專利名稱：一種調控蘋果實生樹階段轉變的方法
技術領域：
本發明涉及一種調控蘋果實生樹階段轉變的方法，具體涉及一種利用生理標記輔助調控 蘋果實生樹階段轉變的方法。
技術背景果樹實生樹從播種到結果需要幾年甚至十幾年時間，這是提高果樹育種工作效率的技術 瓶頸。果樹等木本被子植物的個體發育過程分為童期、成年營養生長期和生殖生長期。實生 樹表現童性，不具備成花能力的發育階段稱為童期；實生樹雖然具備了成花潛能，但在自然 條件下不能成花，接受某種誘導后可以成花，而且之后即使不再實施這種誘導也能連續成花 的發育階段稱為成年營養生長期；而實生樹在自然條件下連續開花結果的階段稱為生殖生長 期。為提高果樹育種效率，將實生樹從播種到自然條件下連續開花結果所需的時間縮到最 短， 一直是果樹育種工作者追求的目標。蘋果、桃等多年生木本果樹的育種理論上，要縮短 實生樹開花結果所需的時間，前期需要采取促進營養生長的技術措施，使其快速通過童期， 而實生樹進入成年營養生長期之后則應采取抑制營養生長的技術措施，以降低成花節位，提 早開花結果，從而縮短育種周期。縮短成年營養生長期是指通過采取有效措施降低實生樹成花節位。目前還沒有專用的降 低果樹實生樹成花節位的方法，實踐中一般采用與促花有關的技術措施，包括低溫、生長調 節劑、嫁接、扦插、環剝、環割、絞縊、限根、斷根等等。這方面的研究報道很多，許多促 花的技術可以顯著提高果樹實生樹成花率，但并非所有促花措施都能有效地降低實生樹的成 花節位。育種實踐中成年營養生長期從何時何處起始，到何時何處結束至今尚不清楚，限制了育 種效率的提高。因此，準確確定實生樹童性的消失，進入成年營養生長期的臨界點，對于提 高果樹育種效率十分重要，而且，即使找到了某實生樹在某特定條件下成年營養生長期的起 始的臨界節位，其在不同雜交組合、不同自然條件下也不能通用，所以，只有找到合適的生 理生化標記輔助，適時對實生樹采取適宜的調控措施，才能達到上述目的。關于蘋果及其他木本植物階段轉變的生理標記尚無相關專利，相關論文報道如下甜櫻桃組培苗中有一種28千道爾頓蛋白質可做童性標記，童期高于成年期[1'2'3]。這種蛋白質在蘋 果等植物上也有，也是組培苗返童和生根能力的標記。但關于實生樹階段轉變的調控技術尚 無相關專利報道。 發明內容本發明提供一種調控蘋果實生樹階段轉變的方法，該方法縮短實生樹開花結果所需的時 間，實生樹進入成年營養生長期之后抑制營養生長，以降低成花節位，提早開花結果，從而 縮短育種周期。為實現上述目的，本發明是采用以下技術方案來實現的一種調控蘋果實生樹階段轉變的方法，連續測定不同節位采樣中所含多酚中的根皮苷、 楊梅苷、咖啡酸的含量，對其進行分析，確定實生樹階段轉變開始與結束的臨界點，對實生 樹采取調控措施，其具體步驟如下1) 采樣① 蘋果實生幼樹于春季從根頸部選留1個萌蘗，8-9月份采樣時，剪取此選留萌蘗，再從 樹干中部剪取1個旺盛生長的基部節位與選留萌蘗的梢端節位重疊5-10節的新梢；從實生樹 的基部起隨節位升高，每5節為1采樣單元，取30株實生樹，分別取其相同節位采樣單元混 合，重復1次；② 自來水清洗所述采樣單元后分別取葉片、芽、韌皮部，用紗布包好投入液氮中待測；2) 采用高效液相色譜法分別測定采樣葉片、芽、韌皮部中的根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的 含量，利用外標法定性，采用高效液相色譜條件色譜柱為C18反相柱，柱溫3(TC，流動相 中的水、冰乙酸、甲醇的體積比為52: 5: 43，流速0.7毫升/分，紫外檢測器，檢測波長280納米，所述根皮苷、楊梅苷、咖啡酸標樣購自Sigma公司，乙酸、丙酮為國產分析純， 甲醇為國產色譜純，水為雙蒸水。