.，Chen Z.Z.，Li P.，An L.G.，Chem.Commun.2005，48，5974)，而基于熒光共振能量轉移原理用于細胞內羥基自由基檢測成像的熒光探針尚未見報道。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種響應時間短，測定靈敏度高，對細胞的滲透性好，毒副作用小，適用于生物體內羥基自由基檢測的基于熒光共振能量轉移原理的金猝滅的熒光寡核苷酸探針，為生物樣品中低含量的羥基自由基檢測，探討人類疾病及老化的機制以及某些重大疾病的早期診斷與預防，提供良好的輔助手段；目的之二是提供一種工藝簡單的該熒光探針的合成方法；目的之三是提供該熒光探針的用途。
本發明的目的之一可通過如下技術措施來實現本發明的熒光探針選擇DNA寡核苷酸鏈單鏈作為熒光共振能量轉移發生的載體，5’端修飾熒光素(激發波長490nm，發射波長520nm)作為能量供體，3’端修飾巰基鍵合金納米粒子作為能量受體，該探針具有如下結構式 式中AGGGTTAGGGDNA寡核苷酸鏈單鏈，任意堿基序列，堿基個數為2-30個；熒光素X1，X2＝F，Cl，CH3，OCH3；金納米粒子直徑為3-32nm。
本發明的目的之二可通過如下技術措施來實現該合成方法按如下步驟進行a.取重量濃度為0.01-0.02％的氯金酸溶液150.0體積份加熱回流，攪拌下加入重量濃度為1.0-2.0％的檸檬酸三鈉溶液5.0-7.0體積份，繼續回流10-20分鐘，室溫下放置冷卻，得金納米粒子溶液；b.將金納米粒子溶液與5’端修飾熒光素3’端修飾巰基的DNA單鏈按照1∶200-500物質的量配比混勻，室溫下放置12-24小時，再用磷酸緩沖液調pH＝7.0-7.8；然后將經調pH值的混合液與物質的量濃度為0.5-5mol/L的氯化鈉溶液按1∶0.1-0.3體積份配比混勻，室溫下放置35-45小時；最后經離心，除去上層清液，沉淀溶解于物質的量濃度為0.1-0.3mol/L的磷酸緩沖溶液中，得熒光探針溶液。
本發明的目的之三可通過如下技術措施來實現將所述的熒光探針用于化學體系、化學模擬生物體系中羥基自由基檢測，生物活細胞和活組織內的羥基自由基的熒光成像的檢測，以及臨床醫學上病變組織中羥基自由基的檢測。為探討人類疾病及老化的機制以及某些重大疾病的早期診斷與預防，提供良好的輔助手段。
本發明的金猝滅的熒光寡核苷酸探針在水相中合成，通常加入含有細胞及組織的適當緩沖液中進行測試。
本發明基于熒光共振能量轉移原理，利用金猝滅的熒光寡核苷酸探針專一性識別活細胞內羥自由基。探針選擇DNA寡核苷酸單鏈作為發生熒光共振能量轉移的載體，5’端修飾熒光素作為能量供體，3’端修飾巰基鍵合金納米粒子作為能量受體。金納米粒子具有高消光系數使熒光探針具有低的空白熒光信號；羥基自由基引起DNA鏈斷裂導致熒光共振能量轉移現象消失，金納米粒子猝滅熒光素的熒光隨之得到恢復，據此實現納摩爾級濃度的細胞羥基自由基的檢測。
細胞內羥基自由基檢測的一般方法是將培養好的細胞分成兩部分，一部分用刺激劑佛波脂刺激，使細胞內產生大量的超氧陰離子自由基，之后的自由基鏈式反應能夠生成羥基自由基，用培養液沖洗后，進行激光共聚焦顯微成像。未刺激的細胞用激光共聚焦顯微鏡成像得到空白對比圖像。
本發明的熒光探針具有重要的應用價值，該探針響應時間短，測定靈敏度高，對細胞的滲透性好，毒副作用小，使得這類探針作為測定生物體內羥基自由基的試劑有很好的實際利用價值。
本發明的熒光探針的具體特征如下1、本發明熒光探針的設計基于熒光共振能量轉移原理，金納米粒子具有高消光系數，在熒光素-金納米粒子組成的熒光共振能量轉移供受體對中發揮突出的熒光猝滅作用。羥自由基對脫氧核糖部分的氧化侵蝕會使DNA寡核苷酸單鏈釋放出自由堿基，引起DNA鏈斷裂和脫堿基位點，羥自由基引起DNA鏈斷裂導致熒光共振能量轉移現象消失，金納米粒子猝滅熒光素的熒光隨之得到恢復，實現羥基自由基的測定。熒光探針表現出良好的選擇性，體內存在的其它種類的活性氧及體內存在的谷胱甘肽不對檢測造成干擾。
