專利名稱：測定硫酸軟骨素的組合物及測定方法
技術領域：
本發明涉及一種測定硫酸軟骨素的組合物及測定方法。具體地說，涉及一種測定硫酸軟骨素、及以硫酸軟骨素為原料的制劑中硫酸軟骨素含量的組合物及測定方法。
硫酸軟骨素(chondroitin sulfate CS)是由動物喉骨、鼻中骨、氣管等軟骨組織中提取制備的粘多糖類藥物。近年來，硫酸軟骨素作為一種新型藥用活性成分，在醫藥制劑、醫學材料、日化產品(化妝品、生發劑)、保健品等領域的廣泛運用越來越引起人們的重視。硫酸軟骨素溶解于水，為一種具粘性的無色透明液體。硫酸軟骨素含量的測定方法現有技術中主要有高效液相色譜法和分光光度法(中華人民共和國衛生部藥典委員會。中華人民共和國衛生部藥品標準(二部)第六冊(生化藥品第一分冊)。1998138-139.)，這些方法均須經水解、衍生等反應后再定量測定，操作繁鎖，靈敏度也不高。
本發明的目的是提供能夠克服上述現有技術的弊端，且具有高靈敏、選擇性強，操作簡便、快速、結果準確的測定硫酸軟骨素的組合物及測定方法。
本發明的技術方案是采用萘基二苯甲烷類染料作顯色劑，在磷酸一磷酸二氫鹽緩沖介質中，非離子表面活性劑作穩定劑，分光光度法測定樣本中硫酸軟骨素的含量。
本發明的目的是這樣實現的1.測定硫酸軟骨素的組合物制備稱取萘基二苯甲烷類染料精制品(熱水精制，80℃烘干、恒重)0.100克于1升燒杯中，加水600毫升，加磷酸二氫鉀(A.R)27.2克，移入磷酸(A.R)8.0毫升，加非離子表面活性劑0.4克，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌4小時后，轉入1升量瓶中，用蒸溜水稀釋至刻度，搖勻。
2.硫酸軟骨素的測定方法(1).樣品溶液的配制準確稱取試樣(105℃，2小時烘干，恒重。)0.200克于250ml燒杯中，加入蒸餾水300ml，試樣經攪拌溶解后轉入500ml量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。再將上述溶液稀釋10倍后備用。
(2).硫酸軟骨素含量的測定用5.00ml的胖肚移液管移取測定硫酸軟骨素的組合物于50ml量瓶中，搖勻。加入蒸餾水20ml和上述配制的樣品溶液10.00ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。5分鐘后，1cm皿，試劑空白作參比，570nm處測定溶液的吸光度。
實現本發明目的進一步描述本方法的原理是利用硫酸軟骨素雙糖結構單元上硫酸酯陰離子基團與萘基二苯甲烷類陽離子染料在酸性介質中發生締合反應生成締合物。萘基二苯甲烷類染料在酸性介質中呈黃綠色，萘基二苯甲烷類染料與硫酸軟骨素的締合物呈藍紫色。試劑空白作參比，各締合物吸收峰波長570～580nm。
水溶液的酸度對硫酸軟骨素雙糖結構上的羧基和硫酸酯基團離解平衡產生影響，對試樣中可能存在的共存物離解平衡及萘基二苯甲烷類染料色光產生影響。試驗了介質酸度對萘基二苯甲烷類染料與硫酸軟骨素締合反應的影響。同時，對萘基二苯甲烷類染料與鹽酸氨基葡萄糖、D-葡萄糖酸鈉、牛血清白蛋白的締合情況進行了考察。實驗結果在堿性和中性介質中締合物與萘基二苯甲烷類染料的吸收光譜差異不大；在酸性水溶液中萘基二苯甲烷類染料呈黃綠色，而萘基二苯甲烷類染料與硫酸軟骨素締合物呈藍紫色。鹽酸氨基葡糖和D-葡萄糖酸鈉對萘基二苯甲烷類染料的吸收光譜不產生影響。高濃度牛血清白蛋白(Albumin，Bovine，簡稱AB)與萘基二苯甲烷類染料有輕微的締合作用。