3) 實生樹階段轉變的確定根據上述不同節位采樣中根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的連續測定結果進行分析，① 從基部向上，如果某節位芽采樣中開始檢測到了根皮苷，或者韌皮部采樣中檢測不到 咖啡酸，即可判定為實生樹在該節位開始階段轉變，進入成年營養生長期，即可實施實生樹 階段轉變調控② 如果從某節位開始韌皮部采樣中檢測不到楊梅苷，或者葉片采樣中檢測不到咖啡酸， 則可以判定為實生樹在該節位完成階段轉變，進入生殖生長期。4) 實生樹階段轉變的調控蘋果實生樹階段轉變開始，進入了成年營養生長期，并且在處于成年營養生長期節位內具有側生分枝，實施階段轉變調控，調控措施為下一年的6月中旬-7月中旬整株噴施2-3次 植物生長調節劑，所述植物生長調節劑可選用40-60毫克/千克水的6-卞氨基腺嘌呤和 800-1200毫克/千克水的乙烯利或整株噴施2-3次0.5-1.5毫克/千克水的激動素和200-300毫克 /千克水的烯效唑，前后2次噴施間隔5-10天。 本發明具有以下優點(1) 本發明采用實生樹生理生化指標分析的取樣方法，用實生樹基生萌蘗與旺盛新梢接 力的辦法實現整株所有節位連續取樣；30株實生樹相同節位混合采樣，消除實生樹基因型間 的差異；5節為1個采樣單位，既消除取樣誤差，又減少工作量。(2) 本發明在不同節位連續取樣的基礎上，分析生理生化指標隨節位升高的動態變化， 確定成年營養生長期開始和結束的臨界點，用多種生長調節劑組合同時對實生樹進行促花處 理，調査最低始花節位，使所得結果更準確、更可靠。(3) 利用本發明所提供的方法，蘋果實生樹接受調控提前完成階段轉變，翌年可以在階 段轉變開始的節位之上，階段轉變結束節位之下大量開花結果。如果不實施調控處理，開花 結果的節位不低于階段轉變結束的節位。(4) 本發明與常規技術相比，蘋果實生樹播種后第2年通過童期，第4年實施階段轉變 調控，第5年開花結果，第7年完成雜種初選；較常規技術提早3年，節省育種成本30%。


圖1是采樣中所含根皮苷含量隨節位上升的動態變化圖； 圖2是采樣中所含楊梅苷含量隨節位上升的動態變化圖； 圖3是采樣中所含咖啡酸含量隨節位上升的動態變化圖。
具體實施方式
一種調控蘋果實生樹階段轉變的方法，根據不同節位采樣中所含多酚中的根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的含量，連續測定對其進行分析，確定實生樹階段轉變開始與結束的臨界點，對實生樹采取調控措施，其具體步驟如下實施例11)采樣①昌黎果樹所于2003年采樣監測2年生金冠自然實生群體，9月中旬采樣測定，剪取選 留萌蘗，再從樹干中部剪取1個旺盛生長的基部節位與選留萌蘗的梢端節位重疊IO節的新梢； 從實生樹的基部起隨節位升高，每5節為1采樣單元，每選取30株實生樹，分別取其相同節位采樣單元混合，重復1次共選取60株；②自來水清洗所述采樣單元后分別取葉片、芽、韌皮部，用紗布包好投入液氮中待測；2) 測定采樣葉片、芽、韌皮部中的多酚中的根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的含量，利用外標法定性，采用高效液相色譜的條件色譜柱C18反相柱，柱溫3(TC,流動相中的水、冰乙酸、甲醇的 體積比為52: 5: 43，流速0.7毫升/分，紫外檢測器，檢測波長280納米，所述根皮苷、楊 梅苷、咖啡酸標樣購自Sigma公司，乙酸、丙酮為國產分析純，甲醇為國產色譜純，水為雙 蒸水。其步驟如下-① 冷凍采樣經冷凍干燥機干燥24小時，研成細粉，過40目篩；② 稱取100毫克細樣粉，加入5毫升石油醚，3(TC提取24小時，8000轉/分離心10分 鐘，棄上清液，沉淀中加入5毫升石油醚洗滌一次，以8000轉/分離心10分鐘；沉淀在30°C 避光條件下揮發去石油醚，加入2毫升體積百分比濃度80%的丙酮，超聲波處理30分鐘，以 8000轉/分離心IO分鐘;③ 取②所得上清液500微升，離心干燥機中干燥1小時45分鐘，加入500微升純甲醇， 渦旋溶解，12000轉/分離心10分鐘；④ 取③所得上清液200微升，加入800微升流動相稀釋，過0.45微米的濾膜，-20"冰箱 中冷凍保存，取10微升用高效液相色譜測定根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的含量。3) 實生樹階段轉變的確定根據圖l、圖2、圖3連續測定的結果進行分析，實生樹76-80節及以上節位芽樣品中檢 測到了根皮苷，并且韌皮部樣品中檢測不到咖啡酸，因此判定為實生樹在76-80節開始階段 轉變，進入成年營養生長期。實生樹120節完成階段轉變，進入生殖生長期。4) 階段轉變的調控2004年6月25日、7月5日和7月15日分3次整株噴施0.5毫克/千克水的激動素(KT30) 和300毫克/千克水的烯效唑。 實施例2步驟1)——3)同實施例1，其中，從樹干中部剪取的新梢與選留萌蘗的梢端節位重疊6節；4)階段轉變的調控2004年6月28日、7月3日和7月8日分3次整株噴施1毫克/千克水的激動素(KT30)和250毫克/千克水的烯效唑。 實施例3步驟1)——3)同實施例1其中，從樹干中部剪取的新梢與選留萌蘗的梢端節位重疊8節；4)實生樹階段轉變的調控2004年6月28日、7月8日分2次整株噴施1.5毫克/千克水的激動素(KT30)和200 毫克/千克水的烯效唑。實施例41) 采樣① 昌黎果樹所于2004年采樣監測2年生金冠自然實生群體，8月中旬采樣測定，剪取選 留萌蘗，再從樹干中部剪取1個旺盛生長的基部節位與選留萌蘗的梢端節位重疊5節的新梢； 從實生樹的基部起隨節位升高，每5節為1釆樣單元，每選取30株實生樹，分別取其相同節 位采樣單元混合，重復1次共選取60株；② 自來水清洗所述采樣單元后分別取葉片、芽、韌皮部，用紗布包好投入液氮中待測；2) 測定采樣葉片、芽、韌皮部中的多酚中的根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的含量，利用外標法定性， 采用高效液相色譜的條件同實施例1。3) 實生樹階段轉變的確定根據上述不同節位采樣中根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的連續測定結果進行分析，① 從基部向上，如果某節位芽采樣中開始檢測到了根皮苷，即可判定為實生樹在該節位 開始階段轉變，進入成年營養生長期，即可實施實生樹階段轉變調控② 如果從某節位開始韌皮部采樣中檢測不到楊梅苷，則可以判定為實生樹在該節位完成 階段轉變，進入生殖生長期。4) 實生樹階段轉變的調控-2005年6月28日、7月8日分2次整株噴施40毫克/千克水的6-卞氨基腺嘌呤和1200 毫克/千克水的乙烯利。 實施例5步驟l)——2)同實施例4，其中，從樹干中部剪取的新梢與選留萌蘗的梢端節位重疊5節；3)實生樹階段轉變的確定根據上述不同節位采樣中根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的連續測定結果進行分析，① 從基部向上，如果某節位韌皮部采樣中檢測不到咖啡酸，即可判定為實生樹在該節位 開始階段轉變，進入成年營養生長期，即可實施實生樹階段轉變調控② 如果從某節位開始葉片采樣中檢測不到咖啡酸，則可以判定為實生樹在該節位完成階 段轉變，進入生殖生長期。4)實生樹階段轉變的調控2005年6月25日、7月4日禾B7月10日分3次整株噴施60毫克/千克水的6-卞氨基腺 嘌呤和800毫克/千克水的乙烯利。 實施例6步驟l)——2)同實施例4，其中，從樹干中部剪取的新梢與選留萌蘗的梢端節位重疊9節3) 實生樹階段轉變的確定根據上述不同節位采樣中根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的連續測定結果進行分析，① 從基部向上，如果某節位芽采樣中開始檢測到了根皮苷，即可判定為實生樹在該節位 開始階段轉變，進入成年營養生長期，即可實施實生樹階段轉變調控② 如果從某節位開始葉片采樣中檢測不到咖啡酸，則可以判定為實生樹在該節位完成階 段轉變，進入生殖生長期。4) 實生樹階段轉變的調控2005年6月25日、7月4日分2次整株噴施50毫克/千克水的6-卞氨基腺嘌呤和1000 毫克/千克水的乙烯利。lj Hammatt， N.， Molecular and genetic regulation of juvenility and adventitious rooting, NERC Tree Biotechnology Liaison Group Newsletter, 1992Besford， R.T" Hand, P" Peppitt， S.D.， Richardson, C.M. and Thomas, B.， Phase change in /Vwwm arv/謂differences between juvenile and mature shoots identified by 2-dimensional protein separation and / vifra translation of mRNA. J. Plant Physi. 1996， 147: 534-538.3Hand, P" Besford, R.T" Richardson, C.M.， and Peppitt， S.D., Antibodies to phase related proteins in juvenile and mature尸n/w w "v/歸.Plant Growth Regulation. 1996， 20: 25-29
權利要求
1. 一種調控蘋果實生樹階段轉變的方法，其特征在于，連續測定不同節位采樣中所含多酚中的根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的含量，對其進行分析，確定實生樹階段轉變開始與結束的臨界點，對實生樹采取調控措施，其具體步驟如下1)采樣①蘋果實生幼樹于春季從根頸部選留1個萌蘗，8-9月份采樣時，剪取此選留萌蘗，再從樹干中部剪取1個旺盛生長的基部節位與選留萌蘗的梢端節位重疊5-10節的新梢；從實生樹的基部起隨節位升高，每5節為1采樣單元，取30株實生樹，分別取其相同節位采樣單元混合，重復1次；②自來水清洗所述采樣單元后分別取葉片、芽、韌皮部，用紗布包好投入液氮中待測；2)采用高效液相色譜法分別測定采樣葉片、芽、韌皮部中的根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的含量；3)實生樹階段轉變的確定根據上述不同節位采樣中根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的連續測定結果進行分析，①從基部向上，如果某節位芽采樣中開始檢測到了根皮苷，或者韌皮部采樣中檢測不到咖啡酸，即可判定為實生樹在該節位開始階段轉變，進入成年營養生長期；②如果從某節位開始韌皮部采樣中檢測不到楊梅苷，或者葉片采樣中檢測不到咖啡酸，則可以判定為實生樹在該節位完成階段轉變，進入生殖生長期；4)實生樹階段轉變的調控蘋果實生樹階段轉變開始，進入了成年營養生長期，并且在處于成年營養生長期節位內具有側生分枝，實施階段轉變調控，調控措施為下一年的6月中旬-7月中旬整株噴施2-3次植物生長調節劑，前后2次噴施間隔5-10天。
全文摘要
本發明涉及一種調控蘋果實生樹階段轉變的方法，連續測定不同節位的采樣中所含多酚中的根皮苷、楊梅苷、咖啡酸的含量，對其進行分析，確定實生樹階段轉變開始與結束的臨界點，對實生樹采取調控措施，抑制營養生長，以降低成花節位，提早開花結果，從而縮短育種周期。蘋果實生樹播種后第2年通過童期，第4年實施階段轉變調控，第5年開花結果，第7年完成雜種初選，較常規技術提早3年，節省育種成本30％。
文檔編號G01N30/02GK101228837SQ200710002558
公開日2008年7月30日 申請日期2007年1月26日 優先權日2007年1月26日
發明者常瑞豐, 張新忠, 李春敏, 王廣鵬, 趙永波, 陳東玫 申請人:河北省農林科學院昌黎果樹研究所