2、本發明熒光探針對羥基自由基的檢測范圍為8.0×10-9-1.0×10-6mol/L，可以檢測納摩爾濃度的細胞內羥基自由基。激光共聚焦顯微鏡成像實驗證明探針分子能夠穿透細胞膜進入細胞內部捕獲羥基自由基，對細胞本身沒有毒副作用，并且能夠對細胞內納摩爾級的羥基自由基含量變化進行檢測。
3、本發明熒光探針選擇金納米粒子作為熒光共振能量轉移的受體，在紫外光區及可見光區具有寬譜吸收，可以有效避免細胞自發熒光的干擾，提高檢測方法的選擇性和靈敏度，減少對生命體的損傷，有利于活體檢測。


圖1是本發明的熒光探針與不同濃度的羥基自由基作用后體系的發射譜圖，譜圖中包含羥基自由基的清除劑二甲基亞砜用來進一步證實探針的實用性，橫坐標為波長(Wavelength/nm)，縱坐標為熒光強度(Counts)；圖2是本發明的熒光探針與羥基自由基作用后體系的熒光強度與反應時間的關系，橫坐標為時間(Time)，縱坐標為相對熒光強度(Counts)；
圖3是本發明的熒光探針對比羥基自由基(·OH)與過氧化氫(H2O2)，過氧亞硝基陰離子(ONOO)，超氧陰離子自由基(O2-.)，單線態氧(1O2)，谷胱甘肽(GSH)，次氯酸鈉(NaClO)，一氧化氮自由基(NO·)，脂過氧自由基(ROO·)的熒光響應，橫坐標為各種自由基及生物化合物，縱坐標為對應的熒光強度(Counts)；圖4是本發明的熒光探針研究小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)的激光共聚焦顯微成像；圖5是熒光探針工作原理圖。
探針對羥基自由基的選擇性對比了探針對羥基自由基及其它自由基和生物化合物的熒光響應。終濃度1umol/L的過氧化氫，過氧亞硝基陰離子，超氧陰離子自由基，單線態氧，谷胱甘肽，次氯酸鈉，一氧化氮自由基，脂過氧自由基加到含有探針pH＝7.4的磷酸緩沖溶液中，探針激發波長為490nm，發射波長為520nm，測試結果顯示于圖3中。從圖中可以看到，化合物對羥基自由基具有很高的靈敏度，羥基自由基的加入產生相對強的熒光信號，而其它種類的活性氧熒光背景干擾極低，顯示了探針對于羥基自由基的良好選擇性。
細胞培養RAW 264.7細胞由高糖DMEM培養液培養，成像前，細胞貼壁于蓋波片上，一部分細胞用刺激劑佛波脂(2ng/ml)刺激30分鐘或1小時，未刺激的細胞作為空白，然后加入探針緩沖液，37℃中孵育30分鐘，進行激光共聚焦顯微成像。
激光共聚焦成像從圖3可以看出，未經刺激劑佛波脂刺激的巨噬細胞內部含有的的量微乎其微，難以進行熒光顯像(圖4a)，經過探針孵育的巨噬細胞經過佛波脂分別刺激30分鐘和1小時后發出強烈的熒光(圖4b和圖4c)，表明細胞內刺激生成的羥基自由基切斷DNA單鏈導致熒光共振能量轉移現象消失，熒光素熒光信號恢復。圖4d為亮場下的細胞圖像。
具體實施例方式
實施例1探針的合成
式中AGGGTTAGGGDNA寡核苷酸鏈單鏈，任意堿基序列，堿基個數為2-30個；熒光素X1，X2＝F，Cl，CH3，OCH3；SH巰基金納米粒子直徑為3-32nm。
a.取重量濃度為0.01％的氯金酸溶液150.0mL于250mL的錐形瓶中，加熱回流，攪拌下加入重量濃度為2.0％的檸檬酸三鈉溶液5.0mL，繼續回流20分鐘，在室溫下放置冷卻，得到深紅色金納米粒子溶液；透射電子顯微鏡結果顯示，粒子的平均粒徑為15.5nm，按完全反應估算，粒子濃度為1.2×1015/L。
b.將金納米粒子溶液與5’端修飾熒光素3’端修飾巰基的DNA單鏈按照1∶200物質的量配比混勻，室溫下放置24小時，再用磷酸緩沖液調pH＝7.0；然后將經調pH值的混合液與物質的量濃度為5mol/L的氯化鈉溶液按1∶0.1體積份配比混勻，室溫下放置45小時；最后經離心，除去上層清液，沉淀溶解于物質的量濃度為0.1mol/L的磷酸緩沖溶液中，得熒光探針溶液。