離子型顯色劑和硫酸軟骨素均溶于水，而締合物的水溶性則大大降低，締合物緩慢朝玻璃器皿壁遷移吸附。為了增加締合物在水中的穩定性，對表面活性劑進行了選擇。非離子表面活性劑山梨醇酐脂肪酸酯，聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基酚醚均具有穩定作用，在組合物中加入非離子表面活性劑吸光度至少穩定半小時。
采用摩爾比法和連續變化法測定萘基二苯甲烷類染料和硫酸軟骨素的雙糖結構摩爾比，測定結果表明締合物的組成為2∶1。
按硫酸軟骨素的測定方法繪制工作曲線，回歸方程、相關系數和線性范圍分別為A＝0.0933C(ug/ml)-0.002(r＝0.9999，0.0～4.0ug/ml)。
締合物吸光系數達93.3L·g-1·cm-1是標準方法的9倍。
3ug/ml硫酸軟骨素溶液的吸光度，相對誤差小于±5％，允許共存物的濃度(ug/ml)K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、NO3-、SO42-、H2PO4-、NH4+、Fe3+、Cl-、Br-、Ac-、鹽酸氨基葡糖、D-葡萄糖酸鈉(100上限未做)；F-(10)；I-(10)牛血清白蛋白(2)。由此可以看出，共存物對測定結果不產生影響。
運用本發明對來樣進行了測定(n＝3)。用標準加入法在試樣(配置0.100g/500ml儲備液)中加入硫酸軟素標樣(Sigma)做回收試驗(n＝8)，測定結果列于表1。
表1樣品分析結果樣品 本法 標準法CS加入量測得總量 回收率 相對標準偏差(％) (％) (mg/500ml) (mg/500ml) (％) (％) (％)1 84.2 83.1 75.0157.9 98.3 1.72 83.0 82.3 50.0132.3 98.4 1.53 90.1 88.3 25.0115.4 101.22.2測定結果表明本發明提供的測定硫酸軟骨素的組合物及測定方法，具有高靈敏、選擇性強，操作簡便、快速、結果準確等優點。
權利要求
1.測定硫酸軟骨素的組合物，組合物組成包括萘基二苯甲烷類染料、磷酸、磷酸二氫鹽、非離子表面活性劑和水，其特征在于所述組成的重量百分比(W％)為萘基二苯甲烷類染料 0.005-0.04磷酸 0.10-4.0磷酸二氫鹽0.3-10非離子表面活性劑 0.002-0.02蒸餾水 余量
2.根據權利要求1所述的測定硫酸軟骨素的組合物，其特征還在于所述萘基二苯甲烷類染料為商品化堿性染料或試劑，可以列舉的有堿性艷藍BO(C.I.42595)、堿性艷藍B(C.I.44045)、堿性艷藍R(C.I.44040)和夜藍NB(C.I.44085)，經提純后使用。
3.根據權利要求1所述的測定硫酸軟骨素的組合物，其特征還于所述非離子表面活性劑為山梨醇酐脂肪酸酯，聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基酚醚中的一種或多種組合。
4.測定硫酸軟骨素的測定方法，其特征在于將組合物加入硫酸軟骨素的水溶液后，試劑空白作參比，分光光度法測定溶液的吸光度。
全文摘要
本發明涉及一種測定硫酸軟骨素的組合物及測定方法，組合物組成包括萘基二苯甲烷類染料、磷酸、磷酸二氫鹽、非離子表面活性劑和水，測定方法將組合物加入硫酸軟骨素水溶液中，試劑空白作參比，分光光度法測定溶液的吸光度。本發明的優點是無須對試樣進行水解等預處理，大大減化了操作步驟、靈敏度高(表觀吸光系數高達93.3L/g·cm)、操作簡便、快速、測定結果準確。
文檔編號G01N21/25GK1419119SQ0215124
公開日2003年5月21日 申請日期2002年12月12日 優先權日2002年12月12日
發明者施文健 申請人:施文健