實施例2a.取重量濃度為0.02％的氯金酸溶液150.0mL于250mL的錐形瓶中，加熱回流，攪拌下加入重量濃度為1.0％的檸檬酸三鈉溶液7.0mL，繼續回流10分鐘，在室溫下放置冷卻，得到深紅色金納米粒子溶液；透射電子顯微鏡結果顯示，粒子的平均粒徑為15.9nm，按完全反應估算，粒子濃度為1.2×1015/L。
b.將金納米粒子溶液與5’端修飾熒光素3’端修飾巰基的DNA單鏈按照1∶500物質的量配比混勻，室溫下放置12小時，再用磷酸緩沖液調pH＝7.8；然后將經調pH值的混合液與物質的量濃度為0.5mol/L的氯化鈉溶液按1∶0.3體積份配比混勻，室溫下放置35小時；最后經離心，除去上層清液，沉淀溶解于物質的量濃度為0.3mol/L的磷酸緩沖溶液中，得熒光探針溶液。
實施例3a.取重量濃度為0.015％的氯金酸溶液150.0mL于250mL的錐形瓶中，加熱回流，攪拌下加入重量濃度為1.5％的檸檬酸三鈉溶液6.0mL，繼續回流15分鐘，在室溫下放置冷卻，得到深紅色金納米粒子溶液；透射電子顯微鏡結果顯示，粒子的平均粒徑為15.7nm，按完全反應估算，粒子濃度為1.2×1015/L。
b.將金納米粒子溶液與5’端修飾熒光素3’端修飾巰基的DNA單鏈按照1∶350物質的量配比混勻，室溫下放置18小時，再用磷酸緩沖液調pH＝7.5；然后將經調pH值的混合液與物質的量濃度為3mol/L的氯化鈉溶液按1∶0.2體積份配比混勻，室溫下放置40小時；最后經離心，除去上層清液，沉淀溶解于物質的量濃度為0.2mol/L的磷酸緩沖溶液中，得熒光探針溶液。
權利要求
1.檢測細胞羥基自由基的熒光探針，其特征在于該熒光探針具有如下結構式 式中AGGGTTAGGGDNA寡核苷酸鏈單鏈，任意堿基序列，堿基個數為2-30個；熒光素X1，X2＝F，Cl，CH3，OCH3；金納米粒子直徑為3-32nm。
2.檢測細胞羥基自由基的熒光探針的合成方法，其特征在于該方法按如下步驟進行a.取重量濃度為0.01-0.02％的氯金酸溶液150.0體積份加熱回流，攪拌下加入重量濃度為1.0-2.0％的檸檬酸三鈉溶液5.0-7.0體積份，繼續回流10-20分鐘，室溫下放置冷卻，得金納米粒子溶液；b.將金納米粒子溶液與5’端修飾熒光素3’端修飾巰基的DNA單鏈按照1∶200-500物質的量配比混勻，室溫下放置12-24小時，再用磷酸緩沖液調pH＝7.0-7.8；然后將經調pH值的混合液與物質的量濃度為0.5-5mol/L的氯化鈉溶液按1∶0.1-0.3體積份配比混勻，室溫下放置35-45小時；最后經離心，除去上層清液，沉淀溶解于物質的量濃度為0.1-0.3mol/L的磷酸緩沖溶液中，得熒光探針溶液。
3.權利要求1的檢測細胞羥基自由基的熒光探針的用途，其特征在于將所述的熒光探針用于化學體系、化學模擬生物體系中羥基自由基的檢測，生物活細胞和活組織內的羥基自由基的熒光成像檢測，以及臨床醫學上病變組織中羥基自由基的檢測。
全文摘要
本發明提供一種檢測細胞羥基自由基的熒光探針及合成方法和用途，該方法按如下步驟進行a.取重量濃度為氯金酸溶液150.0體積份加熱回流，攪拌下加入檸檬酸三鈉溶液5.0－7.0體積份，繼續回流10－20分鐘，室溫下放置冷卻，得金納米粒子溶液；b.將金納米粒子溶液與5′端修飾熒光素3′端修飾巰基的DNA單鏈按照1∶200－500物質的量配比混勻，室溫下放置1224小時，再用磷酸緩沖液調pH；然后將經調pH值的混合液與物質的量濃度為0.5－5mol/L的氯化鈉溶液按照1∶0.1－0.3體積份配比混勻，室溫下放置35－45小時；最后經離心，除去上層清液，沉淀溶解于物質的量濃度為0.1－0.3mol/L的磷酸緩沖溶液中，得熒光探針溶液。
文檔編號G01N33/53GK101021537SQ200710013008
公開日2007年8月22日 申請日期2007年1月4日 優先權日2007年1月4日
發明者唐波, 張寧, 徐克花, 禚林海, 陳蓁蓁 申請人:山東師范